Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
ISSN:0377-9424 / 2005
www.mag.go.cr/rev_agr/inicio.htm www.cia.ucr.ac.cr
Palabras clave: Papa, Solanum commersonii, resistencia a virus, Virus X de la papa, PVX, AFLP, BSA, ELISA.
Keywords: Potato, Solanum commersonii, virus resistance, Potato Virus X, PVX, AFLP, BSA, ELISA.
RESUMEN ABSTRACT
Solanum commersonii es una especie sil- Identification and mapping of AFLPs
vestre de papa considerada como una fuente de linked to the PVX resistance gene in Solanum
genes de resistencia al PVX. Para identificar commersonii. Solanum commersonii has been
marcadores moleculares relacionados con los identified as a source of resistance to PVX.
genes de resistencia a este virus, se realizó un In order to identify molecular markers related
análisis en el que se combinó la técnica de BSA to resistant genes a combination of BSA and
con el uso de AFLPs. Del cruce de 2 padres AFLP techniques was used. An F2 population
heterocigotos y resistentes al PVX, provenien- was obtained from crossing two F1 heterozygous
tes de una F1, se obtuvo una F2. La población parents resistant to PVX. The F2 was inoculated
fue inoculada con el PVXMS y 30 días después with the PVXMS. Thirty days after inoculation,
mediante un ELISA, la progenie fue dividida an ELISA test was carried out, by which the
en individuos infectados y no infectados con progeny was divided into resistant and susceptible
el PVX MS; a estos 2 grupos se les realizó un individuals to the PVXMS; with this information
BSA. El ADN de los individuos resistentes fue a BSA was conducted on both groups. DNA
mezclado aparte del ADN de los individuos from all resistant individuals was subjected to
susceptibles y con la ayuda de AFLPs se logró a BSA aimed by AFLPs. The BSA allowed the
identificar 22 combinaciones de imprimadores identification of resistance-specific bands with
que produjeron bandas específicas relaciona- 22 out of 64 primer combinations. Those primer
das con el carácter de resistencia al PVX. Las combinations selected were used to analyze
combinaciones de imprimadores seleccionadas each individual of the whole F2 population. The
fueron utilizadas para evaluar cada uno de los analysis yielded 63 polymorphic bands related to
individuos de la F2 en forma independiente. resistance; with those bands information and the
Producto de este análisis se obtuvo 63 bandas MAPRF6 program, it was possible to generate
polimórficas relacionadas al carácter de resis- 4 linkage groups with a total of 23 markers,
tencia, cuya información fue introducida en el including some RGAs from another study. In one
programa MAPRF6. Como resultado se obtuvo of the linkage groups, an RGA is co-segregating
4 grupos de ligamiento. Se encontró un RGA, (0 cM) with the extreme resistance gene (Rx)
obtenido en otro estudio que co-segrega (0 cM) locus and AFLPs 42 and 39 are surrounding the
1/ Este trabajo forma parte de la tesis de M.Sc. de 2/ Autor para correspondencia. Correo electrónico:
la autora. Programa de Estudios de Posgrado en robertov@cariari.ucr.ac.cr
Ciencias Agrícolas y Recursos Naturales. Facultad * Centro de Investigaciones Agronómicas Universidad
de Ciencias Agroalimentarias. Universidad de Costa de Costa Rica.
Rica. San José, Costa Rica.
58 AGRONOMÍA COSTARRICENSE
con el locus del gen de resistencia extrema (Rx) y Rx locus at a distance of 22.6 cM or more. These
los AFLPs 42 y 39 que están rodeando el mismo data will provide the foundation for molecular
locus a 22,6 cM o más. La información obteni- marker assisted selection in potato breeding
da será básica para implementar programas de programs.
selección asistida por marcadores moleculares
en el mejoramiento genético.
Imprimador 1 Imprimador 2
s1 as1
5´-GGTGGGGTTGGGAAGACAACG-3´ 5´-CAACGCTAGTGGCAATCC-3´
s1A as1G
5´-GGTGGGGTTGGGAAGACAACGA-3´ 5´-CAACGCTAGTGGCAATCCG-3´
s1C as1A
5´-GGTGGGGTTGGGAAGACAACGC-3´ 5´-CAACGCTAGTGGCAATCCA-3´
s1T as1T
5´-GGTGGGGTTGGGAAGACAACGT-3´ 5´-CAACGCTAGTGGCAATCCT-3´
s1G as1C
5´-GGTGGGGTTGGGAAGACAACGG-3´ 5´-CAACGCTAGTGGCAATCCC-3´
(10mM EDTA, 98% formamida, 0,05% azul de de nucleótidos específicos (E-AAC, E-AAG,
bromofenol y 0,05% xylene cyanol). Cada una E-ACA, E-ACT, E-ACC, E-ACG, E-AGC, E-
de las muestras fue desnaturalizada por 3 min. a AGG) y Mse I (5´-GATGAGTCCTGAGTAA-
90°C y depositada rápidamente en hielo. Se colo- nucleótidos específicos-3´) con 8 diferentes
có 6 μl de cada muestra en un gel de acrilamida al grupos de nucleótidos específicos (M-CAA,
5% y urea 7M. Como guía se utilizó un marcador M-CAC, M-CAG, M-CAT, M-CTA, M-CTC,
de 25 bp (25 bp DNA Ladder, Promega, USA). M-CTG, M-CTT).
La visualización del gel se realizó median-
te tinción con nitrato de plata según las indicacio- Análisis de la progenie
nes del proveedor (Promega, USA) con algunas
modificaciones para reducir la coloración de Producto del BSA fueron seleccionadas
fondo e incrementar la sensibilidad del gel. 22 diferentes combinaciones de imprimadores
(Cuadro 2), para la evaluación independiente de
Segregantes agrupados (BSA) cada uno de los miembros de la población F2.
resistencia en estudio. Mediante esta técnica se polimorfismos, se encontró que hay una alta
generó perfiles de AFLPs utilizando las 64 com- relación entre la cantidad de éstos y las secuen-
binaciones de imprimadores EcoRI/MseI. Cada cias de nucleótidos asociadas a: E-ACA, E-AGC
combinación amplificó de forma reproducible, y M-CAT. Dichas secuencias participaron en la
un promedio de 35 bandas (entre 50 y 500 pb de generación de un total de 33,34, 24,4, y 20% de
tamaño). Considerando cada fragmento de AFLP los polimorfismos obtenidos; respectivamente.
como un locus -sin tomar en cuenta posibles A partir del estudio de toda la progenie
alelismos entre diferentes fragmentos- se analizó se analizó aproximadamente 64200 loci, de los
aproximadamente 2290 loci mediante el BSA. cuales 60200 fueron informativos para el carácter
De las 64 combinaciones de imprimadores de resistencia.
analizadas, 22 mostraron bandas polimórficas En la figura 1 se presenta el patrón de
entre ambos grupos. Sin embargo, de las 22 com- bandas polimórficas encontrado con la combi-
binaciones solo 19 presentaron polimorfismos nación de imprimadores denominada AFLP23
nítidos y reproducibles. En total se encontró 247 (Cuadro 2). En la primera columna se encuentra
bandas polimórficas, las cuales representan un el marcador estándar, utilizado para asignar el
10,77% del total de loci analizados. De estas 247 peso molecular a los polimorfismos. En la segun-
bandas un 6,32% está ligado al carácter de resis- da y tercera columnas se encuentran los grupos
tencia y un 5,06% al carácter de susceptibilidad, segregantes generados a partir del BSA, el grupo
mientras que el resto de las bandas está ligado a resistente (Rb) y el susceptible (Sb), respectiva-
ambos grupos. mente. En las siguientes columnas se encuentran
Posteriormente, para cuantificar el grado los individuos de la progenie, denominados como
de ligamiento entre los marcadores encontrados y susceptibles (S) y resistentes (R), de acuerdo con
el locus de interés, se analizó cada individuo de la los datos obtenidos mediante el ELISA. En el
F2 por separado, con el uso de AFLPs. Se obser- patrón de bandas polimórfico (señalado con una
vó, que para cada combinación de imprimadores, flecha), es posible observar como la banda de
los patrones de bandas obtenidos en el BSA, tanto referencia está presente únicamente en el grupo
para el grupo de individuos resistentes como para de los individuos resistentes y ausente en el grupo
el grupo de individuos susceptibles, correspon- de los individuos susceptibles. Sin embargo, tam-
dían con los patrones de bandas que presentaban bién ocurrió la aparición de esta banda en indivi-
cada uno de los individuos de la F2. duos susceptibles y la ausencia en resistentes; sin
La cantidad de polimorfismos encontrados que esto indicara que la asignación del marcador
en cada combinación de imprimadores fue varia- haya sido errada, lo que ocurre es que disminuye
ble, 5 combinaciones presentaron únicamente 1 la probabilidad de que dicha banda esté ligada
polimorfismo mientras que las 14 restantes pre- directamente al carácter de interés.
sentaron de 2 a 6 polimorfismos. En total estas
19 combinaciones de imprimadores generaron 45 Análisis de ligamiento
polimorfismos de interés (Cuadro 3). Al evaluar
la participación de los diferentes imprimadores, Mediante el uso del programa MAPRF6 se
en forma independiente, en la generación de generó 4 grupos de ligamiento con un total de 23
marcadores moleculares (Figura 2). Estos marca- En el grupo de ligamiento A, donde los
dores representan el 51,1% de los 45 marcadores marcadores moleculares se encuentran más cerca-
polimórficos localizados mediante el estudio del nos al locus de resistencia, se ubicó 5 marcadores
BSA, el 48,8% restante no mostró relación con el moleculares. Como se puede observar en la figura
locus de resistencia (Rx). 2 el alelo de resistencia se encuentra rodeado por
A B
AFLP42 AFLP45
22,6 26,6
Rx RGA2
AFLP19
27,5
AFLP7
25,9 RGA6
27,5
AFLP39 AFLP19
1,7 RGA3
31,8 AFLP33
26,1
AFLP28 AFLP10
AFLP29
C D
AFLP33
13,0
AFLP25
AFLP34 AFLP17
19,7 AFLP4
16,1 AFLP-INTA16
AFLP36 AFLP8 8,0 AFLP-INTA11
AFLP-INTA17
Fig. 2. Grupos de ligamiento para la población de S. commersonii 2100- 78,7 generados con el programa MAPFR6. A)
Grupo de ligamiento 1 formado por 5 marcadores moleculares localizados en las cercanías del locus Rx (resistencia
extrema). B) Grupo de ligamiento 2 formado por 8 marcadores moleculares. C) Grupo de ligamiento 3 formado
por 4 marcadores moleculares y D) Grupo de ligamiento 4 formado por 6 marcadores moleculares. Las distancias
genéticas están dadas en centimorgans (cM).
Oruetxebarria et al. 2000, Terrada et al. 2000, heterocigotos. Sin embargo, en estudios con otros
Davis 1998, Rajamaki et al. 1998, Santa Cruz y métodos de evaluación, como los realizados con
Baulcombe 1993), en nuestro caso fue utilizada el GeneScan® 2.1 y evaluados con el Genotyper®,
para determinar la presencia o ausencia del PVX los AFLPs se comportan como marcadores co-
en plantas inoculadas. Con esa metodología se dominantes y no hay problema en identificar los
identificó las plantas pertenecientes a la progenie homocigotos dominantes de los heterocigotos
en estudio, que presentaban resistencia y suscepti- (Saal y Wricke 2002, Valverde 1998).
bilidad a la infección por la raza PVXMS, que es la
más virulenta dentro del grupo de los PVX. Cabe Análisis de grupos de segregantes (BSA)
destacar, que esta resistencia se dio en la mayoría con AFLPs
de los individuos de la progenie, aún cuando la
infección se realizó con gran cantidad de inóculo El porcentaje de polimorfismos localiza-
viral. Esto confirma el potencial de S. commer- dos en los 2 grupos (resistente y susceptible) fue
sonii como una especie de gran valor tanto por de 10,77%, para un total de 2290 locus analiza-
los genes de resistencia al PVX que posee como dos. Según Saal y Wricke (2002) en promedio,
por otros genes de importancia que ya han sido el porcentaje de bandas, encontradas mediante
identificados (Barone et al. 2001, Valverde 1998, los marcadores AFLP, es bajo en comparación
Zhu et al. 1996, Cardi et al. 1993). con los polimorfismos que pueden ser detecta-
dos mediante técnicas como RFLPs o SSRs. Sin
Segregación de la resistencia al PVXMS embargo, en la literatura se reporta que en una
población de centeno el porcentaje de polimor-
El análisis de segregación se ajustó a una fismos fue de 12,5% (Saal y Wricke 2002), en
proporción 3:1, lo que indica que la resistencia una población de cebada se encontró un 11,3%
al PVXMS es controlada por un único gen y que (Becker et al. 1995) y un 10,1% en una población
ambos padres son heterocigotas. El confirmar la de soya (Keim et al. 1997). Desde luego que tam-
naturaleza monogénica de la resistencia extrema bién hay informes donde los loci polimórficos
a una de las razas mas virulentas que existen, la llegaron a alcanzar el 20,3%, esto sucedió en
PVXMS, hace sumamente atractivo el hallazgo de una población grande de maíz (Vuylsteke et al.
marcadores moleculares que estén estrechamente 1999), lo que confirma la importancia de utilizar
ligados a la resistencia a este virus, ya que las poblaciones de gran tamaño que incrementen y
posibilidades de transferir esta resistencia a las aseguren la presencia de bandas relacionadas al
especies cultivadas de papa son mayores que carácter de interés. Otro factor que en nuestro
cuando se trata de una herencia poligénica. caso influyó directamente sobre la cantidad de
Los individuos segregantes pueden ser polimorfismos encontrados, es que la población
clasificados en 3 clases genotípicas: heterocigota segregante proviene de 2 individuos del mismo
(Rr), homocigota resistente (RR) y homocigota género y especie, lo cual disminuye la probabili-
susceptible (rr). De esta forma, los grupos segre- dad de encontrar una variación alta entre los dis-
gantes se formaron con el ADN de individuos tintos individuos, como puede suceder con segre-
heterocigotas y homocigotas para el grupo resis- gantes provenientes de 2 especies diferentes.
tente e individuos homocigotas para el grupo Con respecto al tipo de imprimador uti-
susceptible. Esta característica de homocigocidad lizado para la obtención de los polimorfismos,
en ambos grupos, facilitó encontrar diferencias es claro que hay algunas secuencias específicas
entre los grupos segregantes. que generan una mayor cantidad, tal es el caso
Al ser los AFLP marcadores de tipo domi- de E-ACA, E-AGC y M-CAT, las cuales forman
nante, en un gel de acrilamida con tinción de parte de la mayoría de los polimorfismos encon-
nitrato de plata no es posible visualizar dife- trados, esta información es de vital importancia
rencias entre los homocigotos dominantes y los para el diseño de imprimadores que puedan ser
utilizados en la evaluación de caracteres asocia- de ésta especie, que faciliten el estudio tanto de
dos a esta especie. factores bióticos como abióticos. También sería
En la búsqueda de marcadores AFLP se posible usar estos marcadores para incrementar
empleó el método de tinción con plata, este per- la densidad del mapa genético de S. tuberosum
mitió visualizar una gran cantidad de fragmentos y de S. commersonii.
amplificados, correspondientes a las combinacio- Con el programa de mapeo MAPRF6, se
nes de imprimadores: EcoRI/MseI, EcoRI/EcoRI logró crear 4 grupos de ligamiento independien-
y MseI/MseI. Este método se seleccionó porque tes, que representan 4 de los 12 cromosomas que
evita el trabajar con radioactividad (marcación poseen las especies diploides de Solanum. Para
radioactiva). Otra ventaja de ésta técnica es que ampliar el número de grupos de ligamiento así
permite rescatar bandas directamente del gel. como la cantidad de marcadores en cada grupo,
Una banda de interés, se puede aislar y poste- es necesario trabajar con poblaciones de mayor
riormente re-amplificar con la combinación de tamaño (Ritter y Salamni 1996). Grupos de liga-
imprimadores que la originó. La banda también miento densos permiten, además, poder asignar
puede ser secuenciada, obteniéndose la informa- estos grupos al cromosoma correspondiente, tal
ción necesaria para el diseño de oligonucleóti- y como se ha hecho para los genomas de papa y
dos específicos, que permitan la amplificación tomate (Tanksley et al. 1992).
directa de la región cromosómica involucrada Cabe recalcar que mediante la utilización
(Meksem et al. 1995). del programa MAPRF6 se logró ubicar un RGA
En éste estudio, los resultados con el méto- que co-segrega con el locus Rx a una distancia
do de AFLP fueron idénticos en las 2 repeticiones de 0 cM. Esto indica que la secuencia específica
realizadas, esto indica la gran reproducibilidad de este marcador podría generar un segmento de
y confiabilidad del método; lo cual también ha nucleótidos idéntico al del carácter buscado. Un
sido demostrado en otros trabajos (Saal y Wricke hallazgo de esta magnitud conduciría a la genera-
2002, Savelkoul et al. 1999, Eujayl et al. 1998, ción de fragmentos específicos, clonados a partir
Brigneti et al. 1997, Folkertsma et al. 1996). de este marcador, que posteriormente podrían
Asimismo, tiene la ventaja de que los productos ser utilizados para generar plantas genéticamente
de amplificación ya analizados pueden ser con- modificadas para la resistencia al PVX.
servados en frío durante varios meses y luego En este mismo grupo de ligamiento en
pueden ser nuevamente tratados mediante elec- el cual se encuentra el RGA, los marcadores
troforesis y visualizados con tinción con plata, restantes se localizaron a distancias superiores
conservándose el mismo patrón de bandas; esto a los 22,6 cM. Si bien es cierto que las distan-
confirma la estabilidad de las reacciones con esta cias menores de 20 cM entre marcadores son
técnica (Vos et al. 1995). Otra ventaja de esta muy deseables, también es cierto que aquellas
técnica es el alto número de loci analizados por superiores son necesarias para generar mapas de
reacción (de 40 a 100 loci); de ésta manera con alta densidad. Para lograr este objetivo, se hace
las 64 combinaciones de imprimadores, se anali- necesaria la utilización de la mayoría de los mar-
zó un mínimo de 64200 loci. cadores localizados en los diversos estudios, para
así tratar de saturar la densidad y completar hasta
AFLPs y RGAs ligados al gen de resistencia donde sea posible los mapas existentes (Gebhardt
extrema a PVX Rxcmm et al. 1999, Eujay et al. 1998, Bendahmane et al.
1997, Mohan et al. 1997, Meksem et al. 1995,
Mediante este estudio se logró la loca- Tanksley et al. 1992).
lización de AFLPs, relacionados al virus X de De los 23 marcadores ubicados en los
la papa, que constituyen un paso importante en grupos de ligamiento mediante el programa
los estudios relacionados con este patógeno y MAPFR6, se encontró 16 ligados en acoplamien-
que permiten la creación de un mapa genético to (el loci está ligado a ambos padres o sea porta
ambos alelos dominantes o recesivos para los 2 2. El BSA es una técnica que facilita la
loci) y 7 ligados en repulsión (el loci solo está identificación de marcadores moleculares
ligado a uno de los 2 padres o sea porta un alelo relacionados con la característica de interés,
dominante y uno recesivo con el set complemen- con lo cual los procesos de fitomejoramien-
tario de alelos en el otro cromosoma) al alelo to se pueden realizar en un menor tiempo.
de resistencia. En trabajos realizados por Davis
(1998) y De Jong et al. (1997), los únicos loci 3. Los marcadores moleculares AFLP pre-
tomados en cuenta son los unidos en acoplamien- sentaron una gran sensibilidad, confiabili-
to al locus Rx ya que la característica buscada dad y fácil manejo.
segrega a partir de ambos padres.
La técnica de AFLP se ha reportado en 4. La presencia de genes de resistencia al
gran cantidad de estudios como una técnica fácil PVX en S. commersonii se pudo corrobo-
y reproducible, además de que permite detectar rar cuando la planta logró contrarrestar el
un gran número de loci en un solo estudio. La uti- ataque de la raza MS del PVX, considera-
lización de los marcadores AFLP en este estudio da como una de las más virulentas.
mostró ser una herramienta que aumentó tanto la
rapidez como la precisión del trabajo. Se determi- 5. Tanto el RGA2 como el AFLP42 y el
nó que es posible detectar hasta 2000 fragmentos AFPL39 son marcadores sumamente
AFLP en 1 ó 2 días, lo cual incrementa la loca- informativos por encontrarse en las cerca-
lización de bandas informativas en cualquier tipo nías del locus de resistencia extrema (Rx)
de estudio de esta naturaleza. al PVX.
Al igual que el mapa de S. tuberosum,
que es uno de los más densos, con alrededor 6. La utilización de la selección asistida por
de 1400 marcadores en solo 684 cM (Rouppe marcadores (MAS) para localizar carac-
van der Voort 1998, Tanksley et al. 1992), se teres de resistencia, es un elemento que
espera que con la creación y crecimiento de los podría acelerar la introgresión de genes de
mapas en otras especies de importancia como S. resistencia en variedades de papa, evitando
commersonii sea posible, en un futuro no muy los largos procesos de selección que con-
lejano, poder relacionar los genes de interés con lleva el mejoramiento convencional.
al menos un marcador molecular en el mapa.
Dicha información sería de gran utilidad en los
programas de mejoramiento asistido por mar- AGRADECIMIENTO
cadores (MAS) para así generar especies con
características superiores a las que poseemos en Este trabajo fue financiado por la Comisión
este momento. Europea en el marco del proyecto INCO-PL
ICA4-CT-2000-30008. “Resistance wild potato
as a source for novel genes mediating resistance
CONCLUSIONES against fungal, viral and nematode diseases”.
También se da un especial agradecimiento al
1. El análisis de ELISA permitió la separa- Dr. Enrique Ritter por su ayuda en el manejo del
ción de los individuos en 2 grupos con- programa MAPFR6.
trastantes para el carácter de interés. Esta
técnica demostró a la vez, una gran con-
fiabilidad por su repetitibilidad en las LITERATURA CITADA
diferentes pruebas, minimizando errores a
la hora de asignar el fenotipo a cada uno de AUSUBEL F., BRENT R., KINGSTON R., MOORE D.,
los individuos de la progenie. SEIDMAN J.G., SMITH J., STRUHL K. 1995.
Current protocols in molecular biology. Vol II. John resistance gene against virus X maps to a resistance
Wiley and Sons, Inc., USA. p. 11.0.3-11.2.21. gene cluster on chromosome 5. Theor. Appl. Genet.
95: 246-252.
BARONE A., SEBASTIANO A., CARPUTO D., DELLA
ROCCA F., FRUSCIANTE L. 2001. Molecular mar- DEWAL G., VON STACKELBERG M., VON BRETHORST
ker-assisted introgression of the wild Solanum com- S. 2000. Methods and application of molecular mar-
mersonii genome into the cultivated S. tuberosum kers in plant breeding. Universidad de Hannover,
gene pool. Theor. Appl. Genet. 102: 900-907. Alemania. 38 p.
BECKER J., VOS P., KUIPER M., SALAMINI F., HEUN DURRANT W., ROWLAND O., PIEDRAS P., HAMMOND-
M. 1995. Combined mapping of AFLP and RFLP KOSACK K., JONES J. 2000. cDNA-AFLP reveals
markers in barley. Mol. Gen. Genet. 249: 65-73. a striking overlap in race-specific resistance and
wound response gene expression profiles. Plant Cell
BENDAHMANE A., KANYUKA K., BAULCOMBE D. 12: 963-977.
1999. The Rx gene from potato controls separate
virus resistance and cell death responses. Plant Cell ESTRADA N. 2000. La biodiversidad en el mejoramiento
11: 781-791. genético de la papa. Ed. CIP, IPGRI, PRACIPA,
COSUDE, CID, IBTA, PROINPA. Bolivia. 372 p.
BENDAHMANE A., KANYUKA K., BAULCOMBE D.C.
1997. High-resolution genetical and physical map- EUJAYL I., BAUM M., POWELL W., ERSKINE W., PEHU
ping of the Rx gene for extreme resistance to potato E. 1998. A genetic linkage map of lentil (Lens sp.)
virus X in tetraploid potato. Theor. Appl. Genet. 95: based on RAPD and AFLP markers using recombi-
153-162. nant inbred lines. Theor. Appl. Genet. 97: 83-89.
BRENES A., RIVERA C., VASQUEZ V. 2002. Principales FAO. 1995. La papa en la década de 1990. Situación y
enfermedades y plagas de la papa en Costa Rica. San perspectivas de la economía de la papa a nivel mun-
José, Costa Rica. EUNED. 120 p. dial. Organización de las Naciones Unidad para la
Agricultura y la Alimentación, Italia. 50 p.
BRIGNETI G., GARCIA-MAS J., BAULCOMBE D.C.
1997. Molecular mapping of the potato virus Y FOLKERTSMA R., ROUPPE VAN DER VOORT J.,
resistance gene Rysto in potato. Theor. Appl. Genet. DE GROOT K., ZANDVOORT P., SCHOTS A.,
94: 198-203. GOMMERS F., HELDER J., BAKKER J. 1996.
Gene pool similarities of potato cyst nematode popu-
CARDI T., IANNAMICO V., D´AMBROSIO F., FILIPPONE lations assessed by AFLP analysis. Molecular Plant
E., LURQUIN P. 1993. In vitro regeneration and Microbe Interactions 9(1): 47-54.
cytological characterization of shoots from leaf
explants of three accessions of Solanum commer- FORAPANI S., CARBONI A., CASTELLANI E.,
sonii. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 34: MANDOLINO G., RANALLI P. 1999. RAPD mar-
107-114. kers for potato germplasm characterization. J. Genet.
& Breed. 53: 143-147.
CIP. 1997. Características generales de los virus y la impor-
tancia de las enfermedades que causan. Barrera C. GEBHARDT C., SCHAFER-PREGL R., OBERHAGE-MANN
(ed.). Manual de Capacitación. Lima, Perú. Fasc. P., CHEN X., CHATOT-BALANDRAS C., RITTER
3.1: 1-8. E., CONCILIO L., BONNEL E., HESSELBACH J.,
SALAMINI F. 1999. Function maps of potato. EBPN:
CIP. 1997. Técnicas en virología de plantas. Salazar L.F. y Phytosfere Proceedings 1999: sv.
Jayasinghe U. (eds.). Manual de Capacitación. Lima,
Perú. s.p. HAMPTON R., BALL E., DE BOER S. 1990. Serological
methods for detection and identification of viral
DAVIS J. 1998. Identification and development of PCR-based and bacterial plant pathogens. A laboratory
markers linked to Eastern Filbert Blight resistance in manual. American Phytopathological Society,
hazelnut. Thesis Master of Science. Oregon State USA. p. 179-196.
University, USA. 53 p.
HAWKES J.G. 1991. The centers of plant genetic diversity
DEAR P. 1997. Genome mapping. A practical approach. in Latin America. The Latin America Perspectives
Oxford Univesity Press, USA. 351 p. 7(1 y 2): 7-9.
DE JONG W., FORSYTH A., LEISTER D., GEBHARDT C., HOISINGTON D., KHAIRALLAH M., GONZALEZ DE
BAULCOMBE D.C. 1997. A potato hypersensitive LEON L. 1994. Laboratory Protocols: CIMMYT
Applied Molecular Genetics Laboratory. 2 ed. Ed. J. 1998. Biological, serological and molecular
México, D. F.: CIMMYT. 50 p. differences among isolates of potato A potyvirus.
Phytopathology 88(4): 311-321.
KARP A., KRESOVICH S., BHAT K.V., AYAD W.G.,
HODGKIN T. 1997. Molecular tools in plant gene- RAJESH P.N., TEKEOGLU M., GUPTA V.S., RANJEKAR
tic resources conservation: a guide to the tech- P.K., MUEHLBAUER F.J. 2002. Molecular mapping
nologies. International Plant Genetic Resources and characterization of an RGA locus RGAPtokin1-2171
Institute. USA. 47 p. in chickpea. Euphytica 128: 427-433.
KAVANAGH T., GOULDEN M., SANTA CRUZ S., RIBAUT J., HOISINGTON D. 1998. Marker-assisted selec-
CHAPMAN S., BARKER I., BAULCOMBE D. tion: new tools and strategies. Science 3(6): 236-239.
1992. Molecular analysis of a resistance-breaking
strain of potato virus X. Virology 189: 609-617. RITTER E, DEBENER T, BARONE A, SALAMINI F,
GEBHARDT C. 1991. RFLP mapping on potato
KEIM P., SHCUPP J.M., TRAVIS S.E., CLAYTON K., ZHU chromosomes of two genes controlling extreme
T., SHI L. 1997. A high-density soybean genetic map resistance to potato virus X (PVX). Mol. Gen.
based on AFLP markers. Crop Sci. 37: 537-543. Genet. 227: 81-85.
LEISTER D., KURTH J., LAURIE D., YANO M., SASAKI RITTER E., GEBHARDT C., SALAMINI F. 1990.
T., DEVOS K., GRANER A., SCHULZE-LEFERT Estimation of recombination frequencies and cons-
P. 1996. Rapid reorganization of resistance gene truction of RFLP linkage maps in plants from
homologues in cereal genomes. Proc. Natl. Acad. crosses between heterozygous parents. Genetics 224:
Sci. USA 95: 370-375. 645-654.
MEKSEM K., LEISTER D., PELEMAN J., ZABEAU M., RITTER E., SALAMINI F. 1996. The calculation of recom-
SALAMINI F., GEBHARDT C. 1995. A high- bination frequencies in crosses of allogamous plant
resolution map of the vicinity of the R1 locus on species with application to linkage mapping. Genet.
chromosome V of potato based on RFLP and AFLP Res. 67: 55-65.
markers. Mol. Gen Genet. 249: 74-81.
ROUPPE VAN DER VOORT J.N.A.M., VAN ECK H.J.,
MICHELMORE R., PARAN I., KESSELI V. 1991. DRAAISTRA J., VAN ZANDVOORT P.M.,
Identification of markers linked to disease-resistance JACOBSEN E., BAKKER J. 1998. An online cata-
genes by bulked segregant analysis: A rapid method logue of AFLP markers covering the potato genome.
to detect markers in specific genomic regions by Molecular Breeding 4: 73-77.
using segregating populations. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 88: 9828-9832. RUSSO P., SLACK S.A. 1998. Tissue culture methods for
the screening and analysis of putative virus-resis-
MOHAN M., NAIR S., BHAGWAT A., KRISHNA T.G., tant transgenic potato plants. Phytopathology 88(5):
YANO M., BHATIA C.R., SASAKI T. 1997. 437-441.
Genome mapping, molecular markers and marker-
assisted selection in crop plants. Molecular Breeding SAAL B., WRICKE G. 2002. Clustering of amplified frag-
3: 87-103. ment length polymorphism markers in a linkage map
of rye. Plant Breeding 121: 117-123.
ORUETXEBARRIA I., KEKARAINEN T., SPETZ C.,
VALKONEN J. 2000. Molecular characterization SALAS A., SPOONER D., HUAMAN Z., TORRES R.,
of Potato virus V genomes from Europe indica- HOEKSTRA R., SCHULER K. HIJMANS R. 2001.
tes limited spatiotemporal strain differentiation. Taxonomy and new collections of wild potato spe-
Phytopathology 90(4): 437-444. cies in Central and Southern Peru in 1999. Amer. J.
of Potato Res. 78: 197-207.
QUERCI M., BAULCOMBE D.C., GOLDBACH R.W.,
SALAZAR L.F. 1995. Analysis of the resistance- SÁNCHEZ-VISCAINO J.M., CAMBRA M. 1987. Técnicas
breaking determinants of potato virus X (PVX) inmunoenzimáticas ELISA en patología animal y
strain HB on different potato genotypes expressing vegetal. Office Internacional des Epizooties. Francia.
extreme resistance to PVX. Phytopathology 85(9): p. 1-57.
1003-1010.
SANTA CRUZ B., BAULCOMBE D. 1993. Molecular
RAJAMAKI M., MERITZ A., RABENSTEIN F., analysis of potato virus X isolates in relation to the
ANDREJEVA J., PAULIN L., TEKARAINEN T., potato hypersensitivity gene Nx. Molecular Plant-
KREUZE J.F., FORSTER R.L.S., VALKONEN Microbe Interactions 6(6): 707-714.
SAVELKOUL P.H.M., AARTS H.J.M., DE HAAS VASQUEZ V. 2002. Dinámica de los virus en el cultivo de
J., DIJKSHOORN L., DUIM B., OTSEN M., la papa (Solanum tuberosum) en la zona norte de
RADEMAKER J.L.W., SCHOULS L., LENSTRA Cartago, efectos en la producción de los virus PVX
J.A. 1999. Amplified-fragment length polymorphism y PVY e identificación de aislamientos de PVY.
analysis: the state of an art. Journal of Clinical Tesis Mag. Sc. San José, C.R., Universidad de Costa
Microbiology 37(10): 3083-3091. Rica. 97 p.
SMITH B. 1995. The origins of agriculture in the Americas. VOS P., HOGERS R., BLEEKER M., REIJANS M., VAN
Evolutionary Anthropology 1995: 174-184. DE LEE T., HORNES M., FRIJTERS A., POT J.,
PELEMAN J., KUIPER M., ZABEAU M. 1995.
TANKSLEY S.D., GANAL M.W., PRINCE J.P., DE AFLP: a new technique for DNA fingerprinting.
VICENTE M.C., BONIERBALE M.V., BROUN P., Nucleic Acid Research 23(21): 4407-4414.
FULTON T.M., GIOVANNONI J., GRANDILLO
S., MARTIN G.B., MESSEGUER R., MILLER VUYLSTEKE M., MANK R., ANTOISE R., BASTIAANS
J.C., MILLER L., PATERSON A.H., PINEDA E., SENIOR M.L., STUBER C.W., MELCHINGER
O., RODER M.S., WING R.A., WU W., YOUNG A.E., LUBBERSTEDT X.C., XIA P., STAM P.,
N.D. 1992. High density molecular linkage maps ZABEAU M., KUIPER M. 1999. Two high-density
of the tomato and potato genomes. Genetics 132: AFLP linkage maps of Zea mays L.: analysis of
1141-1160. distribution of AFLP markers. Theor. Appl. Genet.
99: 921-935.
TERRADA E., KERSCHBAUMER R., GIUNTA G.,
GALEFFI P., HIMMLER G., CAMBRA M. 2000. WILLIAMS J., KUBELIK A., LIVAK K., RAFALSKI A.,
Fully “recombinant enzyme-linked immunosorbent TINGEY S. 1990. DNA polymorphism amplified
assays” using genetically engineered single-chain by arbitrary primers are useful as genetic markers.
antibody fusion proteins for detection of Citrus tris- Nucleid Acids Research 18(22): 6531-6535.
teza virus. Phytopathology 90(12): 1337-1344.
YOUNG N.D. 1996. QTL mapping and quantitative disease
THEILMANN J., MOZAFARI J., READE R., WU Z., XIE resistance in plants. Annu. Rev. Phytopathol. 34:
W., JESPERSON G., BERNARDY M., EASTWELL 479-501.
K., ROCHON D. 2002. Partial nucleotide sequence
and genome organization of a canadian isolate of ZAITLIN M., PALUKAITIS P. 2000. Advances in unders-
Little cherry virus and development of an enzyme- tanding plant viruses and virus diseases. Annu. Rev.
linked immunosorbent assay-based diagnostic test. Phytopathol. 38: 117-143.
Phytopathology 92(1): 87-98.
ZHU B., CHEN T.H.H., LI P.H. 1996. Analysis of late blight
VALVERDE R. 1998. Molecular genetics of frost hardiness disease resistance and freezing tolerance in trans-
and cold acclimation in Solanum species. Thesis genic potato plants expressing sense and antisense
Ph.D. Oregon State University, USA. 122 p. genes for osmotin-like protein. Planta 198: 70-77.