EVALUACION DE LA GENOTOXICIDAD

1. Prueba de ames

Los compuestos carcinogénicos inducen a un incremento del número de mutaciones bacterianas,

conduciendo al uso de bacterias para determinar si un compuesto químico presenta una posible
acción carcinogénica. La prueba de AMES es ampliamente usada para este propósito, mostrando
que la correlación entre mutagénesis bacteriana y carcinogénesis es alrededor del 83%.

Procedimiento:
En la prueba de AMES se utiliza una cepa de la bacteria Salmonella typhimurium, la cual es
auxotrófica para histidina (incapaz de crecer en ausencia de histidina) y se expone al agente químico
en un medio deficiente de histidina. Después de incubar se observan las colonias desarrolladas,
mismas que serán mutantes capaces de crecer en un medio sin histidina.

Actualmente dos nuevas características se han incluido en la prueba AMES:

La primera es que la cepa de la bacteria usada carezca de enzimas reparadoras del DNA, lo que
previene la corrección del daño del DNA.

La segunda es la incorporación de preparaciones enzimáticas de hígado junto con el reactivo químico

de prueba, debido a la evidencia de que estas enzimas convierten muchos agentes químicos no
carcinógenos en carcinógenos. De manera muy general la prueba de ames se desarrolla de la
siguiente manera:

1. Marcar cuatro cajas del medio agar-mínimo-glucosa-sales como sigue:

a) Control positivo
b) Control negativo
c) Desconocido
d) Opcional

2. Preparar cuatro tubos conteniendo 2 ml de Top-agar y se mantiener a 45°C.

3. Inocular un tubo de Top Agar con 0.1 ml de Salmonella typhimurium. Mezclar rápidamente
en un agitador vortex, a baja velocidad por 3 segundos (no permitir que se solidifique el
agar).

4. Verter rápidamente el medio inoculado en la caja del control positivo de medio agar-mínimo-
glucosa-sales.

5. Repetir la inoculación con la bacteria, para cada uno de los tres tubos restantes, uno por
uno, vaciando en las cajas restantes.

6. Con unas pinzas estériles colocar un disco de papel filtro estéril en el centro de la caja del
control positivo. Con una pipeta depositar una gota de 4-NOPD sobre el papel para que se
sature. Presionar suavemente sobre el papel con la punta de la pipeta, para que el disco
quede bien adherido al medio.

7. Colocar un disco de papel en la placa del control negativo. Humedecer el disco con agua
estéril.
 8. En la placa del compuesto desconocido colocar un disco de papel impregnado con un
compuesto a probar.

9. Si la sustancia a probar es cristalina, colocar unos cuantos cristales directamente sobre el

agar, en el centro de la caja.

10. Incubar todas las placas a 37°C por 48 horas. Determinamos si hay desarrollo de mutantes
estimulados por los compuestos probados, alrededor del papel filtro.

Medios utilizados:

I. Medio Agar mínimo-glucosa-sales: Se prepara mediante la mezcla de Medio Vogel-Bonner E 50X,

más glucosa sales y agar.

a) Medio Vogel–Bonner E 50X:

H2O destilada 670 ml

MgSO4 .7H2O 10 gr

Ácido cítrico monohidratado 100 gr

K2HPO4 anhidro 500 gr

NaHNH4PO4.4H2O 175 gr

2. Ensayo cometa:

El ensayo cometa, también denominado electroforesis de células individuales, es una técnica rápida,
sensible y relativamente simple, que detecta daños en el ADN a nivel de células individuales. Este
método se basa en la capacidad del ADN, de carga negativa, para migrar a través de un gel de
agarosa en respuesta a un campo eléctrico hacia la carga positiva. El grado de migración de la
molécula depende directamente de los daños en el ADN presente en las células.
Las células son embebidas en agarosa y colocadas en portaobjetos para ser lisadas con detergente
y sales a altas concentraciones y sometidas a electroforesis en condiciones alcalinas. En estas
condiciones, el incremento en la migración del ADN se asocia con elevados niveles de rupturas de
cadena simple.

De manera muy general el procedimiento para el ensayo cometa es:

1. Preparación de laminillas

Los portaobjetos deben ser desengrasados con metanol, lavados exhaustivamente con agua y
secados en la estufa. Posteriormente, aplicar una primera capa de agarosa de punto de fusión
normal. Colocar una segunda capa aplicando una mezcla de suspensión algal y agarosa de bajo
punto de fusión (BPF). Cada alícuota de 30 μL de suspensión algal puede contener aproximadamente
300,000 células, las cuales deben ser mezcladas con la solución de agarosa en agua destilada,
mantenida a 37°C. Esta mezcla celular se deposita sobre los portaobjetos previamente cubiertos con
la agarosa BPF y debidamente rotulados. Inmediatamente se cubren con un cubreobjetos de 24 mm
x 60 mm y se dejan solidificar a 4°C por 30 min. Transcurrido este tiempo, se retira los cubreobjetos
procurando no dañar las capas. Posteriormente, se deposita una tercera capa cubriendo
nuevamente con un cubreobjetos de la misma medida y se deja solidificar también por 15 min a 4
o C. Se retiraron los cubreobjetos y las laminillas se sumergen en el tampón de lisis.

2. Lisis de membranas celulares

La lisis se lleva a cabo por inmersión de las laminillas en una solución buffer. Las laminillas se
sumergen durante 30 minutos a 15°C.

3. Desnaturalización y electroforesis

Después de la lisis, las laminillas se colocan en una celda de electroforesis. Ésta es llenada con buffer
de electroforesis de manera que las laminillas quedan completamente sumergidas en él y se incuban
por 30 minutos a 4°C. Transcurrido este tiempo, se inica la electroforesis a un voltaje de 25V y 300
mA.

4. Neutralización

Una vez finalizada la electroforesis, los portaobjetos se retiran con cuidado de la celda y se colocan
en cajas de plástico para realizar lavados con tampón de neutralización (3 veces durante 5 minutos).
Este tampón se prepara con solución buffer de Tris 0.4 M a pH 7.5 para neutralizar la alcalinidad del
buffer de electroforesis y eliminar posibles restos de detergentes que pudieran interferir en el
proceso de tinción y en la visualización. Después de la neutralización, las laminillas son
deshidratadas colocando en la superficie de cada una 1 mL de metanol durante 3 min. Las laminillas
se guardan en cajas oscuras para evitar la luz directa y a temperatura ambiente.

5. Tinción y visualización

Las laminillas se tiñen justo antes del análisis microscópico. Para esto, se depositan 70 μL de
colorante a una concentración de 5.0 μg·mL-1 sobre cada una de las laminillas y se cubren con
cubreobjetos de 24 x 60 mm. La visualización se realiza utilizando un microscopio de
epifluorescencia, equipado con un filtro de excitación de 540-550 nm, una lámpara de mercurio de
100 W y un filtro de barreras de 590 nm, conectado a una cámara de digital de alta resolución. La
imagen de cada célula se captura empleando el programa Imagen Pro Plus 5.0 y la visualización se
realiza utilizando un objetivo 100x. Se cuentan tanto células viables como no viables para tener un
estimado del porcentaje de daño. Durante todo el procedimiento se evita la luz directa, sobre todo
desde la lisis de las células hasta su visualización. Se trabaja con luz roja tenue para evitar daño
adicional en el ADN. Se utiliza bromuro de etidio en una primera etapa, el cual posteriormente es
sustituido por DAPI (diclorhidrato de 4´6-diamidino-2fenilindol).