Métodos de siembra de bacterias y Tinción de Gram

Practica #3 y #4
Héctor Copete 210161042, Lina Moncayo 21018101, Alice Madeleine Cadena
210281009, Maura Hurtado 210182036
Docente Rubén Darío Gonzales

SIEMBRA DE BACTERIAS Y TINCION DE GRAM

RESUMEN

Cuando hablamos del cultivo de bacterias, nos referimos a uno de los sistemas más importantes
para la identificación de microorganismos observando su crecimiento en sustancias alimenticias
artificiales preparadas en el laboratorio químico. Si hablamos de cómo se cultivan las bacterias,
tenemos que hacerlos inevitablemente del medio de cultivo, material alimenticio en el que crecen
los microorganismos generando un cultivo.
La tinción de Gram consiste en una prueba de laboratorio útil para detectar la presencia de
microorganismos, especialmente bacterias y algunas veces hongos, en una muestra obtenida del
foco infeccioso o sospechoso de serlo. Proporciona resultados con relativa rapidez y facilidad
acerca del tipo de bacteria que puede estar presente.

INTRODUCCION

En el cultivo de bacterias, la mayoría de las patógenas requieren nutrientes complejos similares en

composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano, es por eso por lo que la base de muchos
medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros
ingredientes.
Si hablamos de cómo se cultivan las bacterias tenemos que hacerlo también de unas condiciones
generales que deben darse:
 Nutrientes adecuados disponibles. Un cultivo de bacterias adecuado para investigar ha de
 contener como mínimo carbono, nitrógeno, azufre, fósforos y sales inorgánicas.
Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar
peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón. A
menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes.
 Consistencia del medio. Partiendo de un medio liquido podemos modificar su consistencia
añadiendo productos como la albúmina, gelatina o agar.
 Luz ambiental. La mayoría de los microorganismos de un cultivo de bacterias crecen mucho
mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar.

 Temperatura. En líneas generales los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura

mucho más cortos, alrededor de 37ºC.
 Humedad y pH. Un mínimo de humedad en medio y atmosfera es necesario para el
desarrollo, así como un pH neutro.
 Esterilidad. Fundamental recordar que todos los medios de cultivo han de estar
perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar,
enmascara o impedir el crecimiento.

La tinción de Gram o coloración de Gram Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian

Gram (1853-1938), que desarrolló la técnica en 18841. Es un tipo de tinción diferencial empleado
en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se utiliza tanto
para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias
que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram.

Para poder entender mejor ese concepto, la tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial que
se lleva utilizando en bacteriología desde 1875. La técnica fue creada por un microbiólogo danés
denominado Christian Gram y supuso toda una revolución para el mundo de la microbiología ya
que permitía a los científicos diferenciar claramente la morfología de las bacterias, además de que
podían distinguir entre bacterias gram positivas, aquellas que se teñían de morado, de las bacterias
gram negativas, las que tras la tinción se ven de color rosa o rojizas.
Las bacterias gram positivas se tiñen de morado En las bacterias gram positivas los complejos
insolubles se quedan entre los filamentos de peptidoglicano de la pared bacteriana y por lo tanto
no se disuelven, dejando las bacterias teñidas de morado, pero en las bacterias gram negativas
estos compuestos sí que se disuelven y pierden su color, por ello pueden diferenciarse un tipo
bacteriano de otro. Las bacterias gram negativas se observarán incoloras, de color rosa o rojo, en
función de si hemos realizado el último paso opcional de la técnica de tinción de Gram. Un ejemplo
de bacteria gram positiva es Staphylococcus aureus y un ejemplo de bacteria gram negativa
es Escherichia coli.

Con la tinción de Gram lo que estamos detectando es básicamente el tipo de pared celular de la
bacteria que estamos analizando en ese momento. Aunque esta técnica tiene ciertas limitaciones
pues existen bacterias que no presentan pared celular, como es el caso del género Mycoplasma.
Además, a veces, otros factores como la edad de la muestra o el protocolo de la tinción pueden
interferir en los resultados de la tinción, por lo que siempre se recomienda usar controles y realizar
pruebas más exhaustivas en el caso de que se quiera identificar la bacteria.

METODOLOGIA

Siembras en estrías en cajas de Petri

1. Tome con el asa una muestra del cultivo de E. coli y siembre sobre un tercio de la caja de Petri
que contiene agar nutritivo.
2. Flamee el asa humedecida con alcohol utilizando el mechero para esterilizarla y enfríela.
3. En un extremo de la caja con Agar nutritivo realice rayados suaves en forma horizontal sobre la
superficie formando estrías. Gire la caja 90º raye la superficie formando estrías y continúe el mismo
procedimiento
en los tres extremos restantes de la caja. En el último extremo, cuando esté realizando la última
estría tenga cuidado de no tocar con el asa el primer rayado que realizó.
4. Repita el procedimiento con E. faecalis.
5. Incube por 24 horas a 34 °C.
Nota: rotule debidamente cada caja sembrada.

Siembras por agotamiento en cajas de Petri

6. Tome con el asa una muestra del cultivo de E. coli y siembre sobre un tercio de la caja de Petri
que contiene agar nutritivo.
7. Flamee el asa humedecida con alcohol utilizando el mechero para esterilizarla y enfríela.
8. Realice rayados suaves de un extremo al otro en un tercio de la caja, de allí en adelante reduzca
el rayado hasta terminar en el punto medio del otro extremo de la caja.
9. Repita el procedimiento con E. faecalis.
10. Incube por 24 horas a 34 °C.
Nota: rotule debidamente cada caja sembrada.
Figura 2. Método de siembra por agotamiento de microorganismos en medio sólido

Siembras por punción o picadura en medios inclinados.

11. Flamee y enfríe el asa de punta recta.

12. Tome una muestra del cultivo microbiano y realice la punción vertical del medio de cultivo con
el asa, tape el tubo flameando previamente la tapa y la boca del mismo.
13. Flamee nuevamente el asa.
14. Incube por 24 horas a 34 °C.
Verifique la forma del crecimiento del cultivo. Nota: rotule debidamente cada tubo sembrado.

Preparación de los frotis

1. Con ayuda del asa de siembra, tome una muestra de una colonia de E. coli, disuélvala en unas
gotas de agua destilada y realice el frotis, utilizando un palillo, sobre una placa portaobjetos.
2. Con ayuda del asa de siembra, tome una muestra de una colonia de E. faecalis, disuélvala en
unas gotas de agua destilada y realice el frotis, utilizando un palillo, sobre una placa portaobjetos.
3. Fijar los frotis dejándolos secar por los menos por 5 minutos y posteriormente pasándolos un
par de veces por el mechero.
Nota: haga dos frotis de cada una de las muestras.

Tinción de Gram

4. Tome los frotis y apóyelos sobre las varillas de tinción. Cubra los portaobjetos con solución de
cristal de violeta durante 2 minutos. Lave suavemente el cristal de violeta con agua destilada.
5. Cubra con lugol los frotis durante 1 minuto y lave suavemente con agua destilada.
6. Lavar cuidadosamente las muestras utilizando etanol hasta que ya no se desprenda colorante.
Lave suavemente con agua destilada.
7. Cubra las preparaciones con solución de safranina por dos minutos y lave suavemente con agua
destilada.
8. Coloque los portaobjetos sobre toallas de papel y déjelos secar al aire libre.
9. Agregue una gota de glicerina a cada portaobjetos y coloque sus respectivos cubreobjetos.
Observe a 100X utilizando aceite de inmersión y diferencie las bacterias Gram positivas de las
Gram negativas.
10. Identifique las bacterias en cada frotis, así como su forma, utilizando la figura 1.

La coloración Gram debe su nombre al bacteriólogo danés Chistian Gram en 1884. La tinción
de Gram aporta dos ideas básicas para la definición de las bacterias: el color que adquieren
tras la tinción y la forma que presentan las células bacterianas. En lo relativo a la coloración
tenemos:
- Gram positivos color azul-violeta
- Gram negativos color rojo-rosado

Las bacterias se clasifican en Gram positivas y en Gram negativas de acuerdo a los

componentes químicos de su pared celular. Las Gram positivas poseen una pared celular poco
permeable y resisten la decoloración. Las Gram negativas poseen una pared celular más
permeable, se decoloran y luego adquieren la coloración de la safranina.

La coloración Gram consiste en una técnica de tinción que utiliza 4 componentes: un colorante
básico (cristal violeta), un mordiente (lugol), un decolorante (alcohol cetona) y un colorante de
contraste (safranina).
• Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli

• Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

¿Cuáles son las principales diferencias entre la siembra por estría y por agotamiento?

El método de estría es la separación de un determinado microorganismo del resto

de microorganismos que le acompañan y la técnica por agotamiento se basa en
coger una vez una cantidad representativa de muestra y extenderla por toda la placa
Petri en cuatro zonas de tal forma, que cada vez que pasamos de una zona a otra
la cantidad de microorganismo se reduce mucho.

¿Con esta prueba que información obtenemos del microorganismo?

En esta prueba se puede obtener información sobre su Gram (si es Gram positivos
o si es Gram negativos), algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún
después de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al añadir éste;
otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el
violeta, se califican de Gram positivos, y los que pierden la primera coloración y
retienen la segunda, de Gram negativos.

¿Qué otros colorantes se utilizan para tinciones diferenciales en bacterias?

La amplia gama de colorantes que se pueden utilizar, ha obligado a separarlos en

tres grupos generales, los de trifenilmetano, los de oxacina y los de tiacina. Esta
clasificación es buena para la distinción de las familias de colorantes, pero en
general se utiliza la clasificación de acuerdo a su carácter ácido – base, es decir,
ácidos, bases o neutros, debido a que de esto depende mucho su comportamiento.
¿Qué factores celulares influyen para que una bacteria sea catalogada como Gram
negativa o Gram positiva?

Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo
microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve gram
negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del
colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente: El colorante
básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en
agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los
microorganismos Gram positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que
la laca no puede atravesar. En las células Gram negativas, los lípidos de la pared
(más abundantes que en las células Gram positivas) se disuelven por este
tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo.
Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la
pared celular.
¿Qué roles ecológicos cumplen la E. coli y E. faecalis?
Estas bacterias incluyentes del estiércol se usan tanto en la producción ecológica
como en la convencional, ya que hace tiempo que los ingenieros se dieron cuenta
de que la fertilización química en exclusiva no es capaz de mantener la fertilidad de
los suelos, que necesita aportes de materia orgánica, sin embargo, en el proceso
del compostaje mueren para mantener la salubridad del cultivo.
 CONCLUSIONES

La tinción de Gram consiste en una prueba de laboratorio útil para detectar la

presencia de microorganismos, especialmente bacterias y algunas veces
hongos, en una muestra obtenida del foco infeccioso o sospechoso de serlo.
Proporciona resultados con relativa rapidez y facilidad acerca del tipo de
bacteria que puede estar presente. No obstante, los resultados de la tinción
de Gram pueden no ser definitivos, siendo necesarias otras pruebas como
cultivos y pruebas de detección de antígenos o de anticuerpos para confirmar
un diagnóstico. Al realizar una siembra de microorganismos, debemos tener
en cuenta que técnica se va a utilizar, debido a que estas varían respecto a
las características del microorganismo a tratar. También debe tenerse en
cuenta la forma, espacio y el objetivo al que se quiere llegar, pues
dependiendo de esto la técnica de siembra es diferente. Un microorganismo
se puede sembrar en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido
de agar. Un cultivo de bacterias o de hongos es con el fin de aislarlas en el
medio para lograr un mejor estudio de ellos.
BIBLIOGRAFIA

https://es.wikipedia.org/wiki/Tinción_diferencial#Tipos_de_Tinción

https://www.diagonalperiodico.net/cuerpo/la-e-coli-bacteria-ecologica.html