CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA EFICACIA

(HINGH PERFOMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)HPLC

1. FUNDAMENTO TEORICO

Actualmente la HPLC, tiene distintas variedades de uso. La clase de fase normal, fue el primer tipo de
cromatografía. Este método usa una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar que se usa
cuando el analito es polar. El uso de los disolventes polares disminuye el tiempo de retención,
mientras que disolventes hidrófobos aumentan el tiempo de retención.
En esta técnica de cromatografía de líquidos se usa una fase estacionaria no polar y una fase móvil
moderadamente polar. Las características del analito a estudiar son importantes para sus
propiedades de retención. Actualmente ésta fase, es la que mejores resultados ofrece para el análisis
de las especies moleculares.
Sus resultados son obtenidos gracias a su alta resolución, su practicidad de interpretación y su fácil
reproducibilidad a través del proceso automatizado.

2. EL PROCESO CROMATOGRÁFICO DE HPLC

La cromatografía líquida de alta eficacia se encuentra dentro de la cromatografía de elución. En ésta,
un líquido (fase móvil) circula en íntimo contacto con un sólido u otro líquido inmiscible (fase
estacionaria); al introducir una mezcla de substancias (analitos) en la corriente de fase móvil, cada
analito avanzará a lo largo del sistema con una velocidad diferente que dependerá de su afinidad por
cada una de las fases. Esto supone que después de terminado el recorrido de la muestra por la
columna, cada una de las substancias introducidas en el sistema eluirá con un tiempo diferente, es
decir, estarán separadas.
3. CLASIFICACIÓN DE LA CROMATOGRAFÍA LIQUIDA
Los diferentes tipos de cromatografía líquida se pueden clasificar de diferentes maneras, pero la
forma más habitual de clasificación es la realizada en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya
que es ésta la que impone fundamentalmente el mecanismo de separación; de este modo, se
pueden enumerar cuatro tipos de técnicas:
- Cromatografía de adsorción (líquido-sólido).
La fase estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en repetidas etapas de adsorción-
desorción.
- Cromatografía de reparto/adsorción (fases ligadas químicamente).
La separación en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase móvil y la fase
estacionaria.
- Cromatografía de intercambio iónico.
Este tipo de cromatografía se da cuando la fase estacionaria presenta en su superficie grupos
ionizados capaces de retener selectivamente a iones de signo contrario que circulan en la fase móvil.
- Cromatografía de exclusión molecular.
La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamaño de poro controlado, que permite
la entrada de ciertas moléculas de manera selectiva, dejando fuera otras de mayor tamaño.
El mecanismo de retención en los dos primeros casos es similar, variando únicamente El
tipo de interacciones que se producen y cual de ellas es la predominante; por esta razón, en la
práctica se realiza otra división de los dos primeros tipos de cromatografía atendiendo a polaridad de
la fase estacionaria:
- Cromatografía de fase normal:
La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se producen
con el soluto son específicas del grupo activo. La fase estaciona- ria puede ser un sólido adsorbente
(sílice o alúmina), o bien, un soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que
presentan grupos funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc).
- Cromatografía de fase reversa (inversa):
La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas, grupos fenilo) y las
interacciones que se producen son inespecíficas (efecto solvófobo)
4. INSTRUMENTACIÓN
Si bien es cierto que para realizar una cromatografía líquida tan solo es necesario disponer de las
dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografía de líquidos de alta
eficacia, debido al pequeño diámetro de las partículas de fase estacionaria que se utilizan, requiere
de la utilización de unos dispositivos que constituyen el cromatógrafo.
Los componentes básicos de un cromatógrafo de líquidos son:
 Solvente(fase móvil)
 Bomba de alta presión
 Inyector
 Columna
 Detector
 Graficador

Esquema de un cromatografía de líquido

4.1. La bomba

La misión de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase móvil a

través de la columna, sin que el flujo sea influido por la presión en cabeza de columna, ya que ésta
puede variar por obstrucción de las líneas de conducción, del filtro de la cabeza de la columna, etc.

Un sistema de bombeo ideal debe cumplir las siguientes características:

 Estar construido con materiales químicamente inertes frente a la fase móvil.

 Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

 Proporcionar un flujo libre de pulsaciones o llevar asociado un amortiguador de éstas,

ya que las pulsaciones, aunque no afectan a la separación en sí, pueden contribuir al
ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad.

 Suministrar flujos adecuados para los diferentes tipos de columnas. El rango de

caudales para las columnas que se utilizan habitualmente varía desde 0.1 a 10 ml/min.

 El caudal que suministran debe ser constante a lo largo del tiempo, ya que de él
depende la reproducibilidad de los tiempos de retención.

4.2. TIPOS DE BOMBAS

4.2.1. Bombas reciprocas:
Dos válvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del
disolvente hacia adentro y hacia afuera de un cilindro
Desventajas de la bomba producen flujo pulsado que ha de amortiguar la presencia de ruido en la
línea base del cromatograma
Ventajas de la bomba e puede citar pequeño volumen interno de 35 a 400 microlitros sus altas
presiones de salida por encima 10.000psi.su fácil adaptación de ala elución con gradiente y sus
caudales constantes.
4.2.2. Bomba de desplazamiento:
Consiste por lo general en unas grandes cámaras como una jeringa, equipada con un embolo que se
activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante motor paso a paso.
4.2.3. Bomba neumática
En la bomba neumática más simple, la fase móvil se encuentra en un recipiente plegable colocado
en una vasija que puede presurizarse gas comprimido.
4.3. SISTEMAS DE INYECCIÓN
El método de introducción de la muestra en CLAE, es de importancia capital, pues un mal sistema de
inyección puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatográfica que deterioren la eficacia
del sistema cromatográfico.
Un inyector ideal debe tener las siguientes características:
 Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrecha
posible.
  Ser de fácil manejo.
 Dar lugar a resultados reproducibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada como en
el ensanchamiento que origina en la banda cromatográfica.
 Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
Fundamentalmente existen dos tipos de inyectores manuales: los de jeringa y los de válvula.
4.3.1. Inyectores de jeringa
En este tipo de inyectores, la introducción de la muestra en la columna se realiza por medio de una
jeringa cuya aguja entra en el sistema cromatográfico a través de una membrana ("septum"), lo que
permite depositar la muestra en la cabeza de la columna
Las ventajas de este tipo de inyector, radican en su facilidad de construcción y en que permiten sacar
todo el partido a la eficacia ofrecida por la columna; por el contrario, son inyectores que presentan
una gran falta de reproducibilidad, tienen una presión de trabajo limitada y son de gran dificultad de
manejo.

Inyectores de jeringa con y sin cámara de líquido

4.3.2. Inyectores de válvula

Este sistema de inyección consiste en una válvula de seis vías, dos de las cuales están conectadas
entre sí por medio de una espira ("loop"). Esta espira es un tubo de volumen conocido, cuya misión
es la de contener la muestra antes de efectuarse la inyección.
La introducción de la muestra en la columna se lleva a cabo en dos etapas; la primera se realiza a
presión atmosférica, y consiste en cargar la muestra en la espira con ayuda de una jeringa; en la
segunda, mediante un giro de la válvula, se hace pasar el eluyente a través de la espira hacia la
columna.
La inyección mediante válvulas es con mucho la más utilizada, ya que reúne prácticamen- te todas
las características exigibles a un inyector.
 Inyección mediante válvula de 6 vías
4.4. DETECTORES
Los detectores de cromatografia de liquidos han sido instrumentos analiticos tradicionales adaptados
con celdas de flujo para medir concetraciones bajas de soluto en flujos de liquido . El problema
principal de la cromatografía de liquidos es la adaptacion y la perfeccion de dichos dispositivos.
4.4.1. TIPOS DE DETECTORES
4.4.2. DETECTORES GENERALES

 DETECTOR DE INDICE DE REFRACCION

un detector diferencial de índice de refracción , en el que el solvente, en su camino hacia la columna,
pasa a través de una mitad de la celda y el efluente de la columna pasa por la otra mitad . los dos
comportamientos están separados por una placa de vidrio montada a un angulo tal que se produce
una desviación del haz incidente si las dos soluciones tienen distintos indices de refraccion.el
desplazamiento resultantes del haz respecto a la superficie fotosensible de un detector causa una
variación en la señal de salida, la cual, una ves amplificada y registrada , proporciona el
cromatograma. las ventajas de loa detectores de indicé de refracción es que responde a casi todos
los solutos . es decir son detectores universales análogos a los detectores de llama o de conductiidad
térmica en cromatografía de gases.
 DETECTOR DE LA DISPERSION DE LUZ
se trata de uno de los tipos mas recientes de detectores para hplc . en este detector, el efluyente de la
columna pasa a un nebulizador donde se transforma en una fina niebla mediante un flujo de nitrogeno
o aire. las finas gotitas se conducen por un tubo a temperatura controlada dodne tiene lugar la
evaporacion de la fase movil, lo que origina unas finas particulas de analito. la nube de particulas de
analito pasa atraves de un haz laser. las principales ventajas para este tipo de detector es casi igual
para todos los solutos no volatiles. ademas mas sensible que el detector de indice de refraccion, ya
que se han establecido limites de deteccion de 0.2 ng/ul. la desventaja es la composicion de la fase
movil esta limitada solo a componentes volatiles.

 DETECTOR ELECTROQUIMICO
resina sintetica de poliestireno-divinilbenceno o resinas de intercambio ionico . La silice es el material
de relleno mas comun en cromatografia de liquidos ; las particulas se preparan aglutinando particulas
de silice de dimensiones inferiores al micrometro en condiciones que forman particulas mayores con
diametros muy uniformes.

 DETECTOR DE ABSORCION UV- VIS

El esquema de una celda de flujo para las mediciones de absorcion de los efluentes de la columna
cromatografía a fin de minizar en ensanchamiento de bandas extracolumna el volumen de dicha celda
tiene que ser el menor posible los volumenes de la celda representativa son de 1 a 10 ul y las
longitudes de trayectoria de la celda son de 2 a 10 mm.

 DETECTOR DE FLUORECENCIA

Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorometros y
espectrofluorometros, la fluocencia se detecta por medio de un transductor fotoelectricos colocado a
90°C respecto al haz de excitación . Los detectores mas sencillos utilizan una fuente de excitación de
mercurio y uno o mas filtros para aislar una banda de la radiacion emitida. Los instrumentos mas
complejos consisten en una fuente de xenon y emplean un monocromador de red para aislar la
radiacion fluorescente. Los compuestos fluorescentes suelen esrar relacionados con el analisis de
materiales de interes farmaceuticos, productoa naturales, muestras clinicas y productos del petroleo.
4.5. LA COLUMNA
Es el elemento fundamental del equipo de cromatografía de liquidos puesto que es en ella donde se
da lugar la separación teniendo un diámetro interior de 3 a 5 nm
Características que debe tener la columna:

 Tubos de acero inoxidable ocasionalmente de vidrio

resistente
 Para la cromatografía liquida miden de 5 a 25 cm de
largo
 Tamaño de las partículas de relleno de 5 a 10 mm
 Columnas termostatizadas en general a temperatura
ambiente ocasional

4.5.1. PRECOLUMNAS

Por lo regular , para aumentar la vida de la columna analítica

se coloca una precolumna que elimina no solo la materia en
suspensión y los contaminantes de los solventes , sino
también los componentes de la muestra que se unen de
manera irreversible ala fase estacionaria.
La composición del relleno de la precolumna debería ser
semejante al de la columna analítica pero el tamaño de
partícula es mayor para minimizar la caída de presión. Cuando
ya se contamino se vacía y se rellena de nuevo o se
reemplaza por una nueva del mismo tipo. Por tanto, se le
sacrifica para proteger a la columna analítica que es más cara.

4.5.2. CONTROL DE LA TEMPERATURA DE LA COLUMNA

En muchas aplicaciones se necesita un control riguroso de la temperatura, por esa razón las
columnas trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces se obtienen mejores
cronogramas, mas reproducibles, cuando las temperaturas de la columna se mantienen constante.
4.5.3.TIPOS DE RELLENOS DE LA COLUMNA

 PELICULAR
Consiste en bolas de vidrio de polímero no porosas esfericas recubiertas de uina fina capa de silice
porosa o alúmina, este tipo de relleno se usa normalmente en las precolumnas
 PARTICULA POROSA
Formados por macro partículas porosas cojn diámetros de 3 a 10 µm de sílice o las mas
comunes que son de alúmina
5. DATOS QUE EMITE EL EQUIPO
Los datos que el equipo de HPLC emite es el cromatograma que nos muestra el tiempo de retención
vs la señal.

6. TIPO DE ANALISIS
6.1. ANALISIS CUALITATIVO

 Se inyecta una disolución estándar con solutos conocidos se calcula los tiempos de
retención de los solutos
 Se inyecta la muestra problema y se compara los tiempos de retencion de las dos
muestras
 Asi se averigua que compuestos hay en la muestra problema
6.2. ANALISIS CUANTITATIVO

 Se preparan soluciones estándar del analito a determinar de distintas concentraciones

 Se obtiene los cromatogramas de estas disoluciones
 Se hace la curva de calibración área del pico frente a su concentración.
 Se extrapolan el área del pico de la muestra problema y se calcula su concentración

7. PREPARACION DE MUESTRAS

 LIQUIDA. Si la muestra es liquida se inyecta directamente con una previa filtración

 SOLIDA. Si la muestra es solida es necesario molerla, homogenizarlo apropiadamente y
posteriormente solubilizarla con un solventar adecuado estando libres de partículas en
suspensión con una previa filtración

8. TIPOS DE SOLVENTES
AGUA es el solvente mas usado, el agua destilada presenta limitaciones en HPLC por tener
sustancias orgánicas que no se eliminan, se puede adquirir agua de calidad por cromatografía
Los Disolventes mas usados son :
  Metanol
 Acetonitrilo
Los solventes deben tener:

 alto poder solubilizante de las muestras

 baja reactividad
 adecuado al punto de ebullición
 baja viscosidad
 alto grado de pureza

9. CALIBRACION DEL EQUIPO

Para la calibración del equipo se debe comprobar las condiciones de trabajo (temperatura del
inyector, temperatura de la columna, parámetros del detector empleado- longitud de onda, volumen
de inyección, velocidad del flujo, caudal de bombeado etc ) Asi como las condiciones reflejadas en
el software del equipo.
Para saber si el equipo esta calibrado en la mayoría de los casos la calibracion de hecho requiere
una serie de patrones de concentración, cada vez mayor con el fin de producir lo que se conoce
como una curva de calibración. Esta es una línea
Rrealiza dos tipos de calibracion, una absoluta y otra relativa que permiten cuantificar un analito cuya
concentración en la muestra problema se desconoc, en la calibracion absoluta se emplean
concentraciones crecientes analizando la respuesta del detector, en caso de la calibracion relativa se
emplean concentraciones crecientes en presencia de una concentración que actua como patrón
interno.
10. APLICACIONES
 fármacos: antibióticos, analgecicos.
 bioquímica: proteínas, carbohidratos, lípidos.
 productos de alimentación : edulcorantes artificiales, antioxidantes, aditivos.
 productos de la industria química: aromáticos condensados, colorantes.
 contaminantes: pesticidas, herbicidas.
 química forence : drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos.
 medicina clínica: acidos biliares, extractos de orina.
11. CONCLUSION
 Aprendimos las partes del equipo de HPLC y cómo funciona y que tipos de análisis se puede
hacer y las aplicaciones que se hacen por HPLC
 La cromatografía liquida (HPLC) utiliza elevadas presiones para incrementar la velocidad de
separación de los analitos
 GLOSARIO

ELUCION : La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se

volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo
de una fase móvil de gas inerte
Adsorber: atraer y retener un líquido en su superficie