3.

Materiales y métodos

Diseño de dsRNA

Selección de la secuencia blanco

En primera instancia, se debe mencionar que el diseño del dsRNA esta basado en la secuencia completa (5´UTR + CDS
+ 3´UTR). Se eligió de 300 a 800 pb de la región seleccionada, la cual se corrió en Gene Runner, donde obtuvo la
secuencia antisenso.

Identificación de dominios conservados

Con el fin de verificar que no se diseñen dsRNA contra dominios conservados, se empleó el uso del banco de dominios
conservados del NCBI > Conservation domains database. Se ingresó al link proporcionado, en donde se introdujo la
secuencia antisentido de 5´a 3´. Posteriormente, se da click en la ventana Full < Submit, esto con el fin de evidenciar
los resultados. Finalmente, se podrá observar una lista de todos los dominios que puedan coincidir con la secuencia
ingresada.

Identificación de secuencias únicas en el transcriptoma

En este paso se ingresa al link proporcionado de BLAST, y se introduce la secuencia la secuencia seleccionada.
Posterior a esto, en Database se seleccionó Reference RNA Sequence, lo cual permitió realizar la búsqueda con
respecto a todo el transcriptoma conocido. En la opción Organism se introdujo el nombre de la especie con la que se
trabajó y al final de la ventana se da click en Algorithm parameters. Posterior a esto, se selecciona la opción Expect
threshold, en donde se cambió el parámetro a 1000 con el fin de que la búsqueda sea menos específica. En la opción
Word size, se cambió el parámetro a 20, el cual permitió buscar cualquier RNA de 20 nucleótidos de parentesco con
el dsRNA. Y finalmente, se deselecciona las opciones Filters y Masking.

Análisis de estructuras secundarias

Con la finalidad de garantizar que el RNA diseñado no constituya estructuras secundarias se hace el siguiente
procedimiento: Primero se abrió el programa Gen Runner, en donde al ir a la pestaña de Analysys se dio click en Oligo.
En la ventana emergente, se ingresó la secuencia de una de las cadenas de RNA diseñado, y se dio click en Done.

Diseño de siRNA

Selección de la secuencia blanco

Antes de empezar con este procedimiento se tomó en cuenta que se deben evitar ciertas secuencias: secuencias las
cuales inducen una respuesta de interferón, los dsRNA tienen mas de 30 nucleótidos de longitud. Otra de las
secuencias que se deben evitar es aquellas que activan la respuesta de receptores tipo Toll y la última secuencia es
aquella que produce toxicidad. Posteriormente, se seleccionó un dsRNA con 21 nucleótidos y que cumpla con el factor
de aspectos termodinámicos.

Procedimientos para el diseño del siRNA

Se ingresó al link proporcionado de sirna y se validó el código de verificación. Se insertó el cDNA de aquella secuencia
que fue seleccionada en un formato FASTA y posterior a esto se verificó los parámetros antes mencionados para dicha
secuencia, y finalmente se dio clic en Search

4. Resultados

Gráfico No. 1: Secuencia del mRNA del gen BRCA-1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar la secuencia de mRNA de BRCA- 1 obtenida de la base de
datos de NCBI, la cual posee un tamaño de 5592 pares de bases.

Gráfico No. 2: Dominios obtenidos de la cadena complementaria 5´a 3´ de mRNA de BRCA-1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar los tres dominios respectivos para la cadena complementaria
5´a 3´ de mRNA de BRCA-1, en donde se evidencia que cada uno de estos tiene una longitud determinada. Sin
embargo, no existe ningún dominio de el par de bases 646 hasta 4071.

Gráfico No. 3: Cadena antisentido seleccionada de la secuenia de mRNA analizada

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar que se seleccionó la secuencia antisentido que va desde 1600
a 2200 pb. Esto se realiza con el fin utilizar estos pares de bases para realizar un análisis de BLAST y de siRNA, con el
fin de evidenciar si se cumplen los parámetros requeridos para la selección de dicha secuencia.

Gráfico No. 4: Secuencias en el transcriptoma del del mRNA de BRCA-1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar cinco tipos de secuencias dsRNA, en donde se evidencia que
cuatros de estas tienen valor E- value de 0 y todas tienen un query corevage de 100%. Mientras que la última
secuencia presenta un query coverage de 3% y un E- value de 1.9.
Gráfico No. 5: Secuencia dsRNA del gen BRCA-1, variante 1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar una secuencia de dsRNA de 601 pb para el gen BRCA-1,
variante 1. Se escogió esta secuencia debio a que los valores de Query cover y E- value eran los adecuados; no
obstante, este es una sceuencia muy larga si se toma en consideración las secuencias de dsRNA que normalmente se
deben usar, que en este caso debía ser 20 nucleótidos pero este gen no poseía una secuencia de este tamaño.

Gráfico No. 5: Secuencia dsRNA del gen BRCA-1, variante 1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar que la secuencia antisenso resultante del programa siRNA at
white, en donde la posición de este siRNA es 136-158. En dicha posición se evidencia que el valo termodinámico es
de -2.5, mientras que el target de miRNA es 172[71].

Gráfico No. 6: Estructura secundaria de la secuencia de mRNA del gen BRCA-1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar que la secuencia seleccionada para realizar el iRNA, tiene una
restructura secundaria Hairpin loops, la cual posee una Temperatura de melting de 65°C.

Gráfico No. 7: Estructura secundaria 2 de la secuencia de mRNA del gen BRCA-1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar que la secuencia seleccionada para realizar el iRNA, tiene una
restructura secundaria Dimers, la cual posee una Temperatura de melting de -45.5°C.

Gráfico No. 8: Estructura secundaria 3 de la secuencia de mRNA del gen BRCA-1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar que la secuencia seleccionada para realizar el iRNA, tiene una
restructura secundaria Bulge loops, la cual posee una Temperatura de melting de -25.8°C.

Gráfico No. 9: Estructura secundaria 4 de la secuencia de mRNA del gen BRCA-1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar que la secuencia seleccionada para realizar el iRNA, tiene una
restructura secundaria Internal loops, la cual posee una Temperatura de melting de -44.4°C.

Gráfico No. 10: Estructura secundaria 5 de la secuencia de mRNA del gen BRCA-1

Descripción del gráfico: En el gráfico se puede observar que la secuencia seleccionada para realizar el iRNA, tiene una
restructura secundaria Match sites, la cual posee una Temperatura de melting de -52.5°C.