Las células Erwinia transformadas fueron capaces de convertir d-glucosa directamente en

2-KLG. Las enzimas endógenas de Erwinia, localizadas en la membrana interna de la

bacteria, convirtieron la glucosa en 2,5-DKG, y la 2,5-DKG reductasa clonada, localizada en
el citoplasma, catalizaron la conversión de 2,5-DKG a 2-KLG (Fig. 13.7). Así, por manipulación
genética, las capacidades metabólicas de dos microorganismos muy diferentes se
combinaron en un solo organismo, que fue capaz de producir el producto final de la vía
metabólica diseñada. Este organismo recombinante debería ser útil como fuente de 2-KLG
para la producción de ácido l-ascórbico, reemplazando así los primeros tres pasos del
proceso utilizado actualmente (Fig. 13.5).
La utilidad comercial del producto del gen 2,5-DKG reductasa clonado
prueba La final podría mejorarse mediante la sustitución de ciertos aminoácidos de la
enzima para crear
mutantes con mayor actividad catalítica y mayor estabilidad térmica. Cuando se aisló por
primera vez el gen de la 2,5-DKG reductasa, no se conocían los residuos de aminoácidos que
contribuyeron al sitio activo de esta enzima.

Sin embargo, a partir de la secuencia de aminoácidos primaria, el modelado por

computadora predijo una estructura enzimática con un barril α / β de ocho cadenas (Fig.
13.8). Esta estructura consistía en ocho cadenas β paralelas retorcidas dispuestas juntas,
rodeadas por ocho hélices α que se unían a las cadenas β a través de bucles de varias
longitudes. Este patrón de plegado se había observado previamente para otras 17 enzimas
cuyas estructuras cristalinas eran conocidas. En comparación con las estructuras de estas
otras proteínas, se identificaron tres de los bucles que podrían estar involucrados en la
unión del sustrato (Fig. 13.8). Usando mutagénesis dirigida a oligonucleótidos, se
construyeron 12 mutantes diferentes, cada uno con un solo cambio de aminoácido en uno
de estos bucles. De los 12 mutantes, 11 produjeron enzimas con una actividad específica de
2,5-DKG reductasa más baja que la de la forma nativa de la enzima. El duodécimo mutante,
en el que el residuo de aminoácido 192 se cambió de glutamina a arginina, tenía
aproximadamente el doble de actividad que la enzima nativa. Estudios cinéticos
reveló que este aumento en la actividad resultó de un aumento de 1.8 veces en el
finalvelocidad máxima de la reacción catalizada por enzimas (Vmáx) y una disminución del
25% en la constante de Michaelis (Km) de la reacción catalizada por enzimas.

La reacción catalizada por la 2,5-DKG reductasa utiliza nicotina reducida amida adenina
dinucleótido fosfato (NADPH) como cofactor. Sin embargo, la concentración celular de
dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido (NADH) suele ser aproximadamente 10
veces mayor que el de NADPH, mientras que el El costo financiero de NADPH es
aproximadamente 10 veces mayor que el de NADH. A reducir el costo de la producción
bacteriana de ácido ascórbico, sería beneficioso Oficial para diseñar una versión de 2,5-DKG
reductasa que utilizara NADH en su lugar de NADPH. La única diferencia estructural entre
NADH y NADPH es la presencia o ausencia de un grupo fosfato unido al sitio 2 'del
resto adenina. De la estructura tridimensional de 2,5-DKG reductasa Complejado con
NADPH, parece que 5 residuos de aminoácidos interactúan
directamente con el residuo de fosfato 2 'de NADPH. Usando casete mutágeno
esis (Fig. 13.9), un total de 40 mutantes diferentes de esta enzima fueron con-
estrujado en cada mutante construido, 1 de los 5 residuos de aminoácidos que
los modelos de computadora sugeridos interactuaron con el residuo de fosfato 2 '
cambiado a un aminoácido diferente. Siguiendo la expresión, purificación,
y caracterización cinética de los 40 mutantes en E. coli, se observó que
El cambio de tres de los cinco aminoácidos seleccionados resultó en aumentos en 2,5-
Actividad de DKG reductasa con NADH como cofactor. En el mejor de los casos, cuando
el residuo de arginina en la posición 238 se cambió a histidina, hubo una
siete veces mejoría sobre el tipo salvaje con NADH como cofactor.
Además, después de combinar dos alteraciones de aminoácidos en una proteína,
una enzima que mostró aún más actividad con NADH incluyó un cambio
del residuo de lisina en la posición 232 a glicina, así como el cambio de
arginina en la posición 238 a histidina. Además, cuando el mejor NADH-activo el mutante
se combinó con un doble mutante que aumentó la unión
1ra prueba 2da prueba 3ra prueba 4ra prueba Final observada. La actividad de la enzima
aislada de la construcción final fue 72 veces mayor que la actividad de la enzima de tipo
salvaje. Ahora queda por ver si esta enzima modificada puede usarse como base para la
síntesis biológica económicamente eficiente del ácido ascórbico.

Síntesis microbiana de añil

Varias bacterias, especialmente Pseudomonas spp., Tienen la capacidad de usar una
variedad de compuestos orgánicos, como naftaleno, tolueno, xileno y fenol, como su única
fuente de carbono. En muchos casos, los genes que codifican las enzimas para la
degradación de estos compuestos orgánicos se encuentran en grandes plásmidos naturales
(típicamente de 50 a 200 kb de tamaño). La investigación sobre estas bacterias a menudo
requiere estudios genéticos y bioquímicos detallados, de modo que los genes que codifican
enzimas que catalizan pasos importantes en la vía puedan ser objeto de modificación.
Ocasionalmente, a pesar del propósito original de un estudio, se realiza un descubrimiento
inesperado pero útil. Por ejemplo, el plásmido NAH7 tiene dos operones separados y
distintos que permiten que las pseudomonas que contienen este plásmido crezcan en el
naftaleno como la única fuente de carbono. Como primer paso hacia la caracterización de
estos genes, el ADN plasmídico NAH7 se digirió con HindIII y los fragmentos se ligaron con
el plásmido pBR322 digerido con HindIII lineal. Este banco de clones se introdujo en las
células de E. coli, y los transformantes se seleccionaron en función de su resistencia a la
ampicilina y su sensibilidad a la tetraciclina. Todos los transformantes fueron probados para
la producción de metabolitos no volátiles que podrían resultar de la hidrólisis de naftaleno
radiomarcado.
Durante la caracterización de uno de los transformantes que tenía un inserto de 10.5 kb y
podía convertir naftaleno en ácido salicílico, se observó que cuando el medio de crecimiento
mínimo contenía triptófano, se volvió azul. Un análisis exhaustivo del color azul reveló que
las células de E. coli transformadas estaban sintetizando el tinte índigo. Esta síntesis se logró
en cuatro pasos (Fig. 13.10):
1. Conversión de triptófano en el medio de crecimiento a indol por la enzima triptófase, que
es producida por la célula huésped de E. coli
2. Oxidación de indol a cis-indol-2,3-dihidrodiol por la naftaleno dioxigenasa, que está
codificada por el ADN que fue clonado del plásmido NAH7
3. Eliminación espontánea de agua.
4. Oxidación del aire para formar índigo.
Por lo tanto, la combinación de enzimas de dos vías diferentes y dos organismos diferentes
dio como resultado la síntesis de un compuesto inesperado, el tinte índigo. Además, la
introducción del gen para la enzima xileno oxidasa, que está codificada en el plásmido TOL,
puede convertir el triptófano en indoxilo, que luego se oxida espontáneamente en añil (Fig.
13.10).
El índigo, un pigmento azul comercialmente importante que se usa para teñir tanto el
algodón como la lana, se aisló originalmente de las plantas pero actualmente se sintetiza
químicamente. En la actualidad, se producen aproximadamente 13 × 106 kg de índigo, con
un valor de más de $ 250 millones, cada año. Indigo, el agente colorante en jeans azules, es
el tinte más vendido en el mundo. La capacidad de producir índigo a partir de bacterias abre
la posibilidad de desarrollar un proceso microbiano comercial eficiente y económico para
su producción. Este proceso evitaría el uso de compuestos peligrosos, como la anilina, el
formaldehído y el cianuro, que son necesarios en la síntesis química del índigo.
A pesar de la naturaleza ecológica de las bacterias de ingeniería para producir añil, en la
actualidad, la síntesis química del colorante es menos costosa, lo que frustra los esquemas
comerciales para producir añil biológicamente. Un enfoque para mejorar la producción de
índigo en E. coli implica diseñar la cepa huésped para producir en exceso el triptófano, la
materia prima para el proceso. Sin embargo, a pesar de la eficiencia mejorada cuando se
usa una cepa de E. coli que produce un exceso de triptófano, el proceso general requiere
una mejora adicional antes de que sea económicamente competitivo con la síntesis
química.

Síntesis de aminoácidos
Los aminoácidos se usan ampliamente en la industria alimentaria como potenciadores del
sabor, antioxidantes y suplementos nutricionales; en agricultura como aditivos para
piensos; en medicina en soluciones de infusión para el tratamiento postoperatorio; y en la
industria química como materiales de partida para la fabricación de polímeros y cosméticos
(Tabla 13.1). Se estima que en 2008 se produjeron más de 2.5 millones de toneladas de
aminoácidos, por un valor de más de $ 9 mil millones, en todo el mundo. El ácido l-
glutámico, que se utiliza en la fabricación del glutamato monosódico potenciador del sabor,
representa aproximadamente la mitad del total. volumen.
En su mayor parte, los aminoácidos se producen comercialmente ya sea por extracción de
hidrolizados de proteínas o como productos de fermentación de Corynebacterium o
Brevibacterium spp., Que son bacterias del suelo gram-positivas no esporulantes que
secretan grandes cantidades de aminoácidos en el medio de crecimiento. Tradicionalmente,
la productividad de estos organismos se ha mejorado mediante la mutagénesis y la
detección posterior de cepas que producen en exceso ciertos aminoácidos. Sin embargo,
esta forma de desarrollar nuevas cepas es lenta e ineficiente. Al usar información
bioquímica detallada sobre las enzimas que están involucradas en la biosíntesis de varios
aminoácidos de importancia comercial, es más rápido aislar y manipular los genes
específicos que codifican los componentes clave de una ruta en particular. Sin embargo,
este tipo de ingeniería genética no es una cuestión simple. Por ejemplo, la (s) vía (s) que
conducen a la biosíntesis de ciertos aminoácidos contiene varias enzimas diferentes, cada
una de las cuales puede ser activada o inhibida por una serie de metabolitos presentes en
la célula. Esto hace que sea difícil saber qué enzima (s) manipular para mejorar el
rendimiento del producto final.
Debido a que la mayoría de los vectores plasmídicos de amplio rango de hospedadores se
replican solo en organismos gramnegativos, es necesario construir vectores de expresión
que sean específicamente adecuados para Corynebacterium y Brevibacterium spp. Tales
vehículos de clonación pueden tomar la forma de vectores lanzadera de E. coli-
Corynebacterium. La porción de E. coli del plásmido podría codificar resistencia al
antibiótico tetraciclina, cloranfenicol o kanamicina. Porque tanto E. coli como
Corynebacterium spp. son susceptibles a estos antibióticos, podrían usarse como
marcadores seleccionables en ambos organismos.
Todavía se necesita un protocolo de transformación eficiente para Corynebacterium
glutamicum, la especie de Corynebacterium que se usa a menudo en estos experimentos.
Además, muchos genes de C. glutamicum no se expresan eficientemente en E. coli. Por lo
tanto, para esquemas de selección que dependen de la expresión génica (por ejemplo,
complementación), todo el banco de clones debe transformarse en C. glutamicum.
Desafortunadamente, la frecuencia de transformación es muy baja cuando el ADN se
introduce en C. glutamicum por transformación directa o por electroporación. Sin embargo,
la transformación efectiva de C. glutamicum se logra cuando se introduce ADN extraño por
conjugación o después de la formación de protoplastos, es decir, después de la eliminación
de la pared celular con lisozima. La transformación de protoplastos es posible mediante la
adición de polietilenglicol para facilitar la absorción de ADN plasmídico exógeno.
Se han realizado algunos progresos en el aumento de la producción de aminoácidos de C.
glutamicum. Por ejemplo, la síntesis del aminoácido esencial triptófano se mejoró al
introducir en las células de C. glutamicum de tipo salvaje una segunda copia del gen que
codifica la antranilato sintetasa, que es la enzima limitante de la velocidad en la vía
biosintética de triptófano normal (Fig. 13.11). El siguiente protocolo describe una forma de
aislar el gen de antranilato sintetasa.
1. Una biblioteca de ADN cromosómico de Brevibacterium flavum se clonó en C.
glutamicum-E. vector de lanzadera de coli e introducido en una cepa mutante de C.
glutamicum que no produjo sintetasa ácida antranílica activa.
2. La cepa mutante no pudo crecer en medio mínimo a menos que se añadiera ácido
antranílico; por lo tanto, los transformantes fueron seleccionados por su capacidad de
crecer en ausencia de ácido antranílico.
3. El vector que portaba el gen de la sintetasa del ácido antranílico se transfirió luego a una
cepa de tipo natural de C. glutamicum.

Se midieron las cantidades de triptófano producidas en las cepas mutantes y de tipo salvaje
de C. glutamicum, una sin y otra con el vector que portaba el gen de la sintetasa del ácido
antranílico clonado (Tabla 13.2). El gen clonado efectivamente restauró la mayor parte de
la capacidad del mutante para sintetizar triptófano. Además, el efecto de agregar este gen
al tipo salvaje C.
glutamicum fue mucho más dramático, con un aumento de la síntesis de triptófano de
aproximadamente 130%. Este nivel de sobreproducción refleja una utilización más eficiente
del material precursor disponible. Por lo tanto, al clonar un gen adicional de una ruta de
biosíntesis de aminoácidos en un organismo, fue posible generar mucho más del producto
final. Un
se logró un nivel aún más alto de producción de triptófano cuando se introdujeron genes
modificados para las tres enzimas clave, 3-desoxi-d-arabino-heptulosonato 7-fosfato
sintasa, antranilato sintasa y antranilato fosforibosil-transferasa, en células C. glutamicum
(Fig. 13.11). Los genes que codifican estas enzimas se mutagenizaron para hacerlos
insensibles a
inhibición por el producto final (inhibición por retroalimentación).

Una alternativa para producir aminoácidos en Corynebacterium y Brevibacterium spp. es

producirlos en E. coli, donde las vías metabólicas y los procedimientos para la manipulación
genética se caracterizan mucho mejor. Su relativa facilidad de manipulación hace que E. coli
sea un organismo huésped atractivo para este tipo de ingeniería metabólica.

Antibióticos
Desde el descubrimiento de la penicilina a fines de la década de 1920, se han aislado más
de 12,000 antibióticos con diferentes especificidades y una variedad de modos de acción
de varios microorganismos. El uso universal de antibióticos para tratar enfermedades
bacterianas ha resultado en una enorme mejora en la salud humana y, sin duda, ha salvado
millones de vidas. La mayoría de los antibióticos más importantes se han aislado de la
bacteria del suelo Gram positiva Streptomyces, aunque los hongos y otras bacterias Gram
positivas y Gram negativas también son fuentes de antibióticos (Tabla 13.3). En todo el
mundo, se producen más de 100,000 toneladas de antibióticos por año, con ventas brutas
anuales de aproximadamente $ 35 mil millones, incluidos los antibióticos utilizados en la
alimentación animal y como promotores del crecimiento animal. El mercado de antibióticos
está impulsado por las ventas de cuatro clases principales de medicamentos: las
cefalosporinas (27%), los macrólidos (20%), las quinolonas (17%) y las penicilinas (17%).
Juntas, estas cuatro clases de medicamentos representan más del 80% de las ventas
mundiales de antibacterianos.
Se estima que cada año se descubren entre 200 y 300 antibióticos nuevos, principalmente
a través de programas de investigación intensivos en mano de obra en los que se examinan
miles de diferentes microorganismos para encontrar aquellos que producen antibióticos
únicos. Sin embargo, con los altos costos de desarrollo y pruebas clínicas, solo se
comercializan los compuestos que muestran una importante promesa terapéutica y
económica. Por lo tanto, solo alrededor del 1 al 2% de los antibióticos recién descubiertos
se agregan anualmente al arsenal para combatir enfermedades. De hecho, la industria
farmacéutica se ha mostrado reacia a invertir en investigación y desarrollo en esta área, y
muchas compañías han abandonado o reducido sus esfuerzos desde 1999. Además, hasta
la fecha, casi todas las mejoras genéticas para antibióticos de importancia industrial. Las
cepas productoras se han logrado mediante el uso de mutagénesis clásica y selección. Si
bien los rendimientos de los antibióticos de muchas cepas han mejorado significativamente:
el hongo productor de penicilina original aislado por Alexander Fleming produjo 2 unidades
por mililitro de cultivo, mientras que las cepas utilizadas hoy sintetizan aproximadamente
70,000 unidades por mililitro de cultivo; esta mejora del rendimiento tomó muchas años y
requirió el uso de mano de obra y recursos financieros considerables. La tecnología de ADN
recombinante puede tener un impacto positivo en este esfuerzo de dos maneras. Primero,
la tecnología puede usarse para desarrollar nuevos antibióticos estructuralmente únicos
con mayores actividades contra objetivos seleccionados y menores efectos secundarios. En
segundo lugar, la manipulación genética se puede utilizar para mejorar los rendimientos de
manera relativamente rápida y económica y, por lo tanto, reducir el costo de producción de
los antibióticos existentes.
Para la manipulación genética de Streptomyces, es esencial que pueda transformarse y que
las células transformadas puedan seleccionarse fácilmente. Sin embargo, a diferencia de E.
coli, las cepas de Streptomyces no existen como células individuales sino como agregados
extendidos llamados filamentos miceliales. La pared celular debe eliminarse para liberar
células individuales (protoplastos) antes de la transformación del ADN (Fig. 13.18). Sin este
paso, no sería posible distinguir las células transformadas de las no transformadas, porque
las colonias visibles en un medio sólido habrían comenzado desde un agregado celular en
lugar de desde una célula individual. Por lo tanto, las colonias que crecieron en presencia
de un antibiótico selectivo contendrían una mezcla de células transformadas y no
transformadas. Sin embargo, como consecuencia de la formación de protoplastos antes de
la transformación, todas las colonias que crecen en presencia de un antibiótico selectivo
contienen solo células transformadas. La absorción de ADN plasmídico en los protoplastos
de Streptomyces se ve reforzada por el polietilenglicol. Después de la transformación, los
protoplastos se colocan primero en un medio sólido para permitir que las paredes celulares
se regeneren y luego se superponen con un medio selectivo que a menudo contiene
neomicina o tiostrepton, que actúan como agentes de selección para las células
transformadas.

Clonación de genes de biosíntesis de antibióticos

La biosíntesis de un antibiótico puede incluir 10 a 30 pasos separados catalizados por
enzimas, por lo que clonar todos los genes para la síntesis de un antibiótico en particular no
es una tarea fácil. Una estrategia para aislar el conjunto completo de genes de biosíntesis
de antibióticos consiste en transformar una o más cepas mutantes que no pueden sintetizar
el antibiótico con ADN de un banco de clones construido a partir de ADN cromosómico de
tipo salvaje. Después de la introducción del ADN del banco de clones en células mutantes,
analiza la capacidad de los transformantes para producir el antibiótico. Luego, el ADN
plasmídico del clon que suministra un gen funcional y un producto génico, es decir,
complementario una cepa mutante, se usa como una sonda de hibridación de ADN para
seleccionar otro banco de clones de ADN cromosómico de tipo salvaje (es decir, uno en el
que el fragmento de tamaño promedio es de alrededor de 10 kb) para clones laterales con
regiones que se superponen a la secuencia de la sonda. De esta manera, los segmentos de
ADN adyacentes y generalmente más grandes que el ADN complementario inicial se pueden
identificar y clonar. Se puede reconstruir un grupo de genes completo a partir de los clones
superpuestos. Si los genes de biosíntesis de antibióticos se agrupan en un solo sitio en el
ADN cromosómico, es probable que los genes adyacentes al gen complementario también
participen en la biosíntesis del antibiótico objetivo. Sin embargo, si los genes de biosíntesis
de antibióticos están dispersos en pequeños grupos en diferentes cambios cromosómicos,
es necesario tener al menos una mutación por grupo de genes para obtener un clon de ADN
que pueda identificar el resto de los genes en el grupo.

El enfoque de complementación se ha utilizado para aislar algunos de los genes para la

biosíntesis del antibiótico undecilprodigiosina de Streptomyces coelicolor A3 (Fig. 13.19).
En este caso, el ensayo de complementación es simple e implica puntuar el color de las
colonias. Las colonias de organismos de tipo salvaje son rojas debido a la presencia del
antibiótico, y las colonias mutantes son de color crema. La complementación produce una
colonia roja (Fig. 13.20).
Además de clonar genes de biosíntesis de antibióticos por complementación, se pueden
emplear estrategias más directas. Una o más de las enzimas clave en una ruta biosintética
pueden identificarse mediante estudios genéticos o bioquímicos y luego purificarse. La
secuencia de aminoácidos N-terminal de la enzima se puede determinar y, con esta
información, se pueden preparar sondas de oligodesoxirribonucleótidos para el gen. Este
enfoque se ha utilizado para aislar el gen de isopenicilina N sintetasa de Penicillium
chrysogenum. Esta enzima cataliza la condensación oxidativa del compuesto δ- (l-α-
aminodipil) -l-cisteinil-d-valina a isopenicilina N, un intermediario clave en la biosíntesis de
penicilinas, cefalosporinas y cefamicinas (figura 13.21).
A pesar de la dificultad, hay una serie de ejemplos de la clonación y transferencia de grandes
fragmentos de ADN que codifican rutas biosintéticas de antibióticos completos. En estos
casos, generalmente es necesario usar un vector que pueda aceptar y mantener fragmentos
de ADN de hasta 100 kb. Para este propósito, los investigadores han empleado cromosomas
artificiales bacterianos que han sido diseñados para replicarse de manera autónoma en E.
coli y, cuando se introducen en Streptomyces, para integrarse en el cromosoma.