Identificación y caracterización de genes involucrados en

mecanismos de resistencia a patógenos virales y fúngicos en papa

cultivada y silvestre.

Las enfermedades causadas por fitopatógenos provocan grandes pérdidas de

producción en el cultivo de la papa. El objetivo de nuestro grupo es identificar y
caracterizar genes candidatos para resistencia a patógenos virales y fúngicos en papa
y desarrollar estrategias de control de dichas enfermedades basadas en Ingeniería
Genética. Asimismo, resulta fundamental conocer los mecanismos moleculares
involucrados en la resistencia para que ésta sea efectiva y duradera.

Director: Dra. Cecilia Vazquez-Rovere

Investigadores participantes: Lic. Natalia I Almasia, Dr Esteban Hopp

Caracterización del mecanismo de resistencia a PLRV y PVY en plantas transgénicas

Existen más de 27 virus descriptos capaces de infectar el cultivo de papa, de los cuales
el virus del enrollamiento de la hoja (PLRV), el virus Y (PVY), y el virus X de la papa
(PVX) son los más perjudiciales y de mayor distribución alrededor del mundo. La
reducción del rendimiento en el cultivo debido a infecciones con PLRV puede alcanzar
un 80-90% en cultivares susceptibles, pero se pueden esperar pérdidas aún mayores
cuando ocurren infecciones simultáneas con PVY o PVX. Por las características
particulares del cultivo, el uso de la ingeniería genética es una alternativa atractiva y
prometedora para la introducción de resistencia a enfermedades virales en papa.

En este contexto en el grupo se han obtenido y caracterizado plantas transgénicas

que expresan la replicasa viral de PLRV que presentaron resistencia a la infección en
condiciones controladas. Se demostró que la resistencia está mediada por RNA y que
el silenciamiento post-transcripcional está involucrado en el mecanismo de resistencia
[Vazquez Rovere y col., 2001; Vazquez Rovere y col., 2002]. Por otro lado, el
descubrimiento de supresores de silenciamiento presentes en casi todas las familias
virales y el hecho de que la supresión del silenciamiento no es específica para un
determinado transgen plantean el desafío biotecnológico de obtener líneas
transgénicas resistentes a diferentes virus que puedan coexistir en el campo. Con este
objetivo se han obtenido también líneas transgénicas que expresan el gen de la
replicasa de PLRV y la proteína de cápside (CP) del virus del mosaico de lechuga
(LMV). Esta última confiere resistencia heteróloga al virus Y de la papa (PVY) (Hassairi
y col., 1998) aunque se desconoce el mecanismo por el cuál la CP otorga dicha
resistencia. En ensayos de desafío en condiciones controladas de invernadero se
encontraron líneas que exhibieron inmunidad a PLRV, líneas que mostraron ausencia
de infección con PVY y líneas que presentaron inmunidad a ambos virus.
Con el fin de caracterizar el mecanismo de resistencia en los distintos grupos de
plantas transgénicas descriptos se está realizando un estudio comparativo de
expresión de los transgenes y se están llevando a cabo ensayos de transformación
transitoria con construcciones que simulan infecciones con PLRV en dos condiciones:
sin infectar e infectadas con PVY (portador de uno de los supresores de silenciamiento
más caracterizados).

Asimismo, con el objetivo de evaluar dichas plantas transgénicas considerando la

performance agronómica y la preservación de la identidad del cultivar (crecimiento,
vigor, rendimiento) se realizó un ensayo de multiplicación y obtención de
minitubérculos de las líneas pre-seleccionadas en colaboración con el grupo del Dr
Ricardo Masuelli del INTA- La Consulta y estableciendo un convenio con el Ing
Guillermo Aguado, productor de papa de Malargüe, Mendoza. El ensayo se realizó en
dicha localidad bajo normas y aprobación de la Comisión Nacional Asesora en
Biotecnología Agropecuaria (CONABIA) dependiente de la Secretaría de Agricultura,
Ganadería, Pesca y Alimentación (SAGPyA). Actualmente se encuentra para su
aprobación en la CONABIA un pedido de reiteración de ensayo de multiplicación y
obtención de tubérculos. Finalmente, el estudio de la interacción entre distintos virus
coinfectantes en condiciones naturales de infección a campo, se realizará en una
tercera etapa sobre las plantas brotadas de los tubérculos obtenidos de este segundo
ensayo.

Estudio de la función y regulación del gen snakin-1 en plantas transgénicas de

Solanum tuberosum

Las plantas han desarrollado una gran variedad de mecanismos de defensa entre los
que se encuentra la producción de péptidos antimicrobianos. Recientemente, se ha
aislado de tubérculos de plantas de papa (Solanum tuberosum cv. Desireé) el péptido
codificado por el gen snakin-1 (SN1) y se ha demostrado que presenta actividad in
vitro frente a patógenos fúngicos y bacterianos de papa y otras especies. (Segura et
al., 1999). La secuencia aminoacídica de SN1 comparte homología con genes
caracterizados de numerosas especies de plantas, sin embargo la función de estas
proteínas no está aún dilucidada.

El objetivo de este proyecto es profundizar en la caracterización estructural y

funcional del gen snakin-1 mediante el estudio de plantas transgénicas.
En la primera etapa de este trabajo se realizó una prospección y estudio de variantes
génicas presentes en especies nativas. Fue posible amplificar por PCR, a partir del DNA
genómico proveniente de las distintas especies de Solanum (S. commersonii,
S.chacoense, S bulbocastanum, S tuberosum cv Kennebec) secuencias homólogas al
péptido antimicrobiano snakin-1. Los valores de identidad de las secuencias
encontrados dentro del género oscilaron entre el 91 y el 98 %. Esta etapa del
proyecto formó parte de un proyecto más amplio, financiado por Comunidad
Económica Europea y en colaboración con el grupo de G Jach (Max Plank Institute-
Cologne) y de E Ritter (Neikker- Vitoria) que abarcó a otros genotipos de especies
silvestres de Solanum encontrando valores de identidad comprendidos entre los
valores descriptos. Finalmente los altos porcentajes de similitud encontrados sugieren
que el gen snakin-1 podría ser un componente importante de las defensas de las
plantas en el género estudiado resultando entendible el alto grado de conservación
dentro del marco de la selección natural.

En una segunda etapa, nuestro grupo ha obtenido y caracterizado líneas transgénicas

que presentan distintos niveles de expresión del gen snakin-1. Con el fin de evaluar
los niveles de protección de dichas líneas frente a infecciones fúngicas se puso a
punto un ensayo de desafío frente a Rhizoctonia solani en condiciones controladas de
invernadero. En estos bioensayos el comportamiento de las líneas sobreexpresantes
en suelo infectado respecto a las plantas no transformadas indicaron que el gen
snakin-1 está involucrado in-vivo en la defensa frente a infecciones fúngicas.
Finalmente, con el objetivo de evaluar el potencial antibacteriano de SN1 se puso a
punto un ensayo de desafío a infecciones provocadas por la bacteria Erwinia
caratovora. Se realizaron dos desafíos en los cuáles se observó un fenotipo tolerante
en las mismas líneas transgénicas que habían mostrado tolerancia en bioensayos de
infecciones fúngicas. Estos resultados indican que el gen snakin-1 es un buen
candidato para conferir protección contra patógenos de importancia comercial en
papa.

En forma paralela, con el objetivo de estudiar la región regulatoria del gen snakin-1
se aisló y secuenció, a partir de DNA genómico de Solanum tuberosum, un fragmento
de 1400 pb río arriba del codón iniciador de la traducción de dicho gen. El estudio in
silico de esta región reveló la presencia de varios elementos regulatorios
posiblemente involucrados en el nivel de expresión y en la posible expresión tejido-
específica del mismo. Con el objetivo de realizar un análisis funcional dicha secuencia
fue clonada río arriba del gen reportero que codifica para la enzima
betaglucuronidasa. En ensayos de expresión transitoria fue posible detectar la
expresión de la proteína reportera en catáfilas de cebolla, ápices, yemas axilares y
tubérculos de papa confirmando que la secuencia aislada corresponde a una región
promotora. Asimismo en ensayos de agroinfiltración de hojas de N. benthamiana fue
posible detectar la expresión de dicha proteína. Actualmente se están llevando a cabo
ensayos de transformación estable de papa y de Arabidopsis con el fin de generar
plantas transgénicas y caracterizar in-vivo dicha región promotora. Se espera con
estos estudios poder determinar los elementos regulatorios responsables de la
expresión temporal y espacial del gen snakin-1 y aportar al conocimiento de la
función y regulación de esta nueva familia de péptidos.