Preparación de agar nutritivo

Agar nutritivo

Extracto de carne 0.3gr

Peptona 1.0gr

Dextrosa 0.5gr

Cloruro de sodio 0.5gr

Agar 1.5gr

Agua destilada 100ml

 En un matraz Erlenmeyer de 200ml conteniendo 100 ml de agua destilada

se disolverá primero el agar y posteriormente los ingredientes previamente

pesados.

 Se someterá a la acción del calor para garantizar una completa disolución

del agar con una constante agitación hasta llegar a la ebullición.

 Se ajustara el pH con los papeles indicadores, si se encuentra el pH por

debajo de 7.0 se agregara gota a gota la solución de NaOH hasta llegar al

pH adecuado.

 Si el pH se encuentra por encima de 7.4 se agregara gota a gota una solución

de HCl hasta obtener el pH adecuado.

 Se tapara el matraz con un tapón de algodón, se esterilizara al autoclave a

121 ° C por 15 minutos. Se controlara la esterilidad en incubación a 37°C

por 24 horas.

 Una vez estéril se repartirá en placas Petri previamente esterilizadas y se

dejara en reposo para que solidifique.

1.1. Preparación de las placas Petri:

 Las placas Petri deben estar esterilizadas antes de ser usadas por lo que se

lavara perfectamente con escobillón y detergente. Se enjuagara las placas

Petri con abundante agua corriente.

 Se escurrirá el exceso de agua y se enjuagara el material con agua destilada,

por las paredes interiores. Se dejara escurrir el material sobre una toalla o

papel de envoltura, no se secara el material por otro medio.

 Una vez seco el material, se procedera a envolver las placas Petri con papel

kraft y se llevara a incubación a 37°C por 24 horas.

1.2. Preparación de las placas de Petri con agar nutritivo:

 Se sacara las placas Petri de su envoltura de papel kraft y se separara las dos

mitades, con mucho cuidado se procedera a verter la solución de agar

caliente en la mitad inferior de la placa Petri, donde se formara una capa por

encima del fondo de la placa.

 Se volverá a colocar la mitad superior de la placa Petri, se dejara en reposo

durante 30 minutos a 2 horas, hasta que la solución de agar se enfríe y se

endurezca.

1.3. Colocar caja de Petri en mesas de trabajo del laboratorio

 Se colocara dos placas Petri en la superficie de cada mesa de trabajo a una

distancia de 1m cada una, sabiendo que existen dos mesas de trabajo por

cada laboratorio.

 Permanecerán abiertas durante un intervalo de tiempo de 15 a 30 minutos,

permitiendo la sedimentación de los microorganismos.

  Posteriormente las muestras se incubaran a una temperatura de 37°C

durante 48 horas.

 Al término de la incubación se realizara el conteo mediante las Unidades

Formadoras de Colonia (UFC) por tiempo de exposición y área de la caja

de muestreo

 Una vez realizado el conteo, se procederá al aislamiento en medios

selectivos, incubadas a una temperatura de 37ºC durante 48 horas

1.4. Preparación del medio selectivo de agar sangre

 Se seguira los pasos anteriores de la preparación del agar nutritivo,

habiéndose solidificado la solución de 100ml. Se colocara en calor con el

fin de disolver.

 A una temperatura aproximadamente de 45°C hasta que el calor sea

soportable en el dorso de la mano.

 Se agregara sangre citratada o desfibrinada de carnero, una cantidad de 5ml

con una pipeta estéril.

 Se procederá a agitar por rotación suavemente con el fin de obtener una

buena mezcla y evitar la formación de burbujas.

 Se repartirá la mitad del contenido en placas Petri estériles cerca al mechero

y se dejara solidificar.

 Este medio tiene un color normal rojo-cerezo homogéneo.

1.5. Sembrado por el método de dispersión-agotamiento

  Previamente serán seleccionadas las muestras provenientes del agar

nutritivo que serán sembradas en agar sangre.

 Se esterilizara el asa de platino sometiéndola a la llama directa de un

mechero de alcohol.

 Se tomara una asada de muestra del agar nutritivo y se colocara en un

extremo del medio sólido de agar sangre.

 Se realizara movimientos del zig zag hacia el centro de la placa, se

esterilizara nuevamente el asa de platino.

 Se girara la placa 60° y se hara el mismo procedimiento anterior con el asa

de platino.

 Se rotulara e incubara a 37 °C durante 24 horas, con la finalidad de obtener

colonias aisladas.

1.6. Observación macroscópica de colonias

Se deberá tener en cuenta las siguientes características del crecimiento

bacteriano para la selección adecuada de las colonias:

Especie Forma Color Tamaño

Pseudomonas Colonias brillantes Azul-verdoso, 1 a 3 µm

aeruginosa de borde continuo u provoca

ondulado con un hemolisis

centro opaco

Staphylococcus Colonias lisas, Amarillo- 0.8 a 1 μm

aureus brillantes y naranja a dorado

convexas.
Streptococcus Colonias tipo cúpulas Coloración 1 a 2 µm

pyogenes grisácea

1.7. Observación microscópica para identificación.

 Se preparara un frotis en una lámina portaobjetos con la mezcla bacteria del

medio de cultivo seleccionado, con un asa previamente esterilizada.

 Se dejara secar a temperatura ambiente o con la ayuda de un mechero.

 Se cubrirá el material con unas gotas de azul de metileno y se dejara actuar

el colorante durante 3-5 minutos.

 Se lavará a chorro suave, y se dejara secar la lámina al calor del mechero.

 Se observara al microscopio con objetivo de inmersión, agregando una gota

de aceite de cedro.

Especie Forma Color Tamaño

Pseudomonas Bacilos en cadenas Gris plata 0.5 a 3.8 mm

aeruginosa o aislados

Staphylococus Racimos, grandes Opacas, blancas o 3 a 5 mm

aureus cremosas, convexas amarillentas, beta

de bordes lisos hemolíticas.

Streptococcus En cadenas de Transparentes u 2 a 3 mm

pyogenes variable longitud opacas alfa o beta

hemolíticas.

2. Instrumentos
2.1.Materiales:

 Preparado 1000ml de agar nutritivo y 500ml de agar sangre.

 Frascos con agua destilada.

 30 unidades de Placas Petri plástico o vidrio.

 3 unidades de asas de platino

 Láminas para objetos y laminillas cubreobjetos.

 Colorante azul de metileno u otro.

 Aceite de cedro.

 Mechero de alcohol.

 Mascarillas descartables.

 Guantes para examen.

 01 Microscopio óptico marca Olympus CX 21.

 01 Incubadora en microbiología (bacteriológica) marca Fisher Scientific*

2.2. Técnicas de análisis de datos (estadísticas)

Se contara todas las colonias que se desarrollaron en las placas Petri, se hara

el cálculo de las colonias por ml, se multiplicara por el volumen de diluyente

empleado y dividirlo entre cm2 de la superficie. Los resultados se expresaran

como UFC/cm2.