PRUEBA DE LA DNASA FUNDAMENTO El Estafilococos aureus pueden producir reacciones de coagulasa débiles en tubo y en realidad, algunos aislamientos raros pueden ser coagulasa negativos En estas circunstancias es de utilidad realizar otra prueba que tenga correlacién con la Produccién de coagulasa. El Estafilococos aureus produce una Dnasa y una endonucleasa termo-estable. Ambas enzimas hidrolizan acido nucleico (es decir, DNA) MATERIAL A UTILIZAR = Agar Dnasa con azul de toluidina O al 0.005 % PROCEDIMIENTO Sembrar en forma de mancha varias colonias del microorganismo a ensayar. La siembra en mancha es necesaria porque ciertas cepas de S. Aureus no crecen bien en este medio, aunque no es necesario que haya crecimiento. Incubar a 35 C por 24 horas INTERPRETACION Dnasa positivo: El medio y alrededor del inéculo vira del azul intenso al rosa, que indica la hidrélisis del DNA. CONTROL DE CALIDAD Control positive: Staphylococcus aureus Control! negativo: Staphylococcus epidermidisFERMENTACION DEL MANITOL FUNDAMENTO La mayor parte de las cepas de Estafilococos aureus fermentan el manitol en aerobiosis y anaerobiosis con formacién de dcido, a diferencia de los Estafilococos.epidermidis y la mayoria de los otros estafilococos coagulasa negativos. La utilizacién del manito! en anaerobiosis sirve para diferenciar a los Estafilococos aureus de los otros estafilococos coagulasa negativa. El Staphylococcus saprophyticus crece lentamente en anaerobiosis pero no fermenta el manitol. Los estafilococos tienen la capacidad de crecer en medios con Cloruro de sodio, por lo que es excelente Ia utilizacién del Agar Manitol sal para su recuperacién de poblaciones bacterianas mixtas. MATERIAL A UTILIZAR « Caja de agar Manito! sal PROCEDIMIENTO Estriar con una asa de inoculacién la cepa que se esta investigando. Incubar a 35 °C por 18 - 24h, en anaerobiosis. INTERPRETACION Manitol positivo (Staphylococcus aureus): crecimiento intenso de colonias con un halo amarillo, indicando la produccién de acido. Manito! negativo (S. coagulasa negativa): crecimiento débil sin cambio de color del agar. CONTROL DE CALIDAD Control positivo: Staphylococcus aureus Control negativo: Staphylococcus epidermidisSENSIBILIDAD A BACITRACINA Y SXT FUNDAMENTO La sensibilidad a bajas concentraciones del antibidtico Bacitracina y a la combinacién de Sulfometoxazol- Trimetoprim (SXT) proporciona un método sencillo para la identificacién presuntiva de los estreptococos beta hemoliticos de los grupos Ay B; actualmente también se utiliza procedimientos serolégicos Los estreptococos del grupo A son sensibles a concentraciones relativamente bajas de Bacitracina y resistentes a la SXT. Los estreptococos del grupo B son resistentes a ambos antibiéticos. Otros estreptococos muestran sensibilidad variable a la bacitracina, pero son sensibles a la SXT REACTIVOS « Placa de Agar sangre de carnero * Discos comerciales de Bacitracina Taxo A (0,04 U.) Discos de SXT (Trimetoprima-Sulfametoxazol1,25 ug/23,75 ug) PROCEDIMIENTO Tomar 3-4 colonias puras de estreptococos beta hemoliticos con una asa de inoculaci6n y estriar el inéculo en el centro de una mitad de la placa de agar sangre y sembrar por puncién en la profundidad del medio, unas pocas veces para observar la hemédlisis por debajo de la superficie. Diseminar el inéculo con un hisopo estéril o una asa, sobre toda la mitad de la caja. Colocar asépticamente un disco de bacitracina y un disco de SXT, en forma equidistante, sobre el area sembrada. Presionar con suavidad (con una pinza flameada) los discos para que se adhieran al agar. Incubar la placa en una estufa por 18-24 h. a 35 °C. INTERPRETACION SENSIBLE (S): Cualquier tamajio de halo de inhibicién alrededor de cualquiera de los discos. RESISTENTE (R): Crecimiento alrededor de cualquiera de los discos. BACITRACINA SXT IDENTIFICACION s R Presumiblemente grupo A R R Presumiblemente grupo B S/R s No pertenecen a grupoA 6 BLos resultados deben ser informados como: 0 A (Prueba bacitracina-SXT) Estreptococo beta hemolitico, presumiblemente grup‘ e N bacitracina-SXT) Estreptococo beta hemolitico, presumiblemente No grupo A (P. Debido a que estas pruebas se realizan sobre aislamientos de faringe, en que se sospecha presencia de estreptococos grupo A, la presuncién de grupo B por to general no se informa. PRECAUCTON: La capa del inéculo bacteriano debe ser confluente. Un indculo demasiado diluido puede hacer que los estreptococos no grupo A, parezcan sensibles a a bacitracina. CONTROL DE CALIDAD Bacitracina SENSIBLE (S): Streptococcus pyogenes (Grupo A) Bacitracina RESISTENTE (R_: Streptococcus agalactiae (Grupo B)PRUEBA DE CAMP FUNDAMENTO La prueba (reaccién) se basa en el hecho de que los estreptococos del grupo B producen un factor (factor camp) que intensifica y actua de manera sinérgica con la beta hemdlisis producida por la mayoria de las cepas de S.aureus, en un medio de agar con sangre ovina 0 bovina. €l factor camp es una proteina difusible, termoestable, producida por los estreptococos grupo B, que lisa los eritrocitos de oveja o vaca, tratados con la beta hemolisina estafilocécica. MATERIALES e Cepa de Staphylococcus aureus productora de beta hemolisina. * Caja de agar sangre de oveja al 5 % PROCEDIMIENTO Hacer en el centro de la caja, una sola estria en linea recta con el S.aureus. Realizar una estria del estreptococo beta-hemolitico (2 - 3 cm ) perpendicular a la estria del estafilococo, sin tocarla, para que después de la incubacién, el desarrollo de los microorganismos no se junten. Incubar en estufa a 35 °C en aire atmosférico por 18 -24 h. NOTA: Esta prueba se utiliza con frecuencia con las pruebas de Bacitracina y SXT en la misma caja de agar sangre para la identificacién presuntiva de estreptococos. INTERPRETACION Reaccién de camp positiva : Produccién de una caracteristica zona en “punta de flecha” de hemédlisis mayor y completa, localizada en el punto de la estria estafilocécica donde convergen y se superponen los productos de difusién de los 2 microorganismos, factor camp del estreptococo y beta lisina del estafilococo. Cualquier estreptococo betahemolitico resistente a la Bacitracina y a la SXT y Positive en la prueba de Camp, puede informarse como: Estreptococo betahemoliico presumiblemente grupo B por prueba de Camp. CONTROL DE CALIDAD Control Positivo: Streptococcus del grupo B Control Negativo: Streptococcus del grupo APRUEBA DE LA OXIDASA FUNDAMENTO La prueba esta basada en la produccién bacteriana de la enzima oxidasa. La reaccién de la oxidasa se debe a un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacién del Citocromo reducido por el oxigeno molecular, que es el aceptor de electrones de la cadena respiratoria. Los citocromos son hemoproteinas que contienen hierro y actéan como ultimo eslab6n de fa cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (hidrégeno) al oxigeno con formacién de agua 6 peréxido de hidrégeno, segun la especie bacteriana. El sistema citocromo-oxidasa se encuentra en microorganismos aerobios 6 microaeréfilos y anaerobios facultativos, por lo que la prueba de oxidasa es importante para identificar microorganismos que carecen de la enzimas 6 anaerobios obligados (no pueden vivir en presencia de Oxigeno). La prueba tiene su mayor utilidad para diferenciar Enterobacterias (todas negativas) de otros géneros como Pseudomonas, Aeromonas, Neisseria, Campilobacter y Pasteurella (positivas). La prueba de oxidasa utiliza ciertos colorantes como aceptantes artificiales de electrones, sustituyendo al oxigeno. El tetrametil p-fenilendiamina en estado reducido es incoloro, en presencia de citocromo oxidasa y de oxigeno atmosférico, se oxida y forma azul de Wurster. REACTIVO e Solucién de Diclorhidrato de tetrametil p-fenilendiamina al 1% 6 ~ de de dimetil p-fenilendiamina al 1 % Discos comerciales de DIFCO PROCEDIMIENTO Afiadir unas gotas del reactivo a una tira de papel filtro 6 utilizar discos comerciales impregnados con el reactivo desecado, frotar sobre éste una colonia aislada, de un cultivo de 18 -24 horas, . La reaccién de color positivo se produce a los 10 segundos. INTERPRETACION Oxidasa positiva: color morado a purpura en el sitio de la inoculaci6n Oxidasa negativa: no producen ningun cambio de color.UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL / INSTITUTO NACIONAL DE HIGIENE DIPLOMADO EN MICROBIOLOGIA AVANZADA CON MENCION EN BIOLOGIA MOLECULAR BACTERIOLOGIA ANO 2006 PRECAUCIONES No debe realizarse la prueba de oxidasa de colonias procedentes de un medio que contenga azticares, pues su fermentacién acidificara el medio y por lo tanto inhibira la actividad de la citocromo oxidasa. Se recomienda el uso de asa de inoculacién de platino para retirar la colonia del agar y realizar la prueba. Las asas de acero inoxidable o Nichrome, cuando se esterilizan a la llama, sus productos de oxidacién catalizan ta oxidacién del reactivo, originando reacciones falsas positivas. CONTROL DE CALIDAD Control Positivo: | Pseudomona aeruginosa Control Negativo: Escherichia coli