UNIVERSIDAD DE ORIENTE

ESCUELA DE CIENCIAS DE LA SALUD

“DR. FRANCISCO BATTISTINI CASALTA”
DEPARTAMENTO DE BIOANÁLISIS

INMUNOFLOURESCENCIA (IFA), QUIMIOLUMINISCENCIA

(QL), ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA (ECL).

Profesor (a) Integrantes:

Lic Alizar Abou Farkhr. Flor Díaz C.I: 20.263.113
Estefani Cuba C.I:25.914.457
Andrea Cabello C.I:23.498.215
Lucianny Peña C.I 18.591.865
Rosisbelia Suarez C.I:23.733.12

CIUDAD BOLIVAR, NOVIEMBRE DE 2019

INMUNOFLOURESCENCIA (IFA)
Técnica que se utiliza para la detección de estructuras subcelular que nos permiten
estudiarlas con la utilización de anticuerpos acoplados a fluorócromos, definiendo este
como sustancias que emiten un fotón cuando son excitados por un fotón incidente. Las
radiaciones absorbidas (invisibles al ojo), son transformadas en luz visible, o sea de una
longitud de onda mayor a la incidente. Ejemplo de estos: Rodamina 6G, Rodamina B,
Fluoresceína.

La inmunofluorescencia consiste en conjugar colorantes fluorescentes con

anticuerpos, exponiendo después este conjugado a los anticuerpos o antígenos
correspondientes en cortes de tejidos, frotis de microorganismos o de células, o cultivo de
tejidos en capa única. Cuando la reacción es positiva y se expone a la luz ultravioleta se
producirá fluorescencia observable bajo el microscopio de inmunofluorescencia. Se realiza
un acople a un anticuerpo de un fluoróforo o una enzima que cataliza una reacción por la
cual se emite fluorescencia.

FUNDAMENTO

La inmunofluorescencia es una técnica de biología molecular que consiste en

incubar una muestra con un anticuerpo que detecte la molécula o componente que
queramos detectar. Dicho anticuerpo lleva unida una molécula fluorescente
(inmunofluorescencia directa) o bien es reconocido por un segundo anticuerpo marcado
fluorescentemente (inmunofluorescencia indirecta).

Se basa en la explotación del fenómeno biológico de la reacción de interacción entre

un anticuerpo y un antígeno. Tiene que ver concretamente con la visualización o detección
de esta reacción al excitar las moléculas fluorescentes a una longitud de onda específica.

Entre los tintes o moléculas fluorescentes más empleados para algunas técnicas de
inmunofluorescencia están el isotiocianato de fluoresceína (FITC), el isotiocianato de
tetrametilrodamina-5 y 6 (TRITC), muchas cianinas como Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 y tintes
denominados Alexa Fluor®, como el Alexa Fluor®448.
METODOS DE INMUNOFLOURESCENCIA

a) INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA: Esta técnica se vale de un

anticuerpo primario marcado
con un fluorócromos que
reacciona con el antígeno
dentro de la muestra. Es un
procedimiento de un solo paso
y comprende un solo anticuerpo
marcado. La visualización de
estructuras no es ideal a causa de la poca emisión de la señal. Se utiliza para la
detección de antígenos en los microorganismos o los tejidos utilizando el
anticuerpo primario marcado La muestra problema donde se quiere determinar
el microorganismo, bacteria, o tejido se extiende en un porta, se añade el
anticuerpo marcado y tras lavado, se observa al microscopio de fluorescencia.
Se utiliza por ejemplo para el diagnóstico de: - Bacterias patógenas en heces -
Virus de la rabia en cortes histológicos del cerebro - Virus en secreciones
respiratorias.

b) INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA: Esta prueba tiene una

sensibilidad mayor que los métodos
directos y con frecuencia recibe el nombre
de técnica del emparedado o de la capa
doble. En vez de conjugar un fluorócromos
con un anticuerpo específico dirigido contra
el antígeno de interés, el fluorócromos se
conjuga con un anticuerpo secundario
dirigido contra el anticuerpo primario. Por
medio de esta técnica se determina los parámetros de ANA (Lupus eritematoso
sistemático).
 Se usa para la detección de anticuerpos en suero : basado en la reacción de
los anticuerpos de la muestra con el antígeno unido a la superficie del
portaobjeto o soporte. Se utiliza por ejemplo para el diagnóstico de: -Treponema
pallidum (FTA-ABS) -Toxoplasma gondii -Coxiella burnetii -Rickettsia conorii
–Leishmania.

EQUIPOS PARA LA INMUNOFLOURESCENCIA

1.) Microscopio de Fluorescencia: Descubierto en
1908 por Köhler y Siedentopf, y se basa en que una
sustancia natural en las células o un colorante fluorescente
aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo
parte de la energía absorbida como rayas luminosas.

CONSTITUCION FUNDAMENTAL:

Fuente luminosa (lámpara de mercurio o halógena): Debe

emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta en el límite del espectro visible, que atraviesan
el material de la preparación de la misma forma en que lo hace un microscopio óptico
común

Objetivos: Suelen ser de cuarzo ya que el vidrio absorbe la radiación ultra-violeta.

Filtros: Retienen la radiación ultra-violeta, peligrosa para el ojo humano, dejando pasar
solamente la radiación visible, que no es peligrosa. Existen un gran número de juegos de
filtros de excitación y de emisión para los diferentes fluorocromos:

*El de excitación: Ubicada entre la fuente de luz y el preparado. Permite el paso de ondas
de luz con longitud que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado
exclusivamente por la luz azul y produzca emisión de luz fluorescente.

*El de barrera: Ubicada antes del ocular para prevenir daños retinianos que podrían ser
causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo dicrómico. Corta completamente la
luz de excitación no deseada, es decir selecciona la longitud de onda de emisión del
fluorócromos.

*Espejo Dicroico: Permite la separación de la luz de excitación y la fluorescencia.

Posicionado en 45° respecto al eje óptico, la longitud de onda más corta es reflejada y la
longitud de onda más larga lo atraviesa.

2.) Lionheart FX and Cytation:

El Microscopio Automatizado Lionheart ™
FX es un sistema compacto de microscopía
inclusivo, para una amplia gama de
aplicaciones y flujos de trabajo en captura
de imágenes. Ofrece magnificaciones de
hasta 60x de aire y 60x y 100x con
objetivos de aceite de inmersión, en canales
de fluorescencia, campo claro, campo claro
a color y contraste de fases para un alcance máximo en aplicaciones. Una cubierta
de control de ambiental opcional proporciona incubación hasta 40°C y contención
efectiva para el control de atmosferas de CO2 / O2, una cámara de humedad
optimiza las condiciones para aplicaciones de largo desarrollo de captura de
imágenes en células vivas, y un inyector de dual de reactivos opcional facilita los
procesos de inyección / lectura en ensayos cinéticos rápidos. Lionheart FX y Gen5
juntos forman el concepto de Microscopía Aumentada™ - la automatización de la
captura de imágenes, procesamiento, análisis y desarrollo de imágenes y datos listos
para publicación.

3.) Kit de Inicio de Ensayo de Herida (Scratch Assay):

Ayuda a automatizar los ensayos de migración celular y ensayos de cicatrización de
heridas, junto con el microscopio
automatizado Lionheart FX de BioTek o
 el Lector Multi-Modal y de Captura de Imágenes Celulares Cytation 5.

4.) HELMED: Equipo automatizado de inmunofluorescencia que permite el montaje

de hasta cuatro pruebas con cuatro sustratos diferentes
y cuatro conjugados diferentes. Permite operar hasta un
máximo de 10 analizadores con un solo computador.
El sistema permite el procesamiento automatizado de
portaobjetos IFA.

UTILIDAD DE LA INMUNOFLOURESCENCIA EN INMUNOLOGIA

Es de gran utilidad para el diagnóstico de enfermedades de piel y mucosas, como el lupus

eritematoso, enfermedades ampulares auto inmunitarias (pémfigos, pemfigoides, etc.) y
vasculitis (inflamaciones de los vasos sanguíneos).

QUIMIOLUMINISCENCIA

La quimioluminiscencia es un método de lectura que se basa en el principio de

emisión luminosa a través de una reacción (Enzima-Sustrato). Es una variante del método
precedente en el que se utiliza como marcador una sustancia quimioluminiscente, es decir,
una sustancia que produce luz cuando es excitada por la energía química. Las emisiones de
luz de la sustancia marcada se miden con un detector de luz.

Fundamento de la quimioluminiscencia
 La emisión de luz es causada por los productos de una reacción específica química, en
la cual se involucran las siguientes sustancias según el sistema automatizado que sea
utilizado: éster de acridina, peróxido-ácido, hidróxido de sodio, fosfatasa alcalina. En el
caso de esta reacción el agente quimioluminiscente es el éster de acridina que es oxidado
por el peróxidoácido y el hidróxido de sodio.

Tipos de quimioluminiscencia

 Quimioluminiscencia directa: Este ensayo es de tipo heterogéneo y, se caracteriza

por la emisión de luz visible debido a una reacción química producida por la
oxidación del éster de acridina empleado como marca. Se realizan ensayos tanto por
competencia como por “sandwich”. Las partículas paramagnéticas empleadas en
estos ensayos ofrecen una máxima superficie de contacto (100 veces más que los
métodos convencionales) y una rápida separación magnética, con una mínima unión
inespecífica.

 Quimioluminiscencia indirecta amplificada: Existe otro método

quimioluminiscente, el cual emplea como marca una enzima, la fosfatasa alcalina
que cataliza la hidrólisis del éster de fosfato del substrato adamantil diaxetano (el
cual es un compuesto estable) para formar constantemente un anión inestable el cual
produce una fuerte emisión de luz. Esta señal luminosa prolongada en lugar del
relámpago de luz de los otros métodos quimioluminiscentes permite hacer
numerosas lecturas con el consiguiente aumento en la precisión del ensayo.

Equipos utilizados para inmunoensayo por quimioluminiscencia

El CL-1000i de Mindray: es un equipo de inmunoensayo por quimioluminiscencia que

utiliza el método de separación magnética de cuatro fases con control exacto de la
temperatura, y cuenta con un sistema de detección de tubo fotomultiplicador para un
desempeño consistente. El analizador ofrece un menú completo que incluye diferentes
 pruebas de función tiroidea y de fertilidad, diagnóstico de anemias, diabetes y
enfermedades infecciosas, y marcadores cardíacos y óseos.

El sistema tiene un carrusel de reactivos sin paradas, refrigerado a 2°C~8°C, con 25

posiciones; y un mezclador vórtex no táctil que elimina el riesgo de contaminación. Las
muestras se cargan y descargan continuamente en los bastidores. Las sondas para muestras
y reactivos, con motores de jeringa controlados, proporcionan una aspiración de alta
precisión y detección del nivel de líquidos y de coágulos y están protegidas contra
colisiones.

Los reactivos líquidos, fáciles de usar, que vienen en paquetes para 50 o 100 pruebas,
son escaneados por un lector de código de barras incorporado o externo. El dispositivo
utiliza volúmenes de muestras de 10µl a 200µl, ofrece un rendimiento hasta de 120 pruebas
por hora y es capaz de procesar hasta 60 muestras en una tanda.

IS 12000 Analizador automático de quimioluminiscencia:

 Tipo de funcionamiento: automático

 Configuración: de pie

 Tecnología: por quimioluminiscencia

 Tipo de paciente: para el hombre

ARCHITECT i1000SR de laboratorio Abbott. Equipo automatizo para análisis de

muestra provenientes del hombre.

PATHFAST Analizador automático/compacto que permite realizar mediciones de alta

sensibilidad y alto rendimiento en combinación con pruebas de panel.

Equipos semi-automatizados
 ABCLIA-1: de Immunoassay de la quimioluminescencia del Semi-automóvil es un
analizador quimioluminescente small-sized, fácil de utilizar con un diseño de uso fácil. Con
una operación estable, un luminometer sensible con una amplia gama dinámica diseñado
para leer exactamente reacciones luminiscentes del resplandor en 96 placas.

Características Físicas del Equipo:

 Las luces de indicador de estado permiten divulgar directamente el estado del

instrumento.
 El cajón se abre para recibir la placa de la muestra.
 Interruptor: El interruptor CON./DESC. está situado en el panel trasero del
instrumento. Conexión del cable eléctrico.
 El cable eléctrico conecta en el panel trasero del instrumento. Las placas de la
muestra se colocan en la bandeja para la lectura.
 El formato de la placa para esta versión es el pozo 96. Ningún otro formato del pozo
no puede ser
HITACHI CLA-1 de span diagnostics: Análisis específico de OPTIGEN IgE

Características:

 Tipo de funcionamiento: semiautomático.

 Configuración: de mesa.

 Tecnología: por quimioluminiscencia.

 Tipo de paciente: para el hombre.

Utilidad de la quimioluminiscencia en la inmunología

 Medición de los niveles de hormonas, por ejemplo, de los de hormonas tiroideas o de

estrógenos.
 Medición de ciertos metabolitos (sustancias producidas o utilizadas durante el
metabolismo) en suero cuya cantidad o presencia son indicativas de daño celular, como
 las troponinas (marcadores biológicos miocárdicos), que indican la existencia de
un infarto de miocardio.
 Detección de virus como los de los diferentes tipos de hepatitis.
 Detección del cáncer o de células tumorales.
 Detectar la exposición a agentes infecciosos, por ejemplo los de la rubéola o la
toxoplasmosis en mujeres embarazadas o en personas inmunodeprimidas.
 Detección de metabolitos cuya presencia o exceso en la sangre son indicadoras de
problemas fisiológicos.
 Medir los niveles de medicamentos, drogas de abuso y toxinas en sangre.
 ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA

Al igual que en la quimioluminiscencia, en este inmunoensayo se generan (a partir de

sustratos estables) productos capaces de emitir fotones al pasar de un estado intermedio
inestable y energeticamente superior, a uno de energia inferior mas estable; aunque en este
caso su origen es electroquimico y no una reaccion enzimatica.

En este inmunoensayo no competitivo, el anticuerpo utilizado recubre unas

microparticulas imantadas, que tras la formacion del complejo antigeno-anticuerpo, se fijan
a un electrodo por magnetismo. Dicho anticuerpo esta conjugado con un marcador
(derivado del rutenio) capaz de emitir fotones cuando se aplica una pequeña diferencia de
potencial sobre el electrodo.

En cualquier caso la energia luminica se sigue detectando en un fotomultilpicador.

Las ventajas atribuibles a la quimioluminiscencia, lo son tambien a esta tecnica, pero

ademas ofrecen una facil separacion entre las fases ligada y libre.

FUNDAMENTO DE ECLIA

En la superficie de los electrodos de platino se forma un campo eléctrico por la utilización

de un voltaje determinado Los componentes(ester de Nhidroxisuccinimida de un complejo
de Rutenio (bpy3) sufren excitación por perdida de un electrón en su configuración
electrónica transforma latripropilamina en radical TPA, debido a la perdida de un electrón y
un protón catión de rutenio reacciona de esta manera con el radical TPA, produciendose un
fenómeno llamado reducción A través de está reducción se produce la emisión de fotones a
una longitud de onda de 620 nm.

El cual el fotomultiplicador los captay transforma en absorbancia. Está señal final

resultante lo enfrenta al factor de calibración para encontrar una concentración conocida
con COI

METODOS UTILIZADOS POR LA ECLIA

1.) Competitivo: para heptenos de bajo peso molecular

2.) Sándwich: para analitos de alto peso molecular
 3.) Formación de puentes: para determinar IgM e IgE.

EQUIPOS Y MATERIALES UTILIZADOS EN ECLIA

COBAS e411: El sistema de inmuno ensayo Cobas e 411 de ROCHE Diagnostics

es un analizador multicanal, automatizado y de acceso aleatorio, para la realización
de análisis inmunológicos y endocrinologicos.
Equipo diseñado para realizar
determinaciones in vitro cuantitativas, de una
amplia variedad de analitos.
El equipo usa Tecnología
Electroquimioluminiscencia (ECL).

REACTIVOS: Los reactivos del equipo cobas

e 411 y las otras generaciones de la marca
ROCHE, se ordenan de la siguiente forma:
- • Microparticulas paramagneticas unido a streptavidina
- • Ag/Ac unido a biotina
- • Ag/Ac unido a ritenio.
MATERIALES:
- Pipetas de hamiltom
- Pipeta s/r
- Pipeta de procesamiento.
- Gripper.
- Cámara de incubación.
- Cámara de reactivos.
- Set pro cell, clean cell
- Copas de lavado
UTILIDAD DE LA ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA EN INMUNOLOGIA

A traves de esta tecnica se determinan muchos parametros clinicos de pruebas de

Hormonas (Endocrinología Tiroides, Fertilidad, otras Hormonas), marcadores
cardíacos(CK-MB, CK-TOTAL, Troponina I) , anemia, artritis reumatoide, pruebas oseas,
Retrovirus, marcadores tumorales( AFP, CA125,CA 19-9 , CEA, CA 72-4, PSA)
enfermedades infecciosas (Hepatitis, TORCH, Toxoplamas,Rubeola), entre otras.
 CONCLUSION

Durante los últimos años el avance tecnológico ha permitido desarrollar técnicas

que ayudan al diagnóstico de múltiples enfermedades. En el caso de las enfermedades
autoinmunes, las técnicas inmunológicas son de gran ayuda ya que permiten la detección de
varios autoanticuerpos simultáneamente a partir de volúmenes de muestra pequeños. Entre
las técnicas más utilizadas se encuentran: la inmunofluorescencia indirecta (IFI), el ensayo
múltiple y la electroquimiluminiscencia (EQL). Cada una de ellas presenta diferencias pero
conservan el fundamento general que es el reconocimiento de la unión antígeno-anticuerpo.

La automatizacion de equipos ha sido el protagonista para llevar a cabo la

determinacion de parametros por medio de la energia quimica y la interaccion antigeno-
anticuerpo. Estas tecnicas se basan en que una sustancia natural en las células o un
colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de
la energía absorbida como rayas luminosas. Nos ha permitido ayudar al Clinico a
determinar los biomarcadores utilizados en la detección de enfermedades cardiovasculares,
neurodegenerativas, tumorales y de otras patologías derivadas de la exposición a
determinados agentes tóxicos.

Un marcador biológico o biomarcador es una característica o un cambio fisiológico,

bioquímico o morfológico medible objetivamente a nivel molecular, bioquímico o celular,
y que actúa como indicador de procesos biológicos normales o patológicos, o de respuestas
farmacológicas a una intervención terapéutica. El empleo de este tipo de reacciones,
utilizando detección luminiscente o quimioluminiscente, satisface los requerimientos de
selectividad y sensibilidad que deben poseer los métodos analíticos que se empleen en el
análisis de biomarcadores.
 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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https://es.slideshare.net/lamparkie/inmunofluorescencia.

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Disponible: https://www.lifeder.com/inmunofluorescencia/#Fundamento
 García Rodríguez Carmiña y Martínez Maldonado Ivon; Laboratorio de Endocrinología
y Biomarcadores, Instituto de Servicios de Laboratorio de Diagnóstico e Investigación
en Salud (SELADIS). Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA. La
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http://www.revistasbolivianas.org.bo/pdf/vc/v1n2/v01n2a10.pdf [01
de noviembre de 2019].

 Shenzhen 11 de julio de 2016, Sistema de inmunoensayo por

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disponible:http://www.elhospital.com/temas/Sistema-de-inmunoensayo-por-
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 Medical expo Analizadores de inmunología por quimioluminiscencia
[En línea] disponible: https://www.medicalexpo.es/prod/span-
diagnostics/product-70145-700727.html [01 de noviembre de 2019].
 BioTek A part of agilent. Microscopio Automatizado Lionheart FX
[En línea] disponible: https://www.biotek.es/es/products/imaging-microscopy-
automated-cell-imagers/lionheart-fx/. [01 de noviembre de 2019].
 Laboratorio Lucas S,A. Cobas e411. [En línea] disponible:
http://laboratorioluca.com.ar/quienes-somos-dd1-cc1.html
 Licenciado Ferreira Hurtado, Christian Y. Electroquimioluminiscencia y
enzimoinmunoanalisis (Julio 2011). [En línea] disponible:
https://es.scribd.com/doc/60592532/electroquimioluminiscencia-y-
enzimoinmunoanalisis