Universidad Técnica del Norte

Facultad de Ingeniería en Ciencias Agropecuarias y Ambientales

Carrera de Agroindustrias
Reporte de Laboratorio
Integrantes: Diana Rodríguez, Katherine Caiza, Camila López, Angie Olaya, Daniela Nájera,
Stalin Carrasco, Erick Morales
Fecha: 18 de julio del 2019

Tema: Características de las Bacterias Acido lácticas

Objetivo General: Caracterizar las propiedades probióticas de las bacterias en estudio.
Objetivo Específico: Determinar la resistencia de las bacterias acido lácticas a diferentes
condiciones (Temperatura, pH y Salinidad).
Materiales
Reactivos Sustancias
 Agua destilada

 Etanol

 Solución salina al 20% (concentraciones tomadas al 1% ,3% y 5%)

Medios de Cultivo

 MRS (Caldo y Agar)

 Brain Heart
Material de laboratorio

 Micropipetas

 Asa de vidrio

 Frascos boecos

 Tubos de ensayo con tapa rosca

 Gradilla

 Cajas Petri

 Espátula

Equipos

 Balanza
  Cámara de conteo

 Estufa

 Mechero

 Cocineta

 Refrigerador

 Incubadora

 Autoclave

Material Biológico

 Bal A

 Bal B
Material adicional

 Hilo chillo

 Papel Empaque

 Algodón

 Papel Aluminio

 Palillos
Introducción
Las bacterias lácticas (BAL) son un grupo de microorganismos representadas por varios
géneros con características morfológicas, fisiológicas y metabólicas en común. En general las
BAL son cocos o bacilos Gram positivos, no esporulados, no móviles, anaeróbicos,
microaerofílicos o aerotolerantes; oxidasa, catalasa y benzidina negativas, carecen de
citocromos, no reducen el nitrato a nitrito y producen ácido láctico como el único o principal
producto de la fermentación de carbohidratos (Carr y col., 2002; Vázquez y col., 2009).
Además, las BAL son ácido tolerantes pudiendo crecer algunas a valores de pH tan bajos como
3.2, otras a valores tan altos como 9.6, y la mayoría crece a pH entre 4 y 4.5, permitiéndoles
sobrevivir naturalmente en medios donde otras bacterias no aguantarían la aumentada actividad
producida por los ácidos orgánicos (Carr y col., 2002).
La mayor parte de los lactobacilos son mesófilos (30 -40°C), con un límite superior de 40ºC. Aunque
su rango de temperaturas para el crecimiento oscila entre 2 y 53°C, algunos crecen por debajo
de 15°C y hay cepas que crecen por debajo de 5°C. Otros crecen a temperaturas bajas, cercanas
al punto de congelación (por ejemplo, los que habitan en carnes y pescados congelados).
En el mundo se reconocen más de 20 especies diferentes de microorganismos probióticos,
los cuales pueden ser aislados de diferentes tipos de materiales: del tracto intestinal humano y
de animales, carnes, frutas y vegetales fermentados, entre otros (Barboza, 2004). La mayoría
de estos microorganismos pertenecen al grupo de las bacterias ácido láctico y son utilizadas por
la industria alimentaria para la elaboración de productos fermentados, predominando los
géneros Lactobacillus y Bifidobacterium (Barboza, J.E., Vázquez, H., Salcedo, R y Bautista,
M. ,2004).
La tolerancia a sales biliares es considerada una prueba esencial para las bacterias ácido
lácticas a efectos que puedan sobrevivir al paso del intestino delgado. Las cepas que mostraron
mayor resistencia a las sales biliares podría deberse a que hidrolizan mejor las sales biliares a
través de la enzima hidrolasa biliar atenuando de esta manera el efecto detergente de la sal biliar
(Erkkila & Petaja, 2000). Las bacterias ácido lácticas que tienen resistencia a concentraciones
de sales biliares 0.3% permite seleccionar cepas resistentes para el uso en productos
fermentados por probióticos (Erkkila & Petaja 2000).
La acción conservadora de las BAL es debido a la inhibición de un gran número de
microorganismos patógenos y dañinos por varios productos finales de la fermentación. Estas
sustancias son ácidos como láctico y acético, peróxido de hidrógeno, diacetilo, bacteriocinas y
productos secundarios generados por la acción de lactoperoxidasa sobre el peróxido de
hidrógeno y tiocianato (Shirai y col., 1996).
Métodos
-pH BAL A y BAL B
Siembra
Bal A: MRS caldo (5 ml) + colonia de Bal A
Bal B: Brain Heart (5ml) + colonia de Bal B
Incubar
t= 24H
Sembrar T= 37°C
Bal A: MRS caldo pH 4 (4.5 ml) + Siembra de
muestra madre (500 µl).
Bal B: Brain Heart pH 2 y 3 + Siembra de
muestra madre (500 µl) Diluciones
Bal A pH 4, hora 0: dilución 10-5 ; Bal B pH 2,
hora 0: dilución
Resultados 10-4; Bal B pH 3, hora 0:
y discusión Sembrar
-4
dilución 10
Resistencia
Bal A pH 4: de Bal A 10
diluciones a pH
-4 4 -5 ; Bal B pH 2:
y 10
diluciones 10-3 y 10-4 ; Bal B pH 3: diluciones Incubar
10-3 y 10-4

t= 1H
Diluciones T= 37°C

Bal A pH 4, hora 1: dilución 10-5; Bal B pH 2,

hora 1: dilución 10-3; Bal B pH 3, hora 1:
dilución 10-3 Sembrar
Bal A pH 4: diluciones 10-4 y 10-5; Bal B pH 2:
diluciones 10-2 y 10-3; Bal B pH 3: diluciones
10-2 y 10-3 Incubar
t= 1H
T= 37°C
Diluciones
-3
Bal A pH 4, hora 2: dilución 10 ; Bal B pH 2,
hora 2: dilución 10-2; Bal B pH 3, hora 2:
dilución 10-3 Sembrar
Bal A pH 4: diluciones 10-2 y 10-3; Bal B pH 2:
diluciones 10-1 y 10-2; Bal B pH 3: diluciones
10-2 y 10-3 Incubar
t= 1H
T= 37°C
Diluciones
Bal A pH 4, hora 3: dilución 10-3; Bal B pH 2,
hora 3: dilución 10-1; Bal B pH 3, hora 3:
dilución 10-2 Sembrar
Bal A pH 4: diluciones 10-2 y 10-3; Bal B pH 2:
diluciones 100 y 10-1; Bal B pH 3: diluciones Incubar
10-1 y 10-2
t= 24H
T= 37°C
Recuento
-Concentraciones de NaCl en las BAL A y B que fueron sembradas a 45oC
Resultados y discusión
Resistencia de Bal A a pH 4
Para tener más precisión y demostrar que la Bal A resiste a pH ácido (pH 4), se realizó la
práctica con tres repeticiones y se utilizó el medio MRS Agar. Los resultados se muestran en
las siguientes tablas:
Tabla 1: Repetición 1 de crecimiento (UFC/mL) de las cepas de bacterias ácido lácticas Bal
A en pH 4.
Hora Diluciones N° de colonias UFC/ml
10 -4
Hora 0 42 4200000
10 -5
Hora 0 8 8000000
10 -4
Hora 1 16 1600000
10 -5
Hora 1 1 1000000
10 -2
Hora 2 1436 1436000
10 -3
Hora 2 321 3210000
10 -2
Hora 3 8600 8600000
10 -3
Hora 3 473 4730000
En la repetición 1, se puede observar que la bacteria acido láctica, entre la hora 0 y la hora
1 tarda en adaptarse al medio y también es notable que en la hora 1 la Bal A necesita un poco
más de tiempo de incubación. En las horas 2 y 3 la Bal A rápidamente aceptó los nutrientes del
medio y por ende mostró un aumento de crecimiento de colonias en la placa. Este resultado
quiere decir que la Bal A se adapta a este pH ácido.
Tabla 2: Repetición 2 de crecimiento (UFC/mL) de las cepas de bacterias ácido lácticas Bal
A en pH 4.
Hora Diluciones N° de colonias UFC/ml
Hora 0 10-4 217 21700000
Hora 0 10-5 18 18000000
Hora 1 10-4 64 6400000
Hora 1 10-5 5 5000000
Hora 2 10-2 9496 9496000
Hora 2 10-3 844 8440000
Hora 3 10-2 2780 2780000
Hora 3 10-3 856 8560000

En la repetición 2, al comprar la hora 0 con la hora 1, disminuye el crecimiento. Esto puede

explicarse ya sea por: mayor tiempo de incubación o no hubo una agitación adecuada. Después,
se puede notar que en las horas siguiente aumenta el número de colonias. Hay que recalcar que
en la hora 3 el número de colonias disminuye, esto podría deberse a una falla en el momento de
realizar la siembra. La muestra 2 también se adapta a este pH ácido.
Tabla 3: Repetición 3 de crecimiento (UFC/mL) de las cepas de bacterias ácido lácticas Bal
A en pH 4.
Hora Diluciones N° de colonias UFC/ml
Hora 0 10-4 159 15900000
Hora 0 10-5 15 15000000
Hora 1 10-4 27 2700000
Hora 1 10-5 3 3000000
Hora 2 10-2 8320 8320000
Hora 2 10-3 5220 52200000
Hora 3 10-2 3116 3116000
Hora 3 10-3 1480 14800000

En la repetición 3, ocurre lo mismo que en la muestra 2.

Tabla 4: Promedio de las repeticiones de UFC/ml de Bal A en pH 4

Promedio Promedio Promedio Promedio

Hora R1 R2 R3 Total
Hora 0 6100000 19850000 15450000 13800000
Hora 1 1300000 5700000 2850000 3283333,333
Hora 2 2323000 8968000 30260000 13850333,33
Hora 3 6665000 5670000 8958000 7097666,667

Gráfico 1: Bal A, pH 4.
Bal A pH4
16000000

14000000

12000000

10000000
UFC/ml

8000000

6000000

4000000

2000000

0
Hora 0 Hora 1 Hora 2 Hora 3
Resistencia de Bal B a pH 2
Tabla 5: Repetición 1 de crecimiento (UFC/mL) de las cepas de bacterias ácido lácticas Bal
B en pH 2.
Hora Diluciones N° de colonias UFC/ml
Hora 0 10-3 5504 55040000
Hora 0 10-4 1668 166800000
Hora 1 10-2 254 25400
Hora 1 10-3 37 370000
Hora 2 10-1 72 7200
Hora 2 10-2 14 14000
Hora 3 100 711 7110
Hora 3 10-1 15 1500

La Bal B, repetición 1 no se adapta al pH 2 en el medio MRS, se puede notar que en la hora

0 la cantidad de colonias existe en gran número, pero al pasar las horas hay un decrecimiento
de las colonias, esto significa que la Bal B tardaría mucho tiempo en que acepte este pH o exista
la posibilidad que al aumentar las horas la Bal B no se adapte a este pH y por lo tanto no exista
colonias en la placa.

Tabla 6: Repetición 2 de crecimiento (UFC/mL) de las cepas de bacterias ácido lácticas BAL
B en pH2
Hora Diluciones N° de colonias UFC/ml
Hora 0 10-3 1644 16440000
Hora 0 10-4 7200 720000000
Hora 1 10-2 148 148000
Hora 1 10-3 21 210000
Hora 2 10-1 7 700
Hora 2 10-2 15 15000
Hora 3 100 75 7500
Hora 3 10-1 15 150

En la repetición 2 ocurre lo mismo que en la repetición 1

Tabla 7: Promedio de las repeticiones de UFC/ml de Bal B en pH 2

Promedio Promedio Promedio

Hora
R1 R2 Final
Hora 0 110920000 368220000 239570000
Hora 1 197700 179000 188350
Hora 2 10600 7850 9225
Hora 3 4305 3825 4065
 Gráfico 2: Bal B, pH 2

Bal B pH2
300000000

250000000

200000000
UFC/ml

150000000

100000000

50000000

0
Hora 0 Hora 1 Hora 2 Hora 3

Resistencia de Bal B a pH 3

Tabla 8: Repetición 1 de crecimiento (UFC/mL) de las cepas de bacterias ácido lácticas Bal
B en pH 3
Hora Diluciones N° de colonias CFU/ml
Hora 0 10-3 1116 11160000
Hora 0 10-4 309 30900000
Hora 1 10-2 3448 3448000
Hora 1 10-3 802 8020000
Hora 2 10-2 3032 3032000
Hora 2 10-3 740 7400000
Hora 3 10-1 6494 649400
Hora 3 10-2 2152 2152000

Como se puede observar, en la tabla 6, la Bal B repetición 1 sembrada a un pH 3, la bacteria

va adaptándose al medio con el paso de las horas 1, 2 y 3 de incubación. Se puede notar también
que en las horas 1 y 2, la Bal B se mantiene en su etapa de adaptación al pH 3 y en la hora 3
esta bacteria acepta al pH y continua su formación de colonias por todo el medio.
Tabla 9: Repetición 2 de crecimiento (UFC/mL) de las cepas de bacterias ácido lácticas Bal
B en de pH 3.
Hora Diluciones N° de colonias UFC/ml
Hora 0 10-3 996 9960000
Hora 0 10-4 193 19300000
Hora 1 10-2 3356 3356000
Hora 1 10-3 948 9480000
Hora 2 10-2 3472 3472000
Hora 2 10-3 756 7560000
 Hora 3 10-1 4567 456700
10 -2
Hora 3 1008 1008000
En la repetición N°2 se puede decir que es lo contrario dicho anteriormente, en las horas 1
y 2 la Bal B mantiene su etapa de adaptación al pH 3, pero en la hora 3 reduce su capacidad de
formación de colonias, esto puede ser causa a que le faltó más tiempo de incubación, no hubo
agitación en los tubos al realizar la siembra, o también que la bacteria no le gustó el medio.
Tabla 10: Promedio de las repeticiones de UFC/ml de Bal B en pH 3

Promedio Promedio Promedio

Hora
R1 R2 total
Hora 0 21030000 14630000 17830000
Hora 1 5734000 6418000 6076000
Hora 2 5216000 5516000 5366000
Hora 3 1400700 732350 1066525

Gráfico 3: Bal B, pH 3

Bal B pH3
20000000
18000000
16000000
14000000
12000000
UFC/ml

10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0
Hora 0 Hora 1 Hora 2 Hora 3

Análisis del pH 2 y 3 de Bal B y pH 4 de Bal A

Analizando los resultados se observa que la Bal B se adapta mejor en pH 3 ya que es un pH
cercano al óptimo. Mientras que en pH 2, va disminuyendo el número de colonias a medida que
pasan las horas, esto se debe a que este pH es muy ácido. Por lo tanto, la Bal B tiene mayor
viabilidad en pH 3, también se puede entender que a pH 4 va a tener mayor adaptación.
De acuerdo a los resultados obtenidos, se observa que la Bal A en pH 4 presenta un poco de
inestabilidad con respecto al crecimiento, ya que aumenta y disminuye el crecimiento entre
horas. Esto puede deberse a una falla en la siembra o también puede deberse a que la Bal A
necesita más tiempo para adaptarse a medio ácido.
En la siembra de la muestra madre de ambas bacterias acido lácticas, se observó que Bal A
se adapta mejor en MRS caldo, mientras que Bal B se adapta en Brain Heart. Al tener Bal B
preferencia por Brain Heart, su crecimiento es muy abundante y adjunta mucha biomasa y no
se puede distinguir las colonias, por lo que es más factible, al momento de hacer recuento,
realizar la siembra en MRS Agar para bal B pH 2 y 3.

Tolerancia de Bal B a ciertas concentraciones de NaCl incubadas a temperatura de 45 °C

Tabla 11: Bal B, Dilución 10-3 a distintas concentraciones de NaCl.

Bal B Concentración de NaCl

Repeticiones NaCl (1%) NaCl (3%) NaCl (5%)
UFC/ml

Repetición 1
4390000 4890000 7130000
Repetición 2
4170000 5730000 8720000

La menor tolerancia frente al cloruro de sodio la presentó la cepa M2 (10-3) en una

concentración del 1% seguida por la cepa M1 (10 -3) a la misma concentración de NaCl. A
partir de esta concentración la tolerancia fue en aumento con un crecimiento promedio en las
cepas M1 (10 -3) 3% y M2(10 -3) 3%. La mayor tolerancia frente al cloruro de sodio la presentó
la cepa M2 (10-3) en una concentración del 5%, seguida por la cepa M1(10 -3) también en una
concentración del 5% de NaCl.

Tabla 12: Bal B, Dilución 10-4 a distintas concentraciones de NaCl.

Bal B Concentración de NaCl

Repeticiones NaCl (1%) NaCl (3%) NaCl (5%)
Repetición 1
UFC/ml

40900000 34700000 72800000

Repetición 2
32600000 35100000 70200000

La menor tolerancia frente al cloruro de sodio la presentó la cepa M2 (10-4) en una

concentración del 1% seguida por la cepa M1 (10 -4) en una concentración del 3% y de la cepa
M2 (10-4) a la misma concentración de NaCl. A partir de esta concentración la cepa que
presentó una tolerancia promedio fue la cepa M1 (10 -4) al 1% de NaCl. La mayor tolerancia
frente al cloruro de sodio la presentó la cepa M1 (10 -4) en una concentración del 5%, seguida
por la cepa M2 (10 -4) también en una concentración del 5% de NaCl.
 Tabla 13: Bal B, promedio de las repeticiones a distintas concentraciones de NaCl
NaCl NaCl
NaCl (1%)
(3%) (5%)
Promedio R1 4280000 5310000 7925000

Promedio R2 36750000 34900000 71500000

Promedio
total 20515000 20105000 39712500

Gráfico 4: Bal B a ciertas concentraciones de NaCl

Bal B 45°
45000000
40000000
35000000
30000000
UFC/ml

25000000
20000000
15000000
10000000
5000000
0
NaCl (1%) NaCl (3%) NaCl (5%)

Tolerancia de Bal A a ciertas concentraciones de NaCl incubadas a temperatura de 45 °C

Para identificar la tolerancia a la salinidad se procedio a someter a distintas concentraciones
y diluciones a la BAL A que fue incubada con una temperatura de 45o C.
Tabla 14: Bal A, Dilución 10-4 a distintas concentraciones de NaCl.

Bal A Concentración de NaCl

Repeticiones NaCl (1%) NaCl (3%) NaCl (5%)
UFC/ml

Repetición 1 1900000 600000 600000

Repetición 2 1400000 700000 900000

 Tabla 15: Bal A, Dilución 10-5 a distintas concentraciones de NaCl

Bal A Concentración de NaCl

Repeticiones NaCl (1%) NaCl (3%) NaCl (5%)

UFC/ml
Repetición 1
600000 1800000 1800000

Repetición 2
1800000 900000 600000

Tabla 16: Bal A, Dilución 10-5 a distintas concentraciones de NaCl

NaCl (1%) NaCl (3%) NaCl (5%)

Promedio R1 1650000 650000 750000

Promedio R2 1200000 1350000 1200000

Promedio Total 1425000 1000000 975000

Gráfico 5: Bal A, promedio de las repeticiones a distintas concentraciones de NaCl

Bal A 45°
1600000

1400000

1200000

1000000

800000

600000

400000

200000

0
NaCl (1%) NaCl (3%) NaCl (5%)

De las UFC/ml encontradas en las cajas de MRS Agar que fueron sembradas con distintas
concentraciones de NaCl y con diluciones 10-4 y 10-5 las que presentaron menor tolerancia con
una concentración de 1% de NaCl fuer M1 10-5, con una concentración del 3% de NaCl fue M1
10-4 y con una concentración de 5% de NaCl fueron M1 10-4 y M2 10-5. La menor tolerancia al
cloruro de sodio se encuentra en la concentración del 5%.
La mayor tolerancia al NaCl se encuentra con la concentración de 1% debido a que tiene los
valores más altos de colonias, con 19 colonias en M1 10-4 y 18 colonias en M2 10-5.
Al obtener un número de colonias tan pequeño se identifica que las diluciones estuvieron
demasiado altas por lo que se podría realizar esta práctica con diluciones 10-2 y 10-3 para poder
obtener mejores resultados.

La concentración de 1% de NaCl arrojó los resultados más altos debido a que en M1 10 -4

presenta 1900000 UFC/ml y M1 10-5 presenta 1800000 UFC/ml.

Comparación de BAL A con respecto a BAL B que fueron sembradas a 45o C, las dos
teniendo como dilución 10-4.

Tabla 12: Comparación de BAL A con respecto a BAL B que fueron sembradas a 45o C, las
dos teniendo como dilución 10-4.
BAL A BAL B
1%NaCl 3%NaCl 5%NaCl 1%NaCl 3%NaCl 5%NaCl
Repeticiones (10-4) (10-4) (10-4) (10-4) (10-4) (10-4)
Repetición 1
40900000 34700000 72800000
(UFC/ml) 1900000 600000 600000
Repetición 2
32600000 35100000 70200000
(UFC/ml) 1400000 700000 900000

Se puede identificar que la BAL B tiene una mejor tolerancia a la salinidad debido a que
presenta un número de UFC/ml mayor con respecto al que presenta la BAL A.

Fotos
-Concentraciones de NaCl en Bal B que fue sembrada a 45oC
-Bal B pH 3
-pH 2 Bal B

- Concentraciones de NaCl en Bal A que fue sembrada a 45oC

Bibliografía
Barboza, J.E., Vázquez, H., Salcedo, R y Bautista, M. (2004). Probióticos y conservadores
naturales en alimentos. Acta Universitaria. 14(3):32-38.
Carr, F. J., Chill, D. y Maida, N. (2002). The lactic acid bacteria: A literature survey.Critical
Reviews in Microbiology . 28(4):281-370.
Erkkila S. & E. Petaja. 2000. Screening of commercial meat starter cultures at low pH and in
the presence of bile salts for potential probiotic use. Meat Science. 55(3):297- 300.

Shirai, K., Guerrero, I. y Lara, P. (1996). Bacterias lácticas en alimentos fermentados.

Ciencia. 47:125-137.

Vázquez, S.M., Suárez, H. y Zapata, S. (2009). Utilización de sustancias antimicrobianas

producidas por bacterias ácido lácticas en la conservación de la carne. Revista Chilena de
Nutrición. 36(1):64-7