CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

En la HPLC isocrática el compuesto pasa por la columna cromatográfica a través

de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeñas partículas
redondeadas con ciertas características químicas en su superficie) mediante el
bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna. La muestra
a analizar es introducida en pequeñas cantidades y sus componentes se retrasan
diferencialmente dependiendo de las interacciones químicas o físicas con la fase
estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retención de
los componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la
composición de la fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un
compuesto a ser eluido de la columna se denomina tiempo de retención y se
considera una propiedad identificativa característica de un compuesto en una
determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo de
cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la
columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la resolución
de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son el agua, el metanol y
el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o compuestos como
el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los compuestos.
Una mejora introducida en la técnica de HPLC descrita fue la variación en la
composición de la fase móvil durante el análisis, conocida como elución en
gradiente. Un gradiente normal en una cromatografía de fase reversa puede
empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25
minutos. El gradiente utilizado varía en función de la hidrofobicidad del
compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una
función de la afinidad del compuesto por la fase móvil utilizada respecto a la
afinidad por la fase estacionaria.
EL PROCESO CROMATOGRÁFICO

La cromatografía líquida de alta eficacia se encuadra dentro de la cromatografía

de elución. En ésta, un líquido (fase móvil) circula en íntimo contacto con un
sólido u otro líquido inmiscible (fase estacionaria); al introducir una mezcla de
substancias (analitos) en la corriente de fase móvil, cada analito avanzará a lo
largo del sistema con una velocidad diferente que dependerá de su afinidad por
cada una de las fases. Esto supone que después de terminado el recorrido de la
muestra por la columna, cada una de las substancias introducidas en el sistema
eluirá con un tiempo diferente, es decir, estarán separadas.

Clasificación de la cromatografía liquida

Los diferentes tipos de cromatografía líquida se pueden clasificar de diferentes

maneras, pero la forma más habitual de clasificación es la realizada en base a la
naturaleza de la fase estacionaria, ya que es ésta la que impone
fundamentalmente el mecanismo de separación; de este modo, se pueden
enumerar cuatro tipos de técnicas:

- Cromatografía de adsorción (líquido-sólido). La fase estacionaria es un

adsorbente y la separación se basa en repetidas etapas de adsorción-desorción.

- Cromatografía de reparto/adsorción (fases ligadas químicamente). La

separación en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase móvil y la
fase estacionaria.

- Cromatografía de intercambio iónico. Este tipo de cromatografía se da cuando

la fase estacionaria presenta en su superficie grupos ionizados capaces de
retener selectivamente a iones de signo contrario que circulan en la fase móvil.

- Cromatografía de exclusión molecular. La fase estacionaria, en este caso, es

un material poroso de tamaño de poro controlado, que permite la entrada de
ciertas moléculas de manera selectiva, dejando fuera otras de mayor tamaño.

El mecanismo de retención en los dos primeros casos es similar, variando

únicamente el tipo de interacciones que se producen y cual de ellas es la
predominante; por esta razón, en la práctica se realiza otra división de los dos
primeros tipos de cromatografía atendiendo a polaridad de la fase estacionaria:

- Cromatografía de fase normal:

La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las

interacciones que se producen con el soluto son específicas del grupo activo. La
fase estaciona- ria puede ser un sólido adsorbente (sílice o alúmina), o bien, un
 soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que presentan grupos
funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc).

- Cromatografía de fase reversa (inversa):

La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas,

grupos fenilo) y las interacciones que se producen son inespecíficas (efecto
solvófobo).

INSTRUMENTACIÓN

Los equipos de cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) trabajan a

grandes presiones, por lo que son complejos y caros. Sus componentes
fundamentales se aprecian en el siguiente esquema:

 Sistema de suministro y almacenamiento de fase móvil

 Sistema de bombeo
 Sistema de inyección de muestra
 Columna cromatográfica
 Detector

S I S T E M A D E S U M I N I S T R O Y AL M AC E N A M I E N T O D E F AS E
MÓVIL

Garantiza la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones apropiadas,

de modo que se evite la contaminación y la degradación de la misma.
 La fase móvil en HPLC está formada por un disolvente o por una mezcla de ellos,
cada uno de los cuales está contenido en un recipiente, generalmente de vidrio,
aunque en ocasiones se emplean otros materiales, como el politetrafluoroetileno.
Los recipientes deben disponer de tapones que impidan la contaminación por
gases o partículas en suspensión presentes en el aire del laboratorio.
Para evitar flujos inestables, la formación de burbujas o la interferencia de
partículas extrañas los disolventes deben estar filtrados y desgasificados. Esto
puede realizarse mediante un tratamiento previo que elimine los gases y la
materia en suspensión (filtros milipore) o bien integrando sistemas de filtrado y
desgasificación en el equipo de HPLC.

La elución se puede realizar de dos maneras:

 Elución isocrática: cuando se emplea un único disolvente o una mezcla de

disolventes de composición constante.
 Elución en gradiente: cuando se emplea una mezcla de disolventes cuya
concentración se hace variar a largo del proceso, con el fin de modificar la
polaridad de la fase móvil y disminuir el tiempo de separación (es un efecto
semejante al que se produce cuando modificamos la temperatura en
cromatografía de gases).
Los instrumentos modernos están equipados con válvulas de alimentación que
permiten controlar de manera programada la velocidad de flujo de cada
disolvente en cada instante.

SISTEMA DE BOMBEO
 Todos los sistemas HPLC incorporan un sistema de bombeo, con las siguientes
características:

 Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm.

 Mantener un flujo libre de pulsos
 Proporcionar caudales constantes y reproducibles
 Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido
 Ser químicamente inerte y resistente a la corrosión
Las más empleadas son las bombas recíprocas, que consisten en una pequeña
cámara en la que el disolvente es impulsado por el movimiento de vaivén de un
pistón accionado por un motor. Las entrada y salida del disolvente se regula
mediante dos válvulas antiretorno que se abren y cierran
alternativamente, permitendo el paso de fluido en un solo sentido.

Entre las ventajas que presentan se encuentran: pequeño volumen interno, altas
presiones de salida, caudales constantes y compatibilidad con la elución en
gradiente. Sin embargo, generan un flujo pulsado, que se ha de amortiguar para
evitar la generación de ruido.

S I S T E M AS D E I N Y E C C I Ó N D E M U E S T R A

La inyección de un volumen de muestra preciso, y muy pequeño (5-500

μL), debe hacerse a la entrada de la columna en un breve periodo de
tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de circulación de la fase móvil
y evitar el ensanchamiento de banda. La reproducibilidad de la inyección va a
condicionar la precisión de las medidas.
El sistema de inyección está formado por válvulas rotatorias de alta presión de
varias vías manuales o automatizadas. Constan de un doble circuito, uno de los
cuales está conectado al exterior y el otro al propio sistema, pudiendo
intercambiarse de forma rápida y simple entre las dos posiciones:

Válvula de seis vías para un sistema de inyección en HPLC

Con la válvula en la posición de llenado de la izquierda la fase móvil pasa de la

bomba a la columna mientras que la muestra se inyecta en el otro circuito con
forma de bucle. Cuando la válvula gira hacia la posición de inyección de la
derecha, la fase móvil arrastra la muestra hacia la columna. El objetivo de utilizar
este tipo de válvulas es de no interrumpir el flujo de fase móvil a través de la
columna e introducir en el flujo de la misma un volumen de muestra que estará
contenida en un tramo de tubería de volumen fijo.

C O L U M N AS AN A L Í T I C AS E N H P L C

Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque también se

emplean columnas construidas de vidrio y materiales poliméricos. La mayoría de
ellas tienen una longitud entre 5 y 30 cm, y su diámetro interno varía entre 3 y 10
mm. Los rellenos más comunes son de 5 a 10 μm y se mantienen en el interior
del tubo mediante cierres porosos de metal o de vidrio. Actualmente existen
columnas de mayor eficacia y dimensiones más reducidas, que superan los
100.000 platos/metro con un consumo mínimo de disolvente (lo cual abarata
considerablemente el proceso).

P R E C O L U M N AS
Las columnas son delicadas y caras, por lo que se emplean precolumnas, de
composición similar a la de la columna (aunque con un diámetro de partícula de
mayor tamaño para minimizar la caída de presión). Las precolumnas eliminan los
contaminantes, la materia en suspensión y aquellos componentes que se unen
de manera irreversible a la fase estacionaria, de manera que cuando está muy
contaminada, se vacía y se rellena de nuevo o se reemplaza por otra nueva.

C O L U M N AS T E R M O S T AT I Z AD AS

En algunas ocasiones se obtienen mejores resultados calentando la columna, ya

que la viscosidad del disolvente disminuye (se consigue un mayor caudal o se
reduce la presión requerida) y se acortan los tiempos de retención. Sin embargo,
un aumento de la temperatura también puede degradar la fase estacionaria y
reducir el tiempo de vida de la columna, por lo que se deben emplear hornos que
controlen la temperatura de una manera muy precisa (de décimas de grado).

RELLENO DE LA COLUMN A

El relleno empleado en las columnas de HPLC debe ser químicamente

inerte, mecánicamente resistente y poseer un tamaño de partícula bien definido.
Habitualmente está formado por partículas esféricas microporosas de sílice muy
puro, que son permeables al disolvente y presentan una elevada área superficial
(no puede emplearse con fases móviles cuyo pH sea mayor que 8). También se
emplean rellenos de alúmina (u otros óxidos metálicos), grafito poroso o
materiales poliméricos (como estireno-divinilbenceno).
El relleno puede actuar como mero soporte de una fase estacionaria líquida o,
convenientemente tratado, puede intervenir directamente en el proceso de
separación.

DETECTORES EN HPLC

A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay

detectores universales tan fiables como lo son el detector FID o el TCD. Sus
características (sensibilidad, estabilidad, reproducibilidad, respuesta lineal,
tiempo de respuesta corto, fácil manejo) son similares a éstos, aunque no es
necesario que sean sensibles en un intervalo de temperaturas tan
elevado y deben tener un volumen interno mínimo para reducir
el ensanchamiento de banda extracolumna.