La célula

La célula es la unidad estructural y funcional de vida. En ella se realizan todos los procesos que
hacen posible la constitución de las transformaciones vitales. Es una unidad que se repite en
todos los seres vivos. Consta de una serie de orgánulos que, con sus estructuras definidas, son
capaces de realizar complejas reacciones químicas que transforman energía en materia y
materia en energía: metabolismo celular.

Unidad anatómica fundamental de todos los organismos vivos, generalmente microscópica,

formada por citoplasma, uno o más núcleos y una membrana que la rodea.

Células eucariotas

Celula procariota

Métodos y Técnicas de Tinción

Por Quistián Hylary

La tinción es un proceso por el cual las moléculas de un colorante se absorben a una superficie. El uso de
colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste
con el medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente sin algún
tratamiento previo. De acuerdo a la reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:

· Simple: el colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.

· Diferencial: el colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre células bacterianas o entre
partes de una misma célula, estas técnicas utilizan más de un colorante o bien ciertos reactivos
complementarios para la tinción.

Los colorantes más usados son: azul de metileno, cristal violeta, safranina, estos son catiónicos y se
combinan fuertemente con componentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos
y los polisacáridos ácidos.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso conocido
como fijación. Después de esta habitualmente se realiza la tinción. La fijación produce generalmente
encogimiento de las células, la tinción por el contrario, hace que las células parezcan mayores de lo que
son realmente.

Algunos colorantes teñirán mejor solo después de que la célula haya sido tratada con otra sustancia
química, que no es un colorante por sí mismo. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo
altera de manera que ahora sí podrá atacar el colorante.

Tinción de Gram

1) Las células son fijadas por medio del calor sobre un portaobjetos, se tiñen primero con una
solución de cristal violeta y son lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este punto las
células Gram positivas y Gram negativas, están teñidas de azul/violeta.

2) El portaobjetos se cubre con una solución de yodo-yoduro potásico. El KI hace soluble el I2 en

agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. En este punto
las células se mantienen iguales.

3) Se inicia con la decoloración usando una solución de Alcohol-acetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-Cristal violeta. Algunos microorganismos no se decoloran. La diferencia esencial
entre los dos tipos de células es la resistencia que presentan ante la decoloración.

Después de la decoloración las células Gram positivas son azul\violeta, y las Gram negativas son
incoloras.

4) Para poner de manifiesto las células Gram Negativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es de color rojo, como la safranina.

Tinción ácido-alcohol resistencia

1) Se coloca sobre el portaobjetos una mezcla de fucsia-fenol, en la que la fucsia hace de colorante
rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido-alcohol-sensibles como las
resistentes.
2) Se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido-alcohol sensibles se decoloren
mientras que las acido-alcohol resistentes permanecen rosas.

3) Se utiliza un colorante de contraste, como el azul de metileno.

Tinción de Esporas

1) Sobre el portaobjetos con la preparación se coloca “verde malaquita” que tiñe las células de verde.

2) Se lava con agua destilada con lo que las células quedan incoloras y las esporas verdes.

3) Se usa safranina para obtener bacterias de color rojo/rosa mientras que las endoesporas continúan
verdes.

Por Ramírez Jessica

La tinción es un método sencillo para incrementar el contraste entre la célula y su entorno y por lo tanto
contribuye a mejorar la imagen observada. Las técnicas de tinción con diversos colorantes facilitan la
observación al aumentar notablemente el contraste. En Microbiología todas las tinciones se realizan a
partir de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis), secadas y fijadas. La
fijación, procedimiento que permite preservar estructuras celulares, se puede llevar a cabo con
diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación química. La fijación por calor es la más utilizada para
la observación de bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensión
bacteriana extendida y seca, a través de una llama de un mechero. La fijación por calor preserva la
morfología externa de los microorganismos pero no las estructuras internas. La fijación química con
agentes como etanol, formaldehido y ácido acético entre otros muchos, se utiliza para preservar las
estructuras celulares. Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tinción positiva es la más
frecuente, en ella un colorante se une aciertas estructuras microbianas. Todos los colorantes utilizados
en microbiología tienen en común la presencia de grupos cromóforos, grupos con dobles enlaces
conjugados que son los responsables del color mediante la unión a estructuras celulares por enlaces
iónicos, covalentes o hidrófobos, los que establecen enlaces iónicos son los más frecuentes. Entre los
colorantes que se unen por enlaces covalentes destaca el reactivo de Schiff, utilizado para la tinción de
DNA, donde el colorante se une a la desoxi-ribosa. Por otra parte, en la tinción negativa

se utilizan compuestos que no penetran en las células sino que impregnan el medio circundante. Los
microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.

OBSERVACIÓN “IN VIVO”

Método de la gota pendiente.

Este procedimiento es la forma más sencilla de observación de organismos vivos, nos proporciona
información sobre la morfología, tamaño, color y movilidad de las bacterias. Sin embargo, debido a la
falta de contraste con el entorno es una práctica que se utiliza únicamente para la observación del
movimiento.

Material necesario

Cultivos bacterianos de Escherichia coli y Pseudomonas sp.en medios de cultivo líquido (caldo triptona
soja), vaso lavador, portaobjetos excavado, cubreobjetos, asa de siembra, pipeta Pasteur, aceite de
inmersión.

Procedimiento
·Tomar una gota de un cultivo líquido reciente (24 horas) usando unasa de siembra o una pipeta Pasteur
estéril.

·Colocar en el centro de un cubreobjetos y añadir cuatro pequeñas gotas de aceite en los cuatro
extremos.

Colocar el portaobjetos excavado sobre el cubreobjetos, cuidando que la gota quede situada en el
centro de la depresión.

·Dar la vuelta al portaobjetos.

·Colocar una gota de aceite de inmersión y observar con objetivo de inmersión (100x).

Esta técnica permite observar el desplazamiento rápido y rectilíneo o dando giros y volteretas en
aquellas bacterias que tienen flagelos (Video complementario). Las bacterias inmóviles presentan un
movimiento vibratorio denominado movimiento browniano, debido al choque de las moléculas enuna
solución líquida.

Método de observación directa en contraste de fases o interferencia diferencial. En este caso la

suspensión de microorganismos se observa con un microscopio de contraste de fases o interferencia
diferencial (DIC) que permiten el aumento del contraste. El microscopio de contraste de fases utiliza un
condensador con un diafragma anular opaco con un anillo transparente que provocan variación de la
longitud de onda dependientes de la densidad y el índice de refracción de la muestra, se observan las
células más brillantes sobre un fondo oscuro. El microscopio de interferencia diferencial permite la
observación tridimensional de la muestra por la incorporación de prismas que generan haces de luz
polarizada que se cruzan, incrementando las diferencias entre los componentes celulares por lo que es
muy útil para la observación de esporas, inclusiones, filamentos septados o vainas entre otros.

Material necesario

Cultivos bacterianos en medio líquido, portaobjetos y cubreobjetos, pipetas Pasteur, aceite de

inmersión.

Procedimiento

Se deposita una gota de la muestras obre un cubreobjetosy se coloca encima un portaobjetos excavado.
La preparación se observa directamente al microscopio decontraste de fases o de DIC.Reduca (Biología).
Serie Microbiología.3 (5): 15-38, 2010ISSN: 1989-362018. Observación de Zooglea ramigeray bacterias
filamentosas. Microscopía de Interferencia diferencial (100x).Observación de Anabaenasp.,
cianobacteria filamentosa. Microscopía de contraste de fases (100x).

TINCIONES

Tinción negativa

No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con cromóforos, ni se
lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los colorantes. En este caso el frotis se hace
con una gota de una solución de nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles,
que formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción se prescinde de la fijación por calor, se
deja secar la preparación y se observan los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.

Tinción simple
La mayoría de los colorantes utilizados en las tinciones positivas son colorantes derivados de las anilinas,
sales orgánicas intensamente pigmentadas que proceden del alquitrán.

Se denominan colorantes básicos si el cromóforo (porción coloreada) de la molécula está cargada

positivamente, por ejemplo, cristal violeta y azul de metileno son colorantes básicos. Otros colorantes
de esta categoría utilizados con frecuencia en bacteriología son safranina, fuchina básica y verde
malaquita.

Bajo condiciones normales de crecimiento, la mayor parte de los procariotas tienen un pH interno
próxima la neutralidad (pH 7.0) y una superficie celular cargada negativamente, así los colorantes
básicos son los más eficaces.

Colorantes ácidos con rojo Congo, rosa de bengala, eosina y fuchina ácida tiene un cromóforo cargado
negativamente y son utilizados para teñir positivamente ciertos componentes como las proteínas.

Material necesario

Cultivos bacterianos de Staphylococcusaureus y Micrococcus luteus, frasco lavador, cristalizador,

soporte y colorantes (safranina y cristal violeta), asa de siembra, aceite de inmersión.

Procedimiento

·Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota

de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.

·Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el

asa de siembra. Dejar secar.

·Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.

·Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1 minuto.

·Lavar el exceso de colorante con agua.

·Dejar secar al aire.

·Añadir una gota de aceite de inmersión.

·Observar con objetivo de inmersión (100 x).

La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma, tamaño y tipo de
agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la ventaja de ser un método muy sencillo y
rápido.

TINCIÓN DIFERENCIAL

Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiología; consisten en la aplicación de dos

colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una respuesta
diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas células dentro de una población. La
diferenciación puede ser provocada por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de
respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales más utilizadas
en bacteriología son la tinción de gram y la tinción de ácido alcohol resistencia.
Tinción de Gram Esta tinción diferencial fue propuesta por el medico danés Christian
Gram(1884)(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos fallecidos por
neumonía observó que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en los pulmones, retenía el
colorante conocido como marrón Bismark(sustituido posteriormente por el cristal violeta),mientras que
el tejido pulmonar no era capaz de retener el colorante.

Es la tinción diferencial más utilizada de forma rutinaria y prácticamente la primera prueba a la que se
someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio. Proporciona una información esencial,
además de sobre la forma, tamaño y agrupación celular, como es el tipo y composición de la pared que
presentan las bacterias. La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos
grandes grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram negativa.

Material necesario

Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereusy.

Gram negativas: Escherichia coli, frasco lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos, asa de siembra,
cristal violeta, safranina, lugol y alcohol, aceite de inmersión.

Procedimiento

·Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de un cultivo bacteriano con el
asa de siembra estéril.

·Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar
secar.

·Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.

·Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto.

·Lavar el exceso de colorante con agua.

·Añadir el mordiente lugol, solución de yodo -ioduro potásico, durante 1 minuto.

·Lavar el exceso de mordiente con agua.

·Lavar la preparación con alcohol formando un ángulo con la preparación, durante 30 segundos (el
tiempo de decoloración es clave para un resultado correcto).

·Lavar inmediatamente con abundante agua.

·Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto.

·Lavar el exceso de colorante con agua.

·Dejar secar al aire.

·Añadir una gota de aceite de inmersión.

·Observar con objetivo de inmersión (100 x).

La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de organismos hace que
ambos grupos respondan de manera distinta, así mientras las bacterias Gram positivas mantienen y
conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias Gram negativas se decoloran rápidamente con la
aplicación del alcohol, admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre rosa y rojo
que contrasta con el intenso color violeta.

Se han propuesto diferentes explicaciones para justificar la respuesta de los microorganismos a esta
tinción, parece que la diferencia se debe tanto a la estructura física como a la composición de la pared
celular, en bacterias Gram positivas la gruesa capa de péptidoglucano con abundantes
entrecruzamientos parece contribuirá la retención del colorante fundamental, cristal violeta, mientras
que en bacterias Gram negativas la delgada capa de peptidoglucano junto con la abundancia de lípidos
en la membrana externa de la pared celular incrementan la porosidad y por ello, contribuyen a la
pérdida del colorante fundamental después de la decoloración con alcohol.

Tinción de ácido-alcohol resistencia

Se trata de un procedimiento de tinción diferencial, conocido como método de Ziehl-Neelsen, que tiene
gran relevancia por su aplicación clínica. Permite poder distinguir aquellos microorganismos cuya
coloración resiste la acción de alcoholes y ácidos suaves (ácido-alcohol resistentes) de otros que no
resisten la decoloración (no ácido-alcohol resistentes).

Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes patógenos:
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos responsables de la tuberculosis
y la lepra respectivamente.

Por Ramos Michelle

Tinción Simple

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad
(Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).

· El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH
digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre
los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.

· La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus),

sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un
halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las
preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

· En la imagen: Cryptococcus neoformans en una tinción con tinta china.

Tinción Diferencial

Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares se diferencian en función de los
diferentes colorantes que fijan de acuerdo con su propia constitución química.

Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen

En la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM

Tinción GRAM: Morfología Bacteriana

Ya hemos visto que la tinción de GRAM aporta dos ideas básicas para la deficinión "taxonómica" de las
bacterias: el color que adquieren tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas.

En lo relativo a la coloración, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de

microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de Gram
negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.

Formas básicas en que se puede visualizar la morfología bacteriana en una tinción GRAM:

Cocos

Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la división celular. Diplococos, aparecen por pares.
Estreptococoss, tienden a unirse formando cadenas. Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a
veces de gran tamaño

Bacilos

grandes variaciones morfológicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos

Espirales (Treponemas, Borrelias ...)

Utilizamos el término Pleomorfismo para referirnos a la adopción de diferentes formas en una misma
especie.

Por Rangel Hugo

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el contraste en la
imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en
biología y medicina para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda
de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la
definición y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido
conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes células sanguíneas) o incluso para
resaltar organelas dentro de células individuales.

En bioquímica, esto implica agregar un colorante específico (esto significa que se una de manera
selectiva ya sea a ADN, proteínas, lípidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar
la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tinción como el marcado fluorescente pueden
servir para los mismos propósitos.

Tinción de Gram

También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un proceso
denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de
Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base
de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas. Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias
fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la
tinción de Gram. Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de
cristal violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso
de colorante. En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están
eñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI).
El ingrediente activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El
yodo entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las
células gram positivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo
después de la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el
complejo yodo – cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la
resistencia a la decoloración. Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules,
pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una
coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina
básica. Después de la coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras que las
grampositivas permanecen azules.

Tinción negativa

Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea un cambio
el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la
tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está
en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Por Rascón Lizeth

Una tinción o coloración es una técnica auxiliar utilizada para mejorar el contraste en la imagen vista
al microscopio. Los colorantes son sustancias que usualmente se utilizan para aumentar la definición y
examinar poblaciones celulares.

Tipos de técnicas de tinción

Tinciones simples

Se usa un único colorante, que siempre es de tipo básico. Se utilizan solamente para incrementar el
contraste; todas las células absorberán el colorante y quedarán teñidas del mismo color. Se fija el
espécimen, se añade el colorante y se deja el tiempo adecuado para que se absorba, se retira el exceso
de colorante y la preparación ya está lista para ser observada.

Tinciones diferenciales

Se utilizan para distinguir entre tipos de microorganismos. La técnica de tinción diferencial consta de dos
etapas: una tinción simple seguida de una tinción de contraste. En la tinción de contraste se utiliza otro
colorante que tiñe (y por tanto, revela) las células no teñidas por el primer colorante. Estas tinciones son
muy utilizadas en microbiología.

Tinciones específicas

Se utilizan para incrementar el contraste en las células microbianas y revelan estructuras particulares,
entre las que se incluyen en los flagelos y las cápsulas.

Tinción adecuada

En su forma más simple, el verdadero proceso de tinción puede implicar la inmersión de la muestra en la
solución colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante y la
observación. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente. Cuando la solución de
colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tinción mordentada permanece.

Tinción negativa:

Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de cromofobia y que por lo
tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser
conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre
ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos.
Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados fácilmente por medio de microscopía en
campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea

Tinción indirecta:

Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es
el ácido tánico.

Tinción directa:

Hablamos de tinción directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro
tratamiento previo.

Tinción Gram:

La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes en el laboratorio bacteriológico.
Su utilidad en la práctica de referencias a la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos,
negativos, etc.) se basan justamente en la tinción de GRAM

1. Se tiñe el espécimen con el primer colorante, cristal violeta.

2. Se añade el mordiente, yodo.

3. Se aplica el agente decolorante, normalmente una solución de acetona o etanol. En este momento,
las bacterias Gram negativas pierden su tinción violeta, pero las Gram positivas retienen el colorante.

4. Como colorante de contraste se añade safranina, que tiñe de rosa las bacterias Gram negativas,
previamente decoloradas; mientras que a las bacterias Gram positivas les proporciona un color violeta
más intenso.

Una tinción ácido-alcohol resistente se realiza según los siguientes pasos:

1. Tinción primaria con fucsina básica, que tiñe todas las células de rojo.

2. Calentamiento suave de la preparación para facilitar la penetración del colorante en el interior de la

célula.

3. Decoloración con una solución de ácido clorhídrico en etanol. Este decolorante elimina la fucsina de
todas las células excepto de las micro bacterias, que la retienen debido a su superficie cérea.

4. Coloración de contraste con azul de metileno. Se tiñen de azul todas las células previamente
decoloradas, lo que facilita la diferenciación entre las células de Mycobacterum, aún teñidas de rojo, v
las células restantes del espécimen.

Tinción: RODAMINA-AURAMINA

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos
auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja
brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la
fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los
esporozoarios parásitos, se tiñen con estos colorantes.

Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser reteñidos
con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se
elimina antes el aceite de inmersión. De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados
con las coloraciones tradicionales, que además permiten la diferenciación morfológica.

Tinción: NARANJA DE ACRIDINA

El fluorocromo naranja de acridina se une al ácido nucleico ya sea en su forma nativa o desnaturalizada.
En algunas preparaciones de naranja de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo
del pH y de la concentración. El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una
fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si está muerto. De todos modos, como el
colorante se intercala en el ácido nucleico, el germen viable se inactivará poco tiempo después de la
tinción.

Colorantes:
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por los
materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas positivamente
(cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales
como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.

Azul de metileno: El azul de metileno se utiliza para teñir células animales, para hacer más visibles sus
núcleos. Es también utilizado para teñir los extendidos de sangre para ser utilizados en citología y como
colorante vital en el recuento de reticulocitos.

Azul Nilo: Tiñe los núcleos de color azul. También puede ser utilizado para teñir células vivas.
Cristal violeta: El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tiñe las paredes
celulares de color púrpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloración de Gram.

Eosina: La eosina se utiliza más frecuentemente como contra coloración de la hematoxilina, impartiendo
un color que va del rosado al rojo al material citoplasmático, membrana celular, y algunas estructuras
extracelulares. Además imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada
también en algunas variantes de la coloración de Gram, y en muchos otros protocolos de tinción.

Safranina: La safranina es un colorante nuclear. Colorea los núcleos celulares de rojo, y se utiliza
principalmente como contracoloración. También puede ser utilizada para darle una coloración amarilla
al colágeno.

Verde de metilo; El verde de metilo se utiliza frecuentemente en microscopia de campo claro, para teñir
la cromatina de las células y facilitar así su visualización.

Por Reyes Diego

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio
óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea, y el medio
más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes.

Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia de
determinados constituyentes celulares.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, proceso llamado
fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque también puede fijarse con
sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de la fijación, si se añade el
colorante, no se producen ulteriores cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza
habitualmente en células que han sido fijadas sobre un portaobjetos. Tratando después éste con el
agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción.

Conceptos básicos.

Tinción primaria: es el colorante principal que se va usar para teñir en un principio a las células.

Mordiente: es la sustancia que sirve para fijar los colorantes en la tinción.

Agente decolorante: es como su nombre lo indica, el agente que ayuda a decolorar una parte de
las células que se han teñido.

Tinción de contraste: es la sustancia que contra tiñe las células que han sido previamente
decoloradas y además le da un color diferente de la primera vez que se tiño.

Tinciones para microbiología.

Tinción de Gram.

Tinción de Ziehl-Neelsen

Tinción de Schaeffer-Fulton

Tinción de Conklin

Tinción de Grocott
 Tinción de Dieterle

Tinción negativa

Tinción con mucicarmina

Tinción simple.

Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad.

El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite ver elementos de hongos ya que el KOH
digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero no actúa sobre
los polisacáridos de las paredes celulares de los hongos.

La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (Cryptococcus), sobre
todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparece como un halo claro
alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en
fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.

Tinción de Gram

También puede utilizarse a menudo un método que no tiñe igualmente todas las células, un proceso
denominado tinción diferencial. La tinción de este tipo más extensamente utilizada es la tinción de
Gram, denominada así por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base
de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y
gramnegativas.

Debido a su importancia en taxonomía bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared

celular de las distintas bacterias, describiremos aquí con cierto detalle la tinción de Gram. Las células
fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal violeta (otros
colorantes básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante.

En este estado todas las células, tanto las gramnegativas como las grampositivas, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo (I2) – yoduro potásico (KI). El ingrediente
activo es aquí el yodo, el yoduro potásico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en
las células y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células
grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después de
la decoloración, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo –
cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos)
lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está, por lo tanto, en la resistencia a la
decoloración.

Después de la decoloración las células grampositivas son todavía azules, pero las gramnegativas son
incoloras. Para poner de manifiesto las células gramnegativas se utiliza una coloración de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la
coloración de contraste las células gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen
azules.

Tinción ácido – alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto
contenido en lípidos y en ácidos micólicos y que no pueden ser calificadas por la tinción de Gram. Para
empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina – fenol, en la que la fucsina hace de
colorante rosa y el fenol de mordiente. Las células se tiñen de rosa, tanto las ácido – alcohol sensibles
como las resistentes. Después se usa un decolorante orgánico que hace que las bacterias ácido – alcohol
sensibles se decoloren mientras que las ácido – alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tinción
de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tiñe las células
ácido – alcohol sensibles de color azul quedando las células ácido – alcohol resistentes de color rosa.

Tinción de esporas

Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas.

Sobre el portaobjetos con la preparación se echa verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se
lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde.
Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas
continúan con su color verde de la verde malaquita.

Tinción negativa

Es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sin teñir pero se colorea en cambio
el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las células. La sustancia utilizada para la
tinción negativa es un material opaco que no tiene afinidad con los constituyentes celulares y que
simplemente rodea las células, tal como la tinta china (que es una suspensión de partículas de carbono
coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo
satisfactorio de aumentar el contraste de las células en microscopia óptica, pero su máxima utilidad está
en revelar la presencia de cápsulas alrededor de las células bacterianas.

Por Rios Selene

Las tinciones se usan para tres cosas fundamentalmente:

· Descripción de microorganismos en base a su morfología, estructura y distribución.

· Detección de determinados microorganismos para diagnostico clínico, por ejemplo.

· Clasificación de microorganismos según sus características tintoriales.

Tipos de colorantes:

Ácidos:

· En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas positivamente y no

las células, que tienen carga negativa.

· Sales de Na. K, Ca, ión amonio, eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida...

Básicos:

· En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga negativa como las
células.

· Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde malaquita, fucsina fenicada o carbol-
fucsina.
Características de un cultivo para una buena tinción:

· Ha de estar en fase exponencial de crecimiento y no ser viejo.

· Debe haberse obtenido de un cultivo sólido, para tinciones simples puede ser necesario usar un
cultivo liquido.

Preparación de un frotis:

· Suspensión de una colonia de un cultivo puro en una gota de agua

· Extensión de la gota en un porta, con ayuda de otro porta, en la parte central del primero.

· Secado al aire.

· Fijación a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el porta por la llama
rápidamente.

Tipos de tinciones:

· Simples: se usa un solo colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, y se suplementan con
un mordiente para una mejor fijación del colorante además de aumentar el grosor de algunas
estructuras para su mejor visión. Sirven para ver la morfología y las agrupaciones que forman los
microorganismos entre ellos y con otras células.

· Diferenciales: Se usa mas de un colorante. Tiñe de diferente modo a las células de distintas
especies.

TINCIÓN DE GRAM

Es la más importante en bacteriología. Gracias a ella distinguimos dos tipos de bactrias:

§ Gram +. Son aquellas que se tiñen con cristal violeta (colorante primario)

§ Gram -. Son aquellas que se tiñen con safranina (colorante secundario)

Las gram + aparecerán violetas, y las gram – aparecerán rosas. Las diferencias entre + y – obedecen a la
estructura de su pared celular:

Las gram + tienen una pared muy gruesa que contiene muy pocos lípidos, mientras que lasgram – son
muy delgadas y contienen gran cantidad de lípidos.