EQUIPO: 8

PRÁCTICA No. 1: FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL NITRÓGENO EN RAÍZ DE FRIJOL Díaz Rendón Juan Omar
(Phaseolus vulgaris L.) Flores Padilla Dominic
Rubio Cuevas Alan Fermín
Sánchez Gómez Sonia Alejandra
MARCO TEORICO Sánchez Trueba Damaris Yoshira

Frijol (Phaseolus vulgaris L.)

Taxonómicamente, el frijol corresponde a la especie del género Phaseolus. Su nombre completo es Phaseolus vulgaris
L., asignada por Linneo en 1753, a la tribu Phaseoleae, subfamilia Papilionaideae, familia Leguminosae y al orden Rosales.
(Valenciano & Chávez, 2007).
Planta herbácea perteneciente a la familia de las fabaceae, de tallos delgados y débiles, cuadrangulares, a veces rayados
de purpura, hojas trifoliadas, ápice acuminado, laterales más o menos tubulosos y estandarte redondeado.
Alcanza a medir una altura de 50 a 70 cm y sus raíces se desarrollan con una raíz pivotante principal y muchas
ramificaciones. En su interior, las semillas pueden ser o blandas, ovales o redondeadas (según la variedad), poco
comprimidas y de color café o negro, o moteadas café, rojo o negro. (SAGARPA, 2017 - 2030).

Condiciones edáficas y clima

Las temperaturas óptimas del cultivo del frijol oscilan entre 10 y 27 °C, pues es muy susceptible a condiciones extremas
y debe sembrarse en suelos de textura ligera y bien drenada.
El pH adecuado fluctúa entre 6.5 y 7.5, ya que dentro de estos límites la mayoría de elementos nutritivos del suelo
presenta su máxima disponibilidad; no obstante, se comporta bien en terrenos que tienen un pH de 4.5 a 5.5. (SAGARPA,
2017 - 2030).

Frijol en el consumo

El frijol común (Phaseolus vulgaris L.) es la leguminosa más importante para consumo humano en el mundo, es una
fuente importante de proteína, calorías, vitaminas del complejo B y minerales. (Valenciano & Chávez, 2007).

Harina de sangre

Los desechos del rastro, como la sangre y el contenido ruminal, provocan graves problemas de contaminación ambiental.
Para resolver el problema de contaminación producida por la disposición inadecuada de la sangre y el contenido ruminal,
se han desarrollado diversos sistemas de manejo que permiten procesar tales desechos, convirtiéndolos en
subproductos aprovechables, derivados del procesamiento final del ganado. En este contexto, la sangre y el contenido
ruminal pueden ser utilizados como fertilizantes orgánicos o en composta. (Jeavons, 1991).

Composición de la sangre, plasma líquido y paquete celular bovino (g/100 ml)

Componente Sangre Plasma (60%) Paquete celular (40%)

Agua 80-85 90-92 70-78
Proteínas 15-18 6-8 25-29
Lípidos 0.15 0.5-1 0.2
Carbohidratos 0.1 0.08-0.12 0
Sales minerales 1 0.8-0.9 Trazas
Otras sustancias 0.55 0.2-0.3 0
Materia seca 15-20 8-10 22-30
Nitrógeno

Favorece el crecimiento de la parte “verde”: brotes y hojas. Algunas especies fijadoras de nitrógeno son las
pertenecientes a la familia de las leguminosas (alfalfa, habas, arvejas) ya que concentran este nutriente en sus raíces y
en el suelo a través de bacterias alojadas en nódulos. Un exceso de nitrógeno provoca un crecimiento exuberante, pero
los tejidos se vuelven esponjosos, blandos y por ende muy propensos a las enfermedades.

También pueden aparecer quemaduras en las hojas. Para compensar un exceso de nitrógeno puede incorporarse paja,
por su alta relación carbono / nitrógeno. Cuando hay carencia de nitrógeno las hojas se muestran amarillentas, pudiendo
llegar a la gama de los rojo-violáceos. (Huerta, 2005).

Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN)

El nitrógeno es el elemento más abundante en la atmosfera terrestre y sin embargo es una fuente nutritiva muy escasa.
Esta paradoja se debe a que el nitrógeno atmosférico es inerte y no puede ser aprovechado por la mayoría de los seres
vivos. El nitrógeno únicamente se incorpora a los sistemas biológicos cuando ha sido fijado o combinado con ciertos
elementos de hidrogeno o el oxígeno, es decir, en forma de nitrato o amonio.

La fijación biológica esta relegada a organismos procariontes que son capaces de reducir el nitrógeno molecular a
amoniaco tanto en vida libre como en simbiosis con organismos superiores. (Martínez – Molina & Velázquez, 1991).

La mayor parte del nitrógeno fijado en los ecosistemas terrestres se realiza mediante la asociación simbiótica de
bacterias de los géneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium y Mesorhizobium (Rhizobium para
generalizar) con plantas leguminosas. En gran parte de estas asociaciones simbióticas se tiene interés para la agricultura.

Sin embargo, aunque los rendimientos de la FBN se han incrementado considerablemente en los últimos años, al
trasladar estos conocimientos a la agricultura práctica, se detectan limitaciones a la fijación de nitrógeno y la producción
final del grano, desde el punto de vista fisiológico, bioquímico y estructural en la simbiosis Rhizobium – leguminosa.
(Mercedes, Maria, & Felipe, 2002).

La fijación biológica de nitrógeno (FBN) representa una alternativa a la fertilización nitrogenada ya que puede paliar
muchos de los efectos negativos que dicha fertilización produce tanto a nivel medioambiental, como a nivel sanitario.
(Newton, 2000).

Dentro de la fijación global, la FBN aporta la mayor parte del nitrógeno fijado a los ecosistemas terrestres. La FBN global
se estima en unos 275 millones de toneladas de nitrógeno al año. De esta cantidad 30 millones de toneladas se fijan por
causas naturales como descargas eléctricas, erupciones volcánicas, etc.

70 millones de toneladas se fijan mediante fijación industrial, a través del proceso Haber – Bosch en el cual se gasta una
gran cantidad de energía procedente del petróleo y 175 millones de toneladas mediante fijación biológica.

De estos 175 millones, 35 millones se fijan mediante fijación en vida libre y 140 millones de toneladas se fijan mediante
fijación simbiótica (Sevillano y Rodríguez – Barrueco, 1987). De estos 140 millones de toneladas, 105 millones son fijados
por especies de interés para la agricultura. (Mercedes, Maria, & Felipe, 2002).
Fijación de Nitrógeno en el frijol

El frijol como planta leguminosa fija nitrógeno atmosférico, por lo que usualmente se cree que no necesita de
fertilización nitrogenada. Sin embargo, para alcanzar altos niveles productivos la fijación biológica parece no ser
suficiente y es necesario aplicar nitrógeno adicional.

El frijol tiene en sus raíces pequeñas protuberancias llamadas nódulos, que son producidas por bacterias del género
Rhizobium. Estas bacterias tienen una cualidad: transforman el nitrógeno atmosférico en forma asimilable para la planta
y están presentes de forma natural en los suelos agrícolas. Pero su número puede variar según el manejo que el
agricultor le haya dado a la parcela.

Muchas veces las cepas nativas de Rhizobium no son tan eficientes para fijar todo el nitrógeno que la planta necesita.
Esto aplica especialmente a las nuevas variedades de frijol que necesitan de altas cantidades de nutrientes para alcanzar
su máximo potencial de rendimiento. En estos casos se necesita de fertilización nitrogenada. (REDSICTA, 2012).

OBJETIVO GENERAL

Realizar un experimento en el que influya la fijación biológica del nitrógeno para la germinación de frijoles.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Investigar las propiedades de la semilla de frijol y las condiciones en las que germina.
 Establecer las condiciones del suelo necesarias para que germine la semilla del frijol.
 Programar rutina para los cuidados del frijol geminado y plantado.
 Comparar la germinación de los frijoles en condiciones de suelo específicas (con harina de sangre y sin ella).
 Medir la cantidad de nitrógeno en tierra por el método Kjeldahl.
CRONOGRAMA

Cronograma de Actividades
Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre
Actividad
1 2 1 2 3 4 1 2 3 4 5 1 2 3 4 1 2
Titulo
Investigación de propiedades
Germinación de semillas
Conseguir fijador de N2 (sangre)
Secado de sangre
Conseguir macetas y tierra
Incorporar sangre a tierra (mitad)
Trasplantar a macetas
Cuidados de plantas
Preparar reactivos / Digestión
Destilación / Titulación
Análisis de resultados
Discusión
Conclusiones

METODOLOGÍA

Obtención de la harina de sangre:

 Verter 500 ml de sangre fresca de res en un vaso de precipitados de 1 L.

 Calentamiento suave hasta conseguir la coagulación de la seroalbúmina y al mismo tiempo agitar (85 °C
durante media hora).
 Dejar reposar.
 Eliminar la parte liquida (decantación o filtración).
 Secar el residuo sólido en estufa a 70 °C.
 Enfriar.
 Envasar.

Para la germinación:

 Obtención de los frijoles en buen estado y lavarlos.

 Colocar algodón en un frasco de Gerber para vigilar el crecimiento de las raíces y poner un frijol por frasco
(no hasta el fondo).
 Humedecer el algodón con agua (evitar en exceso).
 Colocar los frascos en donde les pueda dar luz solar.
 Humedecer el algodón cada día.
 Esperar a que germinen (7 a 14 días).

Acondicionamiento del suelo:

 Conseguir 2 macetas.
  En una maceta solo agregar tierra y, en la otra tierra más el compuesto orgánico (harina de sangre), ya que
contiene una alta concentración de nitrógeno.

Trasplantar semillas germinadas:

 Plantar dentro de cada maceta previamente acondicionada 10 frijoles germinados.

 Colocar las macetas en un lugar donde puedan recibir la luz solar.
 Regar las macetas periódicamente (cada día y en cierta hora establecida).
 Registrar cambios de crecimiento en cada grupo.

Una vez que se cumpla el lapso determinado de tiempo, se procederá a calcular la concentración de nitrógeno en las
muestras por el método de Kjeldahl, de la siguiente manera:

MATERIAL

 2 matraces de digestión Kjeldahl de 125 ml

 2 matraces Erlenmeyer de 250 ml
 1 matraz volumétrico de 100 ml
 1 matraz volumétrico de 50 ml
 1 matraz volumétrico de 25 ml
 2 vasos de precipitados de 250 ml
 1 bureta de 25 ml
 4 pinzas de tres dedos con nuez
 1 pinza de mariposa
 6 soportes universales
 2 pro pipetas
 1 pipeta graduada de 10 ml
 1 pipeta graduada de 1 ml
 1 frasco gotero de 100 ml (ámbar)
 1 piseta con agua destilada
 6 cuerpos de ebullición
 1 par de guantes de asbesto
 4 mangueras
 1 tina
 1 agitador de vidrio
 2 tapones
 Hielo

EQUIPO

 Equipo digestor Kjeldahl

 2 equipos Quickfit
 Balanza analítica
 2 mantillas de calentamiento
 2 bombas para pecera
REACTIVOS

 Azul de metileno al 0.1% diluido en alcohol al 96%

 Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 96%
 Ácido bórico al 2%
 Ácido clorhídrico 0.1N (solución valorada)
 Hidróxido de sodio al 32%
 Ácido sulfúrico concentrado
 Catalizador para la digestión

MÉTODO

ELABORACIÓN DE REACTIVOS

1) Mezcla indicadora (Shiro-Tashiro). Preparar por separado los indicadores azul de metileno al 0.1% y el rojo de metilo
al 0.1% diluidos en alcohol al 96%. Mezclar 0.05 ml de azul de metileno con 0.1 ml de rojo de metilo con 20 ml de alcohol
etílico al 96%, aforar a 100 ml (alcohol), almacenar en un frasco gotero ámbar.

2) Ácido bórico al 2%. Disolver 2.5 g de ácido bórico (en cristales) en 125 ml de agua destilada, transferir a un frasco
tapado.

3) Ácido clorhídrico 0.1N. Preparar 50 ml y valorar con una solución de NaOH de la misma normalidad.

4) Hidróxido de sodio al 32%. Disolver 48 g de perlas de hidróxido de sodio en 350 ml de agua destilada. Almacenar la
solución en un frasco tapado.

5) Ácido sulfúrico concentrado.

6) Catalizador para la digestión. Mezclar 2.5 g de dióxido de selenio (SeO2), 100 g de sulfato de potasio (K2SO4) y 20 g de
sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 * 5H2O).

PROCEDIMIENTO

DIGESTIÓN

1.- Pesar exactamente 1 g de la muestra en cada matraz Kjeldahl, cuidando que no se adhiera a las paredes o al cuello
del matraz.
2.- Añadir 25 ml de H2SO4 y aproximadamente 4 g de catalizador.
3.-Someter a digestión en el equipo Kjeldahl bajo una campana de extracción (con el matraz ligeramente inclinado)
usando baja temperatura al inicio y aumentando el calor a medida que procede la digestión, rotando los matraces de
vez en cuando para asegurarse de que se digiera toda la muestra. La digestión terminará cuando el color de la muestra
sea azul-verde claro. El proceso tomará aproximadamente 180 minutos.
4.- Enfriar los matraces durante unos 4 minutos para que no se endurezca la muestra.
5.- Añadir 7 ml de H2O destilada cuidadosamente a cada muestra digerida. Mezclar, permitir enfriar y almacenar.
6.- Lavar los matraces.

DESTILACIÓN
7.- Armar dos equipos Quickfit.
8.- Colocar en una tina, agua con hielo y las bombas de pecera.
9.- Conectar las mangueras a las bombas y refrigerantes (para tener circulando agua fría todo el tiempo).
10.- Agregar 50 ml de H2O destilada a cada matraz balón (con 3 cuerpos de ebullición), después añadir las muestras
digeridas, y otros 50 ml de H2O destilada.
11.- Añadir 80 ml de la solución de NaOH a cada matraz balón (lentamente). Las muestras digeridas se tornarán oscuras
(azul grisáceo o café oscuro).
12.- Colocar un matraz Erlenmeyer con 60 ml de la solución de H3BO3 a la salida de cada refrigerante (con un trozo de
manguera sumergido en el H3BO3), agregar 3 gotas del indicador Shiro-Tashiro.
13.- Encender las mantillas de calentamiento (regulando la temperatura) y las bombas. Colectar aproximadamente 40
ml del destilado (10 -20 minutos).
14.- Apagar las mantillas de calentamiento y desconectar las bombas.
15.- Retirar los matraces Erlenmeyer, desmontar el equipo y lavar los matraces balón varias veces con H2O destilada.

TITULACIÓN

16.- Titular las muestras con HCl 0.1 N. Un color violeta indica el punto final de la titulación.

CÁLCULOS

 Reactivos

 50 ml HCl 0.1 N
𝑔
𝑚∗𝑧 𝑁∗𝑃𝑀∗𝑉 (0.1 𝑁)(36.45 ⁄𝑚𝑜𝑙)(0.05 𝐿)
𝑁 = 𝑃𝑀∗𝑉 𝑚= 𝑧
= 1
= 0.18225𝑔

𝑚 𝑚 0.18225 𝑔
𝜌= 𝑉
𝑉= 𝜌
= 𝑔 = 0.1627 𝑚𝑙
1.12 ⁄𝑚𝑙

(0.1627 𝑚𝑙)(100 %)
𝑉= (36.6 %)
= 𝟎. 𝟒𝟒 𝒎𝒍 𝑯𝑪𝒍

 150 ml NaOH 32 %

(32 𝑔)(50 𝑚𝑙)

𝟑𝟐 𝒈 𝑵𝒂𝑶𝑯 𝑒𝑛 100 𝑚𝑙 𝐻2 𝑂 + 𝑚= (100 𝑚𝑙)
= 𝟏𝟔 𝒈 𝑵𝒂𝑶𝑯

 125 ml H3BO3 2 %

(2 𝑔)(25 𝑚𝑙)
𝟐 𝒈 𝑯𝟑 𝑩𝑶𝟑 𝑒𝑛 100 𝑚𝑙 𝐻2 𝑂 + 𝑚= (100 𝑚𝑙)
= 𝟎. 𝟓 𝒈 𝑯𝟑 𝑩𝑶𝟑

 100 ml Shiro-Tashiro

𝟎. 𝟏 𝒎𝒍 𝒓𝒐𝒋𝒐 𝒅𝒆 𝒎𝒆𝒕𝒊𝒍𝒐 + 𝟎. 𝟎𝟓 𝒎𝒍 𝒂𝒛𝒖𝒍 𝒅𝒆 𝒎𝒆𝒕𝒊𝒍𝒆𝒏𝒐 𝑒𝑛 100 𝑚𝑙 𝐴𝑙𝑐𝑜ℎ𝑜𝑙 𝑒𝑡í𝑙𝑖𝑐𝑜 (96 %)

 Porcentaje de N2

𝐺𝑎𝑠𝑡𝑜 𝐻𝐶𝑙 𝑔
% 𝑁2 = [(𝑁𝐻𝐶𝑙 ) ( ) (14 ⁄𝑚𝑜𝑙 ) (100)]
𝑉𝑜𝑙. 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

En donde:

NHCl = Normalidad del HCl

Gasto HCl = Mililitros de HCl gastados
Vol. Muestra = Mililitros de la muestra titulada
14 g/mol = Peso molecular del Nitrógeno

RESULTADOS

Muestra Gasto HCl

Sin harina de sangre 0.2 ml
Con harina de sangre 1.1 ml

ANALISIS DE RESULTADOS

 Muestra sin harina de sangre

0.2 𝑚𝑙 𝑔
% 𝑁2 = [(0.1 𝑁) ( ) (14 ⁄𝑚𝑜𝑙 ) (100)] = 𝟎. 𝟐𝟓 %
110 𝑚𝑙

 Muestra con harina de sangre

1.1 𝑚𝑙 𝑔
% 𝑁2 = [(𝑁𝐻𝐶𝑙 ) (100 𝑚𝑙) (14 ⁄𝑚𝑜𝑙 ) (100)] = 𝟏. 𝟓𝟒 %

Comparación de Resultados
1.8 1.54 %

1.6
1.4
1.2
1
% N2

0.8
0.6
0.25 %
0.4
0.2
0
0.2 1.1
Gasto HCl (ml)
DISCUSIÓN

Como el tiempo de crecimiento de las semillas de frijol no es el mismo, se notó una diferencia entre planta y planta
germinada; independientemente de la altura de cada planta, la diferencia se vio en el color y textura (rigidez) del tallo.
Desde este punto del proyecto, la presencia de un “elemento extra” en esa composta (con harina de sangre) se
manifestó.

El siguiente paso era averiguar si el “elemento extra” era Nitrógeno; según la teoría las raíces del frijol (específicamente
en sus nódulos) contienen a las bacterias fijadoras Rhizobium Leguminosae, por lo que hay que demostrar de manera
cuantitativa si la simbiosis realmente se realizó.

Hay que tomar las muestras de tierra lo más cercanas a las raíces de nuestras plantas, para poder tener una muestra
representativa a fin de nuestro proyecto.

Durante el proceso de destilación tuvimos un accidente en la muestra “sin harina de sangre”: la temperatura de
ebullición se sobrecalentó y hubo un escape de muestra, después de verificar que los miembros del equipo se
encontraban bien, limpiamos nuestra área de trabajo y procedimos a continuar.

Se obtuvo un destilado bajo en nitrógeno, resultado al cual le adjudicamos: tanto el escape de muestra en el accidente,
como a que solo era tierra (sin la harina de sangre).

La muestra “con harina de sangre” mostró un resultado superior en nitrógeno; afortunadamente el proceso de destilado
no tuvo contratiempos.

CONCLUSIONES

 Se demostró la fijación biológica del nitrógeno en plantas de frijol por la simbiosis de bacterias del género
Rhizobium Leguminosae.

 Se establecieron las condiciones adecuadas para el crecimiento de la planta de frijol.

 Al adicionar un compuesto nitrogenado al suelo, la fijación de este elemento es más notoria.

 El porcentaje de nitrógeno se puede obtener de forma confiable por el método de Kjeldahl.

REFERENCIAS

(SAGARPA, 2017 - 2030)

(Valenciano & Chávez, 2007)
(Huerta, 2005)
(Jeavons, 1991)
(Mercedes, Maria, & Felipe, 2002)
(REDSICTA, 2012)
Trabajos citados
Fundacion produce sinaloa. (29 de 09 de 2008). Fertilizacion en frijol. Obtenido de
https://www.fps.org.mx/portal/index.php/notas/589-fertilizacion-en-frijol

Huerta. (2005). Clase 5 Fertilizantes y Abonos. Obtenido de

https://www.unida.org.ar/Virtuales/Huerta/Clase%205%20Fertilizantes%20y%20Abonos.pdf

Jeavons. (1991). PRODUCCIÓN DE FRIJOL (Phaseolus vulgaris L.) Y RÁBANO (Rhabanus sativus L.) EN HUERTOS
BIOINTENSIVOS EN EL TRÓPICO HÚMEDO DE TABASCO. Obtenido de
http://www.scielo.org.mx/pdf/uc/v24n1/v24n1a2.pdf

Mercedes, P., Maria, N. d., & Felipe, M. R. (2002). Fijacion biologica de nitrogeno: factores limitantes. Obtenido de
http://digital.csic.es/bitstream/10261/128283/1/Fijaci%C3%B3n%20Biol%C3%B3gica391%28MC%20F%20Pasc
ual%29.pdf

REDSICTA. (2012). Fertilización nitrogenada del frijol. Obtenido de http://repiica.iica.int/docs/b3634e/b3634e.pdf

SAGARPA. (2017 - 2030). frijol MEXICANO. Obtenido de

https://www.gob.mx/cms/uploads/attachment/file/256428/B_sico-Frijol.pdf

Valenciano, E. F., & Chávez, A. F. (2007). Estudio de las propiedades fisico químicas y calidad nutricional en distintas
variedades de frijol consumidas en Mexico. Obtenido de
https://www.redalyc.org/pdf/2033/203350918008.pdf