PCR: Reacción en cadena de la polimerasa 

Gonzalo Greif.  
Unidad de Biología Molecular. Institut Pasteur Montevideo 
Índice: 

‐ Historia 
‐ La Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
‐ Algunos tips experimentales 
‐ Variantes de la PCR 
‐ Una variante especial: PCR en tiempo real 
 
1. Historia 

La  reacción  en  cadena  de  la  polimerasa  (PCR  por  sus  siglas  en  inglés:  Polymerase  chain  reaction)  fue 
concebida por el Dr. Kary Mullis (ver recuadro) a principios de la década del 80. Si bien se discute que en 
el  desarrollo  final  de  la  técnica  participaron  varios  investigadores  y  que  el  proceso  para  la  puesta  a 
punto de la técnica involucró varios años, hay un consenso que la idea original fue desarrollada por el 
Dr. Mullis, y por ello obtuvo el premio Nobel unos años más tarde. En el libro “Making PCR: a story of 
biotechnology”,  Paul  Rabinow  cuenta  en  detalle  los  acontecimientos  históricos  que  dieron  lugar  a  la 
invención de la técnica.

Según cuenta en su página web (www.karymullis.com), la primera idea surgió en la medianoche de un 
viernes en abril de 1983, conduciendo con su Honda gris entre Cloverdale y Boneville e imaginando la 
reacción.  La  historia  completa  se  encuentra 
contada  de  forma  muy  poética  en  su  página  Kary Mullis (1944‐). 
web.  
Kary Banks Mullis nació en 1944 en Lenoir, Carolina del 
Hasta  ese  momento  obtener  cantidad  Norte. Estudió en el Instituto de Tecnología de Georgia y 
suficiente  de  ADN  puro  para  realizar  en 1972 obtuvo un doctorado en bioquímica de la 
experimentos constituía la etapa limitante. La  Universidad de California, Berkeley. Luego de un 
aparición  de  las  enzimas  de  restricción  en  la  posdoctorado en la Universidad de San Francisco, se 
década del 70 y el desarrollo de la tecnología  incorporó a la Corporación Cetus como químico. En los 7 
del  ADN  recombinante  a  fines  de  los  70  años que estuvo allí (1979‐1986) trabajó en la síntesis de 
habían  hecho  posible  la  obtención  de  oligonucléotidos y desarrolló el concepto de la PCR. 
fragmentos precisos de ácidos nucleicos para 
ser  estudiados  en  detalle.  Sin  embargo,  la  En 1986 fue designado director de biología molecular en 
invención  de  la  reacción  en  cadena  de  la  Xytronyx Inc. en San Diego, donde continuó su trabajo en 
polimerasa  produjo  un  salto  tecnológico,  tecnologías de ADN y fotoquímica. 
permitiendo  a  los  investigadores  producir 
cantidades  ilimitadas  de  ADN  específico,  sin  En 1993 recibió el premio Nobel por su invención de la 
depender del clonado de fragmentos de ADN  reacción en cadena de la polimerasa. El proceso que 
en  organismos  vivos.  Por  otra  parte  la  PCR  Mullis conceptualizó en 1983, es uno de los principales 
mostró  tanta  versatilidad,  que  año  a  año  se  avances de la biología molecular del siglo XX.  
fueron  desarrollando  nuevas  aplicaciones  y 
variantes.  Hoy  es  una  herramienta  Actualmente es un Investigador en el Hospital de Niños e 
Insituto de Investigación en Oakland. Vive con su esposa, 
en Corona del Mar y en Anderson Valley, California. 

Fuente: www.karymullis.com
fundamen
ntal en cualqu
uier laboratorrio de biologíía molecular.   

en cadena de la polimerassa (PCR). 
2. Ell método de la Reacción e

La  PCR  es 

e una  técnicca  enzimáticca  in  vitro  utilizada  paraa  amplificar  exponencialm mente  una  rregión 
determinaada  de  ADN  situada  entre  dos  region nes  de  ADN, cuya  secuencia  se  conoce,  a  partir  dee  una 
mezcla co ompleja de áccidos nucleicos. Para ello  requiere: (i)  el molde a p partir del cuaal se generaráán las 
copias, (ii) dos oligonu
ucleótidos (ce ebadores o prrimers) especcíficos compleementarios a una porción de la 
ue  se  desea  amplificar, 
región  qu a (iii)  una  enzima  capaz  de  ssintetizar  ADN  utilizando  como  moldee  ADN 
(una  ADN N  polimerasaa)  o  ARN  (una  ADN  polimerasa  ARN N  dependien nte)  en  el  caaso  de  la  RTT‐PCR 
(retrotran
nscripción  segguida  de  PCR R)  y  (iv)  los  deoxinucleóti
d idos  (dNTPs)  que  serán  incorporados  a  las 
cadenas  nacientes 
n de  ADN  (Figuraa  1).  El  resulltado  de  la  rreacción  son  varios  millones  de  copiaas  del 
fragmento o de ADN commprendido en ntre los dos oligonucléotiddos específico os. 
 

 
Figura 1. D
Descripción del proceso de PC CR en los prime
eros 3 ciclos dee reacción (tom
mado de Lauraa Espinosa Asuaar, 
2004: Guíaa práctica sobre
e la técnica de PCR). 

 
Generalm mente, la reaccción de ampllificación de P PCR se descriibe en tres paasos caracterrísticos. La primera 
fase, denoominada “fasse lag”, en lo os primeros 5 5‐10 ciclos (deependiendo d de la cantidaad de molde  inicial 
presente  en  la  reacció
ón),  dónde  noo  se  produce en  todavía  loss  fragmentoss  específicos.  La  segunda,,  es  la 
“fase exponencial”, en n la  cual en  cada 
c ciclo se  duplican los  fragmentos  producidos een el  ciclo anterior 
(figura 1) y por último, la “fase plateeau”, en la cu ual no se prodduce más amplificación (Fiiguras 1,2). 

Ciclo Copias d
de ADN
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1024
11 2048
12 4096
13 8192
14 16384
15 32768
Figura 2. C
Cinética de la P
PCR. En la gráficca se muestran
n las diferentess fases del 
16 65536
PCR graficaando la cantidaad de ADN gen nerada en funcción de los cicloos de  17 131072
amplificación.  18 262144
  19 524288
20 1
1048576
bla  1  se  mue
En  la  tab ponencial  y  l a  duplicación
estra  la  ampllificación  exp n  del  21 2
2097152
fragmento o específico e en cada ciclo.. Partiendo de e una molécuula del fragmento,  22 4
4194304
23 8
8388608
al  cabo  de  30  ciclos  se
e  obtienen  en  N  del 
e teoría  1  biillón  de  molééculas  de  ADN
24 166777216
fragmento o  amplificado  (aunque  la  tabla  no  contempla  rrealmente  lo o  que  25 333554432
sucede  en 
e la  reacció ón,  permite  visualizar  el 
e poder  de  la  amplificaación  26 677108864
exponenccial).   27 1344217728
28 2688435456
  29 5366870912
Tabla 1. Amplificación exponenccial. La tabla in dica la cantidaad de 
30 10733741824
fraggmentos produucidos teóricam
mente en cada  ciclo, si se parrtiera 
  de uuna copia únicaa de ADN mold
de. 

 
En generaal cada ciclo d
de la reacción se divide en 3 partes (figuura 3): 

a.. Desnaturalización: en e esta etapa, el ADN molde  doble cadena se desnaturaliza y sus h hebras 

se separann. Esto se logrra aumentand do la temperratura de la reeacción, en general a 94oCC para 
asegurar  que 
q todas  lass  moléculas  se 
s encuentrann  en  simple  hebra  y  perm
mitir  que  ocu
urra  el 
segundo ppaso.  
b. Anillado o annealing: e en esta etapaa, la temperattura de la reaacción dismin nuye para peermitir 
que los oligonucleótido os cebadores que delimitaan el fragmento que se d desea amplificcar se 
 unan  a  su  región  blanco.  La  temperatura  de  unión  de  los  cebadores  dependerá  de  la 
composición de bases de los mismos (ver apartado: Cebadores). 
c. Extensión: en este paso, la temperatura de la reacción es aquella que permite la actividad 
óptima de la enzima polimerasa presente en la reacción (ver apartado: ADN Polimerasas). 

 
Cebadores:  ADN Polimerasas:
 
Los  cebadores  o  iniciadores  de  la  reacción  son  Las  ADN  polimerasas  son  enzimas  que 
  oligonucleótidos  cortos    (entre  18  y  30  intervienen  en  la  replicación  del  ADN.  Son 
nucleótidos),  complementarios  a  la  secuencia  capaces de adicionar dNTPS a partir de la región 
blanco  que  se  desea  amplificar.  Se  utilizan  dos  3’ de  un cebador  y  copiar  una  secuencia molde.  
cebadores  en  cada  reacción,  cada  uno  Las polimerasas sintetizan el ADN en la dirección 
complementario  a  uno  de  las  hebras  del  ADN  5'  a  3'.  Ninguna  ADN  polimerasa  conocida  es 
molde,  delimitando  la  región  que  se  desea  capaz  de  comenzar  una  nueva  cadena.  Ella  sólo 
amplificar. A modo de ejemplo:  puede  añadir  un  nucleótido  en  un  grupo  3'‐OH 
que ya existe. Por esta razón la enzima precisa un 
5´….AATCGTAGC………………………………………TACCGTCGAC…..3´
ATGGCAGCTG     5´ cebador  que  presente  un  grupo  3'  ‐OH  al  cual 
Reverso
Directo
5´ AATCGTAGC
puede  añadir  el  primer  nucleótido.  Las  ADN 
3´….TTAGCATCG……………………………………….ATGGCAGCTG..3´ polimerasas  requieren  Magnesio  como  cofactor 
 
para ser funcionales.  
De la secuencia de estos cebadores dependerá la 
especificidad de la reacción. ¿Veinte nucleótidos  En el desarrollo de la técnica, la enzima utilizada 
permiten  una  alta  especificidad?  Una  molécula  era  una  polimerasa  aislada  de  E.coli  (fragmento 
de  ADN  puede  contener  4  tipos  de  nucleótidos:  Klenow de la ADN polimerasa I), que presenta su 
A,  T,  C  o  G.  La  probabilidad  de  encontrar  cada  actividad óptima a 37 oC, y se inactiva a 94 oC, es 
uno  de  ellos  es  1/4=0,25,  entonces  la  por ello que en cada ciclo era necesario agregar 
probabilidad de encontrar una determinada de n  más  enzima.  Luego,  se  sustituyó  por  una 
bases  es  (0,25)n.  Un  cebador  de  20  bases,  tiene  polimerasa  termoestable  aislada  de  Thermus 
en  teoría  una  probabilidad  de  (0,25)20=9,9e‐13  aquaticus  (Taq), una  bacteria  termófila  que  vive 
de  ser  encontrada  por  azar.  La  respuesta  a  la  en  la  proximidad  de  las  fuentes  de  agua  termal 
pregunta planteada más arriba, entonces, es sí.   (entre  50  y  80  oC),  es  por  esto  que  su  enzima 
polimerasa es más estable, y permite soportar las 
Temperatura de anillado. En el segundo ciclo de  temperaturas  elevadas  durante  los  ciclos  de  la 
la reacción de PCR, la temperatura utilizada es tal  PCR. 
que  permite  la  unión  de  los  cebadores  a  su 
secuencia blanco. Esta temperatura se determina  En  la  actualidad  se  han  descrito  y  utilizado 
dependiendo  de  la  temperatura  de  diferentes polimerasas en la reacción de PCR. La 
desnaturalización  o  melting  de  los  mismos.  La  elección  de  la  enzima  dependerá  de  factores 
temperatura de desnaturalización (Tm) se define  tales  como:  la  fidelidad  de  la  enzima  o  tasa  de 
como  la  temperatura  a  la  cual  el  50%  de  las  error  (capacidad  de  producir  errores  o  no 
moléculas  se  encuentran  desnaturalizadas.  Hay  durante  el  copiado),  la  velocidad  (cantidad  de 
varios  algoritmos  que  permiten  calcular  dicha  nucleótidos  incorporados  por  segundo  en  la 
temperatura.  En  la  práctica,  una  fórmula  muy  cadena  naciente  de  ADN),  la  procesividad 
utilizada  es  la  siguiente:  Tm=4(G+C)+2(A+T),  (ej:  (capacidad  de  unirse  al  molde),  la  actividad 
para  la  secuencia  AGGTCGTGCA,  la  exonucleasa  (capacidad  de  corrección  de 
Tm=4(4+2)+2(2+2)=32°C,  y  en  general  se  utiliza  errores), extremos del ADN resultante, etc.  
esta temperatura menos 5 grados, como primera 
aproximación a la temperatura de anillado. 
Figura 3. P
Pasos durante e
el ciclo de reaccción de la PCR
R. 

3. Algunos Tips e
A experimentales: 

Conceptualmente,  la  técnica  de  la l reacción  en 

e cadena  dde  polimerassa  es  sumam mente  sencilla,  sin 
embargo  la  puesta  a  punto 
p de  unaa  reacción  en
n  particular  ddebe  consideerar  algunos  aspectos,  para  ser 
exitosa. En la presente
e sección, repasaremos som meramente aalgunos de estos elemento os. 

a. Compo
onentes 

Una reaccción convenciional de PCR sse puede realizar con la sigguiente fórm
mula: 

Com
mponente  Concentraación inicial  Concentraciión final  V
Volumen paraa 20 uL 
en solucción stock  en la reaccción  (uL) 
dNTPs 
d 2,5
5 mM  0,25 m mM  2 
Tampón n de reacción  10 X 
1 1 X 2 
Oliggo directo  10 uM (110 pmol/uL)  1 a 5 uuM  0,1‐0,5 
Oliggo reverso  10 uM (110 pmol/uL)  1 a 5 uuM  0,1‐0,5 
Polimerasa  5 UU/uL  1 U 0,2 
Molde 
M Deppende  Dependde  Dependee 
Agua libre de ADNasaa   ‐‐‐  ‐‐‐ csp. 20 uL 
 

La cantidaad de molde rrequerida dep
pende del tip
po de ADN qu e se trate (AD
DN genómico
o, plasmídico, etc). 

ón que se incluyen con las  enzimas com
En generaal los tampones de reacció mercialmente disponible inncluye 
una conceentración estándar de Cloruro de Magn nesio, que peermite una acctividad comp
pleta de la en
nzima. 
La  concentración  de  MgCl2  presente  en  la  reacción  es  una  de  las  variables  con  las  cuales  se  pueden 
poner a punto algunas reacciones. 

En la realización de la reacción, un punto importante es la homogenización de los reactivos. Las enzimas 
se encuentran en glicerol lo cual las hace más densas y tienden a estar en el fondo del tubo de reacción.  

b. Ciclos y Temperaturas: 

En cuanto a la elección de los ciclos y las temperaturas, los mismos dependerán de la cantidad inicial de 
la secuencia diana que se desea amplificar y las características de composición de bases, tanto del ADN 
blanco  como  de  los  cebadores.  Típicamente,  una  reacción  convencional  utiliza  35  ciclos,  siendo  cada 
etapa de desnaturalización, anillado y extensión de 30 segundos. El tiempo de extensión también varía 
de  acuerdo  al  tamaño  del  fragmento  que  se  desea  amplificar  y  la  velocidad  de  la  enzima  con  la  cual 
estamos  realizando  la  reacción.  Cuando  los  fragmentos  que  se  desea  amplificar  son  mayores  a  5000 
bases, la extensión puede necesitar de 5 a 10 minutos. Las temperaturas de desnaturalización utilizadas 
son en general 94 o 95  oC, y la de extensión depende de la enzima utilizada, comúnmente si se utiliza la 
Taq  se  recomienda  una  temperatura  de  extensión  de  72  oC.  La  temperatura  de  anillado  es  clave  para 
tener éxito en la reacción, esta temperatura depende básicamente de la complejidad del ADN blanco y 
la composición de bases de los cebadores (ver apartado: Cebadores). 

c. Diseño de cebadores: 

Un punto clave de la optimización, quizás el de mayor importancia para realizar una reacción exitosa, es 
el diseño de los cebadores. Algunos puntos a considerar se detallan a continuación. La secuencia de los 
cebadores deberá tener una composición de bases tal que su contenido GC se encuentre entre 40 y 60 
% (esto dependerá de la complejidad del ADN blanco a partir del cual realizaremos la amplificación, por 
lo que no siempre lo podemos respetar). Ambos cebadores deben tener una composición de bases, o al 
menos  un  contenido  GC,  y  un  largo  similar.  Estos  factores  están  implicados  en  la  temperatura  de 
melting, que no debería variar más de 5 oC entre un cebador y el otro. El extremo 3’ del cebador es muy 
importante y se busca que sea una base G o C (lo cual provoca mayor especificidad, debido a que son 
bases que se unen mediante 3 puentes de hidrógeno, en contraste con A y T que se unen mediante 2 
puentes  de  hidrógeno).  En  los  extremos  5’  de  los  cebadores,  no  es  necesario  que  haya  un  100  %  de 
complementariedad con la secuencia blanco, de hecho pueden adicionarse colas de 10 o más bases que 
luego  permiten  la  clonación  de  estos  fragmentos  o  la  secuenciación  con  cebadores  universales.  Otro 
punto importante a considerar es la capacidad de esos cebadores de hibridarse consigo mismos o entre 
sí. Si un cebador posee una secuencia palindrómica interna, puede formar una horquilla (plegarse sobre 
sí  mismo  por  complementariedad)  y  de  este  modo  no  estar  disponible  en  la  reacción.  Además,  si  los 
extremos  3’  de  ambos  cebadores  son  complementarios  entre  sí,  pueden  dar  lugar  a  dímeros  de 
cebadores, evitando así la amplificación del fragmento deseado y amplificando únicamente los dímeros. 
Generalmente, estos dímeros se forman inespecíficamente y se observan como fragmentos del tamaño 
de  la  suma  del  largo  de  ambos  cebadores.  Finalmente,  para  evitar  la  amplificación  de  secuencias 
inespecíficas,  es  importante  chequear  en  bases  de  datos  de  secuencias  de  ADN  (ej.  GeneBank: 
ww.ncbi.nlm.nih.gov) la posibilidad de amplificación de otros blancos. 
 d. Otras consideraciones: 

Otros puntos a tener en cuenta son la calidad y cantidad del molde a partir del cual queremos realizar la 
amplificación.  Se  recomiendan  relaciones  espectrofotométricas  260/280  y  260/230  mayores  a  1,8‐2,0. 
Estas  medidas  aseguran  una  buena  calidad  de  ADN  con  baja  contaminación  de  proteínas  y  otros 
inhibidores. La utilización de kits de purificación comerciales facilita la obtención de un ADN o ARN (en el 
caso de una RT‐PCR) de buena calidad eliminando muchos de los posibles inhibidores de la reacción. 

e. Contaminación: 

Un punto clave en las reacciones de PCR es la minimización de la posibilidad de contaminación. Debido a 
la sensibilidad de la técnica (dada por la amplificación exponencial de fragmentos), es necesario tomar la 
mayor  cantidad  posible  de  recaudos  para  evitarla.  En  primer  lugar,  lo  ideal  es  trabajar  en  tres  áreas 
diferentes, separadas en lo posible físicamente, y a las cuales se debe acceder siguiendo un camino en el 
cual una vez llegada a la última área no es posible volver atrás (flujo uni‐direccional). La primera de las 
áreas, con su juego de pipetas exclusivo y zona UV para descontaminación, es para la realización de las 
mezclas de reacción (en esta área sólo debemos hacer la mezcla que incluye el tampón de reacción, la 
enzima,  los  dNTPs,  el  agua  y  los  cebadores),  esta  área  en  general  es  conocida  como  área  de  pre‐PCR. 
Una vez finalizada esta etapa, donde se preparan la cantidad de reacciones necesarias para el trabajo, se 
pasa a la siguiente área, dónde únicamente se agregara tubo a tubo el ADN molde (área PCR). Siempre, 
debemos  incluir  un  tubo  blanco  de  reacción  que  debe  tener  todos  los  componentes  de  la  mezcla 
excepto  el  molde,  que  sustituiremos  con  agua.  Idealmente  se  pueden  realizar  2  blancos,  uno  que 
cerraremos en el área de pre‐PCR, que permite detectar si 
hay  contaminación  de  los  reactivos,  y  otro  que  dejaremos  Termocicladores:
abierto durante toda la manipulación para asegurar que no  En los comienzos de la técnica no existían 
hubo contaminación durante la misma. También, en el caso  equipos  de  PCR  automatizados,  por  lo 
de  contar  con  un  control  positivo,  la  incorporación  del  cual  se  utilizaban  diferentes  baños 
termostatizados  (a  las  temperaturas  de 
mismo  en  cada  tanda  de  reacciones  es  recomendable.  Por 
desnaturalización, anillado y extensión) y 
último  se  pasa  al  termociclador  (ver  apartado:  manualmente se cambiaban los tubos de 
Termocicladores)  y  a  la  visualización  de  los  fragmentos  un  baño  a  otro.  El  primer  equipo 
amplificados  (ver  apartado:  Visualización  de  productos  de  desarrollado,  de  hecho,  únicamente 
automatizó  el  cambio  manual  de  tubos. 
PCR). Esta última área es conocida como área de post‐PCR. 
Los  equipos  actuales  constan, 
De  acuerdo  al  flujo  uni‐direccional,  estos  tubos  nunca  básicamente, de un bloque de metal que 
deben pasar al área de pre‐PCR. Se recomienda trabajar con  puede  ser  calentado  o  enfriado 
túnicas  diferentes  en  cada  área.  Idealmente,  también  se  rápidamente  (generalmente  mediante  el 
sistema  peltier),  con  posibilidad  de 
puede  hacer  uso  de  presiones  diferenciales  en  las  programar  las  temperaturas,  rampas  de 
diferentes  salas  para  minimizar  los  problemas  de  subida  y  bajada  de  las  mismas  y  los 
contaminación.  Como  veremos  más  adelante,  la  aparición  tiempos  de  cada  etapa  de  los  ciclos,  así 
de  la  PCR  en  tiempo  real,  minimizó  uno  de  los  mayores  como  la  cantidad  de  ciclos.  En  general 
presentan  una  tapa  térmica  que  evita  la 
problemas  de  contaminación  al  evitar  la  apertura  de  los  evaporación  de  la  mezcla  de  reacción 
tubos  una  vez  finalizada  la  reacción  (principal  fuente  de  durante la etapa de desnaturalización.  
contaminación de reacciones). 
Por  último,  el  trabajo  siguiendo  procedimientos  y  normas  GLP  (Good  Laboratory  Practices)  es 
recomendable para evitar contaminaciones.  

  Visualización de productos de PCR: 
  El  procedimiento  más  común  para  el  análisis  de  los  fragmentos  obtenidos  en  la  PCR  es  la 
electroforesis,  ya  sea  en  geles  de  agarosa  o  de  acrilamida.  La  electroforesis  permite  separar 
 
fragmentos  de  acuerdo  a  su  tamaño.  Los  fragmentos  de  ADN  (cargados  negativamente)  se 
desplazan por el gel a través de un campo eléctrico hacia el polo positivo. Los fragmentos más 
 
pequeños migran más rápido y son los que vemos más abajo en el gel. La elección de la matriz 
  (agarosa o acrilamida) y el porcentaje en la cual separar los productos, dependerá del tamaño 
de  los  mismos  y  los  largos  diferentes  que  deseemos  separar.  Generalmente,  los  geles  de 
  agarosa  se  visualizan  agregando  Bromuro  de  etidio,  un  agente  que  se  intercala  en  el  ADN  y 
fluoresce cuando es expuesto a la luz UV, y en el caso de los geles de acrilamida, la tinción se 
  realiza con nitrato de plata, que por interacciones electrostáticas se une al ADN. 
 
    PM  1     2     3    4     5    6    7
 
   
 
   
  500 pb
  Ejemplo Gel Agarosa: 
Gel de agarosa 1 % teñido con bromuro de Etidio  250 pb
  dónde se visualizan productos de amplificación 
100 pb
de diferentes tamaños (carriles 1, 2, 3 y 7) entre  
 
250 y 500 bases. En los carriles 3 a 6, el tamaño 
  parece ser el mismo. Sin embargo, la resolución 
de este tipo de gel no hace posible esta afirmación.  
 

4. Variantes de la PCR 

Una vez que el uso de la PCR se masificó, a partir de la década de 1990, han surgido variantes y nuevas 
aplicaciones a la técnica. El detalle de cada variante escapa a la finalidad del capítulo, por lo cual solo se 
hará mención a alguna de ellas y explicara de forma resumida. 

a. RT PCR: Es una variante de la PCR muy utilizada en la que se utiliza ARN como molde inicial en vez de 
ADN, y emplea una transcriptasa reversa (una polimerasa de ADN‐ARN dependiente) para realizar la 
síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). En esta primera ronda, como cebador se pueden 
utilizar hexámeros (oligonucleótidos de 6 nucleótidos de secuencia aleatoria) que se unen al azar en 
cualquier  región  del  ARN  molde,  o  un  oligonucleótido  (en  general  un  oligo  dT)  que  permite  la 
captura y la realización del ADNc a partir del ARNm o ARN con colas poliA. Una vez que se obtiene el 
ADNc, se realiza la reacción de PCR convencional como se detalló más arriba. 
b. PCR anidada o nested: Se trata de una técnica que aumenta la sensibilidad de la PCR. En este caso 
se trabaja con 4 cebadores, en una primera ronda se amplifica de manera convencional con los dos 
cebadores  más  externos  a  la  región  que  se  desea  amplificar.  El  producto  de  este  primer  PCR  se 
utiliza como molde para una segunda ronda que utiliza cebadores internos a la región previamente 
amplificada. La desventaja de esta técnica es la posibilidad aumentada de contaminación, y además 
no permite cuantificar la cantidad inicial de ADN molde presenta en la muestra analizada. 
 
c. PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde 
los  productos  generados  pueden  visualizarse  en  el  sitio  de  amplificación.  Es  realizada  sobre 
preparaciones  fijas  en  un  portaobjetos.  En  la  técnica  de  PCR  in  situ  se  realiza  una  primera 
amplificación  de  ADN  blanco  y  luego  detección  mediante  hibridación  in  situ  convencional  con 
sondas de ADN/ARN. 
 
d. PCR múltiplex: PCR en la cual se amplifica más de una secuencia en una misma reacción. Emplea dos 
o  más  pares  de  cebadores  en  un  único  tubo  con  el  fin  de  amplificar  simultáneamente  diferentes 
fragmentos  de  ADN.  Consiste  en  combinar  en  un  único  tubo  de  reacción  todos  los  pares  de 
cebadores  de  las  secuencias  que  queremos  amplificar,  junto  con  el  resto  de  los  reactivos  de  la 
reacción en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la información de varios loci en una sola 
reacción,  requiere  menor  cantidad  de  molde  para  el  análisis  y  menor  cantidad  de  reactivos.  Los 
ejemplos  de  PCR  múltiplex  son  muy  comunes  en  el  diagnóstico  de  agentes  infecciosos,  donde  se 
intenta  amplificar  varios  tipos  virales  en  el  mismo  tubo  y  al  mismo  tiempo  (ej.  Amplificación  de 
Herpes Virus en muestras biológicas). 

Otras variantes de la PCR incluyen la PCR inversa, PCR de colonia, PCR asimétrica, PCR alelo específica, 
entre otras. 

5. PCR en tiempo real: 

La PCR en tiempo real es hoy una de las variantes más utilizadas. Esta técnica permite, a diferencia del 
PCR convencional, la cuantificación de los productos de amplificación, además de otras oportunidades. 
La cuantificación es muy utilizada en lo que refiere al análisis de expresión génica. 

La  PCR  en  tiempo  real  fue  reportada  por  primera  vez  en  un  artículo  de  Higuchi  y  colaboradores  (R. 
Higuchi  y  col.,  Biotechnology  1993,  11).  Estos  autores,  utilizando  una  cámara  para  monitorear 
reacciones de PCR durante el curso del termociclado, detectaron la acumulación de ADN doble cadena 
en  cada  ciclo  de  PCR,  evidenciado  por  un  incremento  en  la  fluorescencia  producto  de  la  adición  de 
Bromuro de Etidio en la reacción. El aumento de fluorescencia se relaciona directamente con el número 
de  copias  de  la  molécula  que  está  siendo  amplificada,  presentes  inicialmente  en  la  reacción.  A  menor 
número  de  copias  presentes  inicialmente,  menor  el  número  de  ciclos  necesarios  para  detectar 
fluorescencia.  

Mediante esta variación de la PCR es posible seguir la cinética de cada reacción en tiempo real, por lo 
que permite una cuantificación sensible y específica del blanco que se desea analizar, al utilizar la fase 
exponenccial de la curvva de amplificación. Adem
más, esta técnnica presentaa un amplio rrango dinámiico de 
cuantificaación.  

En  1997  surgen  los  primeros 

p equ
uipos  comercciales  de  PCR
R  en  tiempoo  real,  producidos  por  Appplied 
Biosystem
ms.  Desde  entonces  han  surgido 
s numeerosos  equip os  con  difereentes  propiedades,  entree  ellos 
destacamos el LigthCyycler de Roch he (hoy discon
ntinuado), y  el RotorGeneeQ (producid do en la actuaalidad 
por Qiage
en). 

Junto  al  surgimiento o  de  los  eq quipos  de  PCR  en  tiem mpo  real,  ssurgieron  taambién  diferrentes 
aproximaciones y estrrategias para  detectar la ffluorescencia . En este sen ntido,  el Brom muro de Etidiio fue 
o  por  el  SYBR
sustituido R  Green,  una  molécula  quue  también  sse  intercala  een  el  ADN  dooble  cadena,,  pero 
presenta mayor afinidaad y especificcidad que el B Bromuro de EEtidio. Si bien el SYBR Greeen continúa ssiendo 
utilizado  en  la  actualidad,  existe  un  amplio  espectro 
e de  estrategias  b basadas  en  ssondas  especcíficas 
marcadass fluorescente emente que m muestran mayyor especificiidad y permitten además d de la cuantificcación 
otras alternativas como el diagnóstico de polimo orfismos punttuales, por ejemplo. 

A continuación nos cen
ntraremos en
n cuatro elementos importtantes: 

‐ Cinética de reaacciones y concepto de cicclo umbral 
‐ Químicas utiliz
Q zadas en PCR en tiempo re eal 
‐ Cuantificación absoluta y reelativa 
‐ Curvas de desn n y detección de polimorfiismos 
naturalización
 
a. Cinética de reaacciones y concepto de cicclo umbral 

Cómo obsservamos en  la figura 2 dee este capítulo, la cinéticaa de reacción del PCR es lo que observvamos 
en cada corrida de PCR
R en tiempo rreal que realizzamos (figuraa  4). 

 
Figura  4.  Curva  de  amplificación  reaalizada  con  diluciones  seria das  en  base  10  de  un  fraagmento  de  in
nterés, 
utilizando SYBRGreen en equipo RotorG Gene6000. 

Lo que se
e observa en  la figura 4, co
orresponde aa diluciones s eriadas en baase 1:10 del  molde inicial,, y las 
curvas de
e amplificación de cada un na de ellas (10
00.000, 10.0000, 1.000 y 100 copias mo olde por reaccción). 
La  línea  roja  horizontal  representa  el  valor  umbral  de  intensidad,  a  partir  del  cual  las  muestras 
comienzan su fase exponencial de amplificación. El ciclo umbral de cada muestra, es el ciclo en el cuál 
pasan en el umbral (indicado con la círculo rojo para la muestra de mayor concentración). En el ejemplo, 
queda  clara  la  relación  inversamente  proporcional  entre  el  ciclo  umbral  y  la  concentración  inicial  de 
molde presente en las reacciones. A mayor concentración, antes amplificará la muestra y menor será su 
ciclo umbral. Arriba a la izquierda, en la misma figura, se observa la curva de cuantificación generada a 
partir de estos datos, graficando el ciclo umbral  en las ordenadas y el logaritmo de la concentración en 
las  abscisas.  Por  lo  tanto,  dado  una  muestra,  de  la  cual  se  desea  conocer  su  concentración  inicial  de 
molde, sólo deberemos interpolar el ciclo umbral de esa muestra en nuestra gráfica de cuantificación y 
obtener un valor de concentración (esto lo veremos con más detalle cuando hablemos de cuantificación 
absoluta). 

b. Químicas utilizadas en PCR en tiempo real: 

Cómo mencionamos antes existen diferentes aproximaciones que utilizan la fluorescencia para medir la 
cinética del PCR, una forma de clasificarlos es la siguiente: 

‐ Agentes intercalantes: En este caso, se utilizan moléculas fluorescentes que aumentan su emisión 
cuando se unen al ADN doble cadena, es el caso del Bromuro de Etidio y SYBR Green. La desventaja 
de  esta  estrategia  es  la  inespecificidad,  ya  que  los  agentes  intercalantes  se  unen  a  cualquier 
producto que este siendo producido durante la reacción, ya sea el específico que queremos medir, 
como productos inespecíficos, dímeros de cebadores, etc. Otra desventaja de esta estrategia es que 
no  puede  utilizarse  en  reacciones  multiplex.  Como  veremos  más  adelante  en  este  capítulo,  es 
posible  realizar  curvas  de  desnaturalización  y  evidenciar  presencia  de  dímeros  de  cebadores, 
aunque no es posible eliminar esa señal que será un ruido en nuestras medidas, cuando deseemos 
cuantificar. La ventaja de utilizar agentes intercalantes radica en que puede utilizarse para cualquier 
reacción de PCR y que es económico. 
‐ Sondas: La utilización de sondas mejora sensiblemente la especificidad del método. Hay diferentes 
estrategias que se basan en sondas (Taqman, FRET, Molecular beacon, etc.). Aquí desarrollaremos 
únicamente las sondas de hidrólisis (ej.: Taqman) y las de hibridación (ej.: FRET) ya que son las más 
utilizadas. 

Sondas Taqman: 

Las sondas Taqman se hibridan de manera específica a una secuencia del producto de amplificación. 
En  uno  de  los  extremos  de  la  sonda  (el  5’)  se  encuentra  unido  un  fluorocromo  reportero  el  cual 
mientras  la  sonda  permanece  intacta  la  emisión  es  “apagada”  o  quencheada  por  una  segunda 
molécula  unida  al  extremo  opuesto  de  la  sonda  (el  3’).  Esta  molécula  es  un  quencher,  es  decir 
absorbe  la  emisión  del  fluorocromo  reportero  pero  no  la  emite.  Entonces,  cuando  la  sonda  está 
intacta no hay emisión del fluorocromo (Figura 5).  

 
 Figura  5.  Esquema  de  la  estrategia  de  sondas  Taaqman.  Se  muuestra  la  sond
da  intacta,  antes  de  produccirse  la
amplificacción, con el flu
uorocromo uniddo al extremo 5’ (F) y el quenncher en el 3’  (Q). Se muestrra el sitio de un
nión de
los cebadores forward (F) y reverso (RR). 
 

Cuand do  se  producce  la  amplificación,  come enzando  desdde  uno  de  lo
os  cebadoress  (en  este  caaso  el 
directto  o  forward)  la  actividad
d  5’‐3’  exonucleasa  de  la  enzima  ADN  polimerasa  degrada  la  ssonda, 
separrando  físicammente  el  flu uorocromo  y  y el  quencheer,  permitiendo  ahora  sí  la  emisió ón  de 
fluore
escencia.  Cuáánto  mayor  cantidad 
c de  producto  geenerado,  mayyor  sonda  deegradada  y  m mayor 
emisióón de luz (Figgura 6). 

Figura 6. Esquema de la estrategia de ssondas Taqman n. Se muestra  la sonda degraadada, luego de la amplificacción de 

la enzima aa partir del ceb
bador forward (F), y el fluoro
ocromo separaddo del quencher. En naranja se muestra la hebra 
de ADN reccién sintetizada.  

Sonda
as FRET: 

Las  so
ondas  FRET  también 
t se  hibridan  de  manera 
m especcífica  dentro  del  producto o  de  amplificaación, 
pero e en este caso se trata de dos sondas. En n la primera dde las sondass se adiciona u un fluorocrom mo en 
el exttremo 3’ y en n la segunda ssonda, que d debe hibridar  cerca de la aanterior, se aagrega un seggundo 
fluoroocromo unido o al extremo  5´. Las caraccterísticas de  los fluorocro omos son talees, que la lon ngitud 
de  onnda  emisión  del  fluorocrromo  de  la  primera  sonnda,  coincide  con  la  longgitud  de  ond da  de 
excitaación  del  segundo  fluoroccromo.  En  estte  caso,  se  dda  un  intercambio  de  eneergía,  y  cuánd
do  las 
sondaas  se  aproximman,  se  excitta  el  primer  fluorocromoo  pero  se  ob bserva  la  emisión  del  seggundo 
(Figurra 7).  
Figura  7.  Esquema  de  la  estrategia  de 
d sondas  FREET.  Se  muestrra  la  interacció
ón  entre  amb
bas  sondas  y  aambos 
fluorocrommos sobre una de las hebras  del ADN. El fluuorocromo verrde se excita aa la longitud dee onda que irraadia el 
equipo, peero al estar pró
óximo la segun nda sonda la en
nergía emitida  por él es transferida al fluorrocromo rojo,  el que 
emite en uuna longitud dee onda mayor, que es la dete ectada por el eqquipo.  

En este caso, las ssondas no se  degradan, sino que se hibbridan y desh hibridan siguiendo los cicllos de 

tempe eratura de la reacción. A  mayor cantid dad de produ cto generado o, más pares  de sondas pu ueden 
interaactuar aumen ntando la inteensidad de se eñal. Una de l as ventajas d de utilizar esta estrategia rradica 
en  la  posibilidad  de 
d realizar  cu
urvas  de  desn naturalizaciónn  al  finalizar  la  reacción.  Esto  permitee,  por 
ejemp plo, la identifficación de po
olimorfismos  puntuales (SSNPs). Si diseñ ñamos la son nda de manera tal, 
que laa mutación que queremoss detectar se encuentra enn la región dee unión de un na de las sond das, la 
tempe eratura  de  desnaturalizac
d ción  de  la  sonda  será  d iferente  paraa  cada  uno  de  los  aleloss  que 
estemmos  amplificcando  y  estte  hecho  hace  h que  ppodamos  disstinguir  med diante  curvaas  de 
desnaaturalización la presencia e en homocigossis, heterociggosis o ausenccia de la mutaación buscada (ver 
ejemp plo más adelaante). Tambié én permite cu uantificar, al iggual que las ssondas Taqman, y presentta una 
especcificidad  aún  mayor  debid do  a  que  utilizamos  dos  ssondas  en  lugar  de  una.  Asimismo,  hay  un 
incremmento de la ssensibilidad producto del FFRET.  

Algun
nos tips en el d
diseño de son
ndas: 

Al  igu os  cebadoress  se  juega  graan  parte  del  éxito  de  unaa  reacción  dee  PCR 
ual  que  en  el  diseño  de  lo
conve encional, el buen diseño de las sondas  es fundamenntal para obteener buenas  reacciones de PCR 
tiemp po real. Las soondas deben  tener su extrremo 3’ fosfoorilado, ya que de otro mo odo podrían aactuar 
como o  cebador.  Addemás  no  se  recomienda  que  la  base  a  la  cual  uniiremos  el  fluo orocromo  sea  una 
Guanina,  ya  que  esta  base  tie ene  propiedaades  de  quenncher.  Las  teemperaturas  de  melting  d de  las 
sondaas deben ser  tales que estén unidas al molde cuanndo la polimeerasa está copiando el AD DN (se 
recom mienda  que  se  encuentrre  10  gradoss  por  encim ma  de  la  temmperatura  de  melting  d de  los 
cebad dores). En el ccaso de las so ondas FRET, las temperatuuras de anillado de ambass sondas debeen ser 
similaares,  ya  que e  ambas  deb ben  estar  unnidas  al  moolde  para  qu ue  se  obten nga  una  señal  de 
fluoreescencia. La d distancia entrre sondas (en n el caso de FFRET) debe seer entre 1 y 5 5 nucleótidos, para 
permitir  el  intercaambio  de  en nergía  de  fluo
orescencia.  AAdemás,  en  rreacciones  dónde  utilizarremos 
sondaas FRET, la enzima no debe e poseer activvidad exonuc leasa 5’‐3’ paara no degrad dar las sondass. 

 
 c. Cuantificación absoluta y relativa: 

La cuantificación absoluta, es aquella en la cual se utiliza una curva estándar construida a partir de 
concentraciones conocidas del blanco que se desea amplificar y cuantificar. Es la estrategia elegida 
en muchos kits comerciales de PCR en tiempo real para cuantificar cantidad de virus presentes en 
muestras  biológicas  (ej.  Carga  viral  de  HIV,  HCV).  Como  comentamos  más  arriba,  se  aprovecha  la 
relación  entre  el  ciclo  umbral  y  la  concentración  inicial  de  molde  presente  en  las  muestras  o 
estándares.  

Las  curvas  de  calibración  son  altamente  reproducibles,  específicas  y  sensibles.  Sin  embargo 
debemos  asegurarnos  la  calidad  de  los  estándares  que  utilizamos  ya  que  de  ellos  depende  el 
resultado final de la cuantificación. El rango dinámico de cuantificación puede llegar a 9 órdenes de 
magnitud (ej. 102 – 1011 copias iniciales de ácido nucleico).  

En el caso de los kits de diagnóstico, muchas veces se utiliza un control interno que se agrega a la 
muestra  antes  de  ser  extraído  el  ácido  nucleico  (ARN  o  ADN),  que  sigue  todo  el  proceso  de 
extracción  y  amplificación.  Idealmente  este  control  interno  debe  amplificarse  con  los  mismos 
cebadores que el blanco que se desea cuantificar. En estos casos se utilizan sondas, específicas para 
cada uno de los amplicones, marcadas con moléculas fluorescentes con diferentes propiedades que 
permita distinguirlos. Una estrategia de cuantificación implica la realización de dos curvas estándar, 
uno para cada blanco (el de interés y el control interno) y luego una cuantificación relativa al control 
interno  que  se  agregó  al  comienzo  del  procesamiento  de  la  muestra,  lo  cual  asegura  una 
cuantificación precisa considerando las pérdidas de material durante la extracción. 

La cuantificación relativa es la estrategia utilizada para estudiar los cambios en la expresión génica 
entre  diferentes  muestras.  En  este  caso,  se  realiza  una  RT‐PCR  en  tiempo  real,  la  que  permite 
determinar los cambios de los niveles de expresión de un determinado gen en diferentes muestras y 
se  expresa  el  resultado  relativo  a  un  mensajero  que  no  cambia  durante  el  proceso  que  estamos 
estudiando (ej. un gen housekeeping) o un control interno que agregamos a cada muestra (como en 
el caso que mencionamos en el párrafo anterior).  

Existen  diferentes  modelos  matemáticos  para  hacer  estudios  de  expresión  génica  diferencial 
mediante cuantificación relativa. Aquí mostraremos dos métodos, uno de ellos no tiene en cuenta la 
eficiencia de la reacción de PCR y el otro sí tiene en cuenta este factor. En el primer caso se asume 
una eficiencia de 100 % (es decir que el blanco de amplificación se duplica en cada ciclo): Ecuación 1.  

Ecuación 1.    R = 2 –(ΔCt gdi – ΔCt gh)Experimental – (ΔCt gdi – ΔCt gh)Control = 2 –( ΔΔCt )   
 
Dónde gdi=gen de interés y gh =gen housekeeping, de este modo, se obtiene una relación entre dos 
condiciones  (experimental  vs.  control)  para  un  gen  de  interés  utilizando  para  normalizar  un  gen 
housekeeping. (Referencia: Livak and  Schmittgen. Analysis of Relative Gene Expression Data Using 
Real‐Time Quantitative PCR and the ΔΔCt Method . Methods 25, 2001). 

 
 En el segundo caso, se realiza una corrección basándose en la eficiencia de  cada reacción (para el 
gen de interés y para el gen normalizador): Ecuación 2. 

 
Ecuación 2.    R = Eficiencia gdi –(ΔCt gdi Control – ΔCt gdi Muestra)    
                               Eficiencia gh –(ΔCt gh Control – ΔCt gh Muestra) )   

En  este  método  desarrollado  por  Pfaff  y  colaboradores  (Nucleic  Acids  Res.  2001  29(9):  E45),  se 
considera la eficiencia de la amplificación de cada uno de los blancos que se analizan. Para ello se 
realiza  una  curva  de  calibración  (sin  necesidad  de  conocer  realmente  la  cantidad  de  moléculas 
iniciales  en  la  reacción,  sino  haciendo  diluciones  seriadas  a  partir  de  un  stock)  y  a  partir  de  la 
pendiente de esta curva se calcula la eficiencia de la reacción mediante la Ecuación 3:  

Ecuación 3. Eficiencia (E) = [10 (‐1/pendiente)] ‐1 

De esta manera se realiza una aproximación más realista, ya que la eficiencia de un experimento de 
PCR difícilmente alcance el 100% como plantea el primer método. 

d. Curvas de desnaturalización y detección de polimorfismos puntuales. 

Las  curvas  de  desnaturalización  pueden  realizarse  cuando  se  utilizan  agentes  intercalantes  y  en 
estrategias con sondas de hibridación (no en el caso de sondas de hidrólisis). Estas curvas se realizan 
al finalizar la reacción, es decir, cuando las reacciones alcanzan la fase plateau. Para ello se  aumenta 
la  temperatura  gradualmente  desde  por  ejemplo  50‐60  oC  hasta  95  oC.  De  esta  manera,  los 
productos que se encuentran hibridados, y con una intensidad de fluorescencia alta (ya sea por el 
agente  intercalante  o  por  la  sonda  hibridada)  comienzan  a  desnaturalizarse  provocando  que  el 
agente  intercalante  del  ADN  doble  cadena,  o  que  las  sondas  se  separen  de  su  blanco,  este  hecho 
provoca  una  disminución  de  la  señal  de  fluorescencia  que  puede  seguirse  en  función  de  la 
temperatura. Cuando hay un punto de inflexión en esta curva (Figura 8), el mismo corresponde al 
punto de desnaturalización o temperatura de melting (Tm). Al calcular la derivada de la Intensidad 
de  fluorescencia  en  función  de  la  Temperatura,  y  graficarla  nuevamente  en  función  de  la 
temperatura se observan gráficas como las de la Figura 9. 
 15
Fluorescence

10

0
72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96
ºC  
Figura  8.  Curva  de  desnaturalización.  Se  gráfica  la  fluorescencia  en  función  de  la  temperatura.  Las  líneas  verdes 
corresponden  a  las  muestras  de  la  Figura  4.  La  línea  negra  es  la  curva  correspondiente  a  un  blanco  de 
amplificación.  

1,5
dF/dT

0,5

0
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97
ºC  
Figura  9.  Curva  de  desnaturalización  derivatizada.  Se  gráfica  la  derivada  de  la  fluorescencia  en  función  de  la 
temperatura en las ordenadas, y la temperatura en las abscisas. Lo que se observa es un pico correspondiente a la 
Tm para las muestras en verde. En negro, el blanco de reacción presenta un pico de menor Tm que se corresponde 
con la presencia de dímeros de cebadores.  

La  posibilidad  de  realizar  este  tipo  de  curvas  permite  distinguir  la  presencia  de  dímeros  de 
cebadores en la reacción o productos inespecíficos que presentan, en general, una temperatura de 
desnaturalización  menor  que  la  del  blanco  específico.  En  la  Figura  9,  puede  verse  un  pico  de 
desnaturalización en la muestra que corresponde al blanco de reacción, dónde al no haber muestra 
para amplificar se favorece la formación de dímeros. Por lo tanto, en este caso, se observa una señal 
de amplificación en las curvas de amplificación, que no implica una contaminación de la muestra ya 
que no hay un pico a la Tm esperada. 

Por último es posible detectar polimorfismos puntuales mediante la realización de estas curvas, ya 
sea  utilizando  sondas  de  hibridación,  como  con  una  nueva  generación  de  agentes  intercalantes 
(Sito9®  Green  Fluorescent  nucleic  acid  stain  o  EvaGreen®  dye)  y  la  posibilidad  de  los  equipos  de 
realizar curvas de desnaturalización más precisas (HRM: por high resolution melting) (Figura 10). 
  
Figura  10.  Curvas  de    de
esnaturalizació
ón  obtenidas  con 
c HRM.  Se  oobserva  los  differentes  punto os  de  inflexión
n  en  el 
na  mutación  puntual 
caso  de  un p G  por  A  y  se  muestran  los  tres  poosibles  genotip
pos.  A  la  dereecha  se  observvan  las 
mismas  cu urvas  pero  mo ostrando  la  diferencia  respecto  a  una  m muestra  normaal,  en  este  caaso  se  acentúan  las 
diferenciass  y  es  más  fácil 
f determin nar  los  diferentes  genotipoos  (imágenes  obtenidas  dee  http://www w.gene‐
quantificattion.de/ab‐hrm m‐guide.pdf).  Las  curvas  en e rojo  correesponden  al  homocigota  normal,  en  verde 
correspond de al homocigota mutado y  en azul el hete erocigota paraa la mutación ((es decir un alelo normal –G G‐ y un 
alelo mutaado –A‐)  

En el caso de las so
ondas de hibrridación (com
mo FRET), el ppolimorfismo  provoca una inestabilidad
d en la 
sondaa en el caso dde estar presente (al no te
ener una com mplementarieedad perfectaa) provocando una 
disminución en la ttemperatura de desnaturaalización en loos alelos que poseen la mu
utación. 

 
Figura 11. Curvas de  dessnaturalización
n obtenida con
n sondas FRET.  Se observa loss diferentes puuntos de inflexxión en 
el caso de una mutación puntual G porr A y se muestrran los tres possibles genotipo
os (en este caso particular, laa curva 
roja corressponde a un homocigota normal, la curva  verde a un hoomocigota mu utado y la curvva azul, que muestra 
ambos pico os, a un hetero udiada). 
ocigota para la mutación estu

 
Comentarios finales: 

Para finalizar este capítulo mencionaremos algunas de las aplicaciones de la PCR y PCR en tiempo 
real. Las mismas abarcan desde la investigación básica hasta la aplicada, pasando por el diagnóstico 
humano  a  la  detección  de  Organismos  Genéticos  Modificados  en  vegetales.  Algunos  ejemplos  de 
aplicaciones del PCR son:  

Investigación: 

‐ Clonación 
‐ Búsqueda de nuevos genes 
‐ Metagenómica 
‐ Análisis filogenéticos 
‐ Análisis de ancestría 
‐ Análisis de expresión diferencial 
‐ etc.  

Diagnóstico: 

‐ Detección  de  mutaciones  puntuales  e  Inserciones/Deleciones  asociadas  a  enfermedades 

genéticas 
‐ Análisis de parentesco 
‐ Cuantificación viral 
‐ Pronóstico  de  enfermedades  mediante  análisis  de  cuantificación  de  la  expresión  de 
determinados genes. 
‐ etc. 

   
Lecturas recomendadas: 
 
1. Mullis  y  colaboradores.  Specific  Enzymatic  Amplification  of  DNA  In  Vitro:  The  Polymerase  Chain 
Reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1986;51 Pt 1:263‐73.).  
2. Saiki  y  colaboradores.  Enzymatic  amplification  of  β‐Globin  genomic  sequences  and  restriction  site 
analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350‐4. Primer artículo 
publicado  dónde  se  describe  método  de  PCR.  Y  se  observa  una  aplicación  directa.  Este  grupo 
incluye a Mullis, y a otros investigadores que participaron en la puesta a punto de la técnica y la 
hicieron posible. Más allá que se considere a Mullis el autor conceptual de la técnica.  
3. Nobel Lecture: Dr Kary B. Mullis, La Jolla, California, U.S.A., for his invention of the polymerase chain 
reaction (PCR) method. 13 octubre 1993.  
4. Wilhelm y Pingoud. Real‐Time Polymerase Chain Reaction. ChemBioChem 2003, 4, 1120‐1128 
5. Espinosa  Asuar  Laura.  2007.  Guía  práctica  sobre  la  técnica  dePCR.  En:  L.  E.  Eguiarte,  V.  Souza  y  X. 
Aguirre (ed Ecología molecular. INE, CONABIO y UNAM.) 
6. Livak y  Schmittgen. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real‐Time Quantitative PCR and 
the 2‐[Delta][Delta]CT Method. Methods,25(4):402‐408, 2001. 
7. Michael  Pfaff.  A  new  mathematical  model  for  relative  quantification  real‐time  PCR.  Nucleic  Acids 
Research, 29(9):2002‐2007, 2001. 
8. Stephen A. Bustin. A‐Z of Quantitative PCR.  International University Line (ISBN 0‐9636817‐8‐8). 
 

Otros recursos interesantes: 
 
1. www. Karymullis.com (página personal de Kary Mullis) 
2. http://www.gene‐quantification.info/  (página  web  realizada  y  mantenida  por  Pfaff  y 
colaboradores con mucho material sobre la PCR en tiempo real). 
3. www.idt‐dna.com  (página  web  de  la  empresa  IDT,  proveedora  de  oligonucleótidos,  se  puede 
encontrar material educativo y software para el diseño de cebadores y sondas). 
4. www.wikipedia.com