Microbiología/Medios de cultivo

< Microbiología

Ir a la navegaciónIr a la búsqueda

MEDIOS DE CULTIVO

Los microorganismos por lo general pueden vivir y multiplicarse sobre substratos nutritivos
preparados en el laboratorio, denominados medios de cultivo. Los Medios de Cultivo son
preparados estériles que contienen sustancias necesarias para el desarrollo de los
microorganismos.

Todos los microorganismos requieren agua, carbono, nitrógeno, hidrógeno, calcio, fósforo y hierro
como elementos vitales. Los microorganismos exigentes requieren además factores de
crecimiento como aminoácidos, vitaminas, purinas y otras sustancias que no son capaces de
sintetizar.

CONDICIONES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. Contener sustancias nutritivas necesarias para el desarrollo de los microorganismos (tales

como aminoácidos, carbohidratos, polialcoholes, vitaminas, minerales).

2. Tener un pH que permita un desarrollo óptimo, por lo general las bacterias patógenos
necesitan un pH neutro o ligeramente alcalino (7.0 – 7.4), en cambio las levaduras y hongos
requieren un pH ácido (5.0).

3. Estar previamente esterilizados o preparados en condiciones asépticas.

4. Estar protegidos de la contaminación ambiental por tapones de algodón cardé, tapones de

goma, tapas metálicas o roscas.

UTILIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

1. Aislamiento de bacterias desde una muestra o material patógeno (secreción purulenta,
orina, órgano, fecas, etc.) o de un alimento (leche, carne, etc.)

2. Estudio morfológico de las colonias.

3. Conservación de cepas identificadas (colección de cepas microbianas o cepario).

4. Clasificación y tipificación de bacterias por estudio de sus propiedades bioquímicas en

medios diferenciales.

5. Obtención de toxinas o investigación de sus características.

6. Cultivo y cosecha de bacterias para la elaboración de productos biológicos (vacunas,

antígenos, bacterinas, toxoides, etc.).

CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO

1. Medios Líquidos: se utilizan preferentemente para favorecer el desarrollo bacteriano de

células estresadas. En determinadas ocasiones no se pueden sustituir por los medios sólidos, por
ejemplo en la síntesis de exotoxinas, pigmentos, enzimas, etc. - Ejemplo: Agua peptonada, Caldo
común, Caldo Cerebro Corazón, Caldo Saboureaud, etc.

2. Medios Sólidos: se utilizan para obtener bacterias aisladas por la formación de colonias
sobre la superficie del medio de cultivo y para el estudio de la morfología de las colonias, lo que no
permiten los medios líquidos. Se diferencian porque tienen una sustancia de sostén, que puede
ser agar-agar. - Ejemplo: Agar Común, Agar SS, Agar Cerebro Corazón, Agar Saboureaud, etc.
3. Medios Semisólidos: se utilizan para estudiar la motilidad de las bacterias. Tienen un
menor porcentaje de agar, por lo que no solidifican totalmente a la temperatura ambiente. -
Ejemplo: Agar MIO, Agar SIM.

Los medios sólidos tienen generalmente agar–agar como agente solidificante, espesante o
gelificante. El agar-agar es una sustancia hidrofílica de carácter coloidal procedente de diversas
especies de algas marinas, especialmente del géneroGelidium, que tiene la propiedad de formar
un gel. Químicamente el agar-agar es un polisacárido de cadena larga, dependiendo de su tamaño
el poder gelificante.

El agar-agar se expende en forma granulada o en polvo, es insoluble en agua fría, se disuelve

solamente a temperatura de ebullición, se mantiene en forma viscosa a 60–80 °C y solidifica en
forma de un gel estable a 40–45 °C. Resiste perfectamente la esterilización a 121 °C y por su
capacidad de retener agua no se deshidrata fácilmente, lo que permite almacenar los medios por
un largo período de tiempo a 5 °C.

La gelatina no puede reemplazar al agar en la preparación de medios sólidos, ya que

descompuesta por muchos tipos de bacterias. Se añade a los medios de cultivo para estudiar si las
bacterias son capaces de degradarla (presencia de enzimas gelatinasas).

SEGÚN SU UTILIDAD PRACTICA

1. Medios corrientes, comunes o básicos 2. Medios especiales - Medios mejorados

- Medios selectivos o de diagnóstico - Medios diferenciales o indicadores

1. MEDIOS CORRIENTES: son aquellos medios apropiados para el cultivo y mantención de la

mayoría de las bacterias. Sirven de base para la preparación de los medios especiales. - Ejemplo:
Caldo común, Agua peptonada, Agar nutritivo, etc.

2. MEDIOS ESPECIALES: son aquellos medios de cultivo que por su riqueza nutritiva, sirven
para el cultivo de bacterias muy exigentes. Contienen en su formulación sustancias inhibidoras
para ciertas bacterias, que permiten el aislamiento y diagnóstico precoz de aquellas bacterias que
nos interesan por ser los agentes etiológicos de las enfermedades infecciosas. También
pertenecen a este grupo aquellos medios que por adicción de sustancias químicas determinadas,
facilitan el diagnóstico por características bioquímicas de algunas especies microbianas.
Los medios especiales se clasifican en:

2.1. Medios Mejorados: se obtienen añadiendo a los medios corrientes sustancias de mayor
valor nutritivo, que tienen el efecto de proporcionar condiciones favorables para el cultivo de
bacterias exigentes (Ej. Estreptococos, Corynebacterium).

Las sustancias añadidas pueden ser: sangre desfibrinada (conejo, cordero o caballo), suero
sanguíneo (equino), suero fetal bovino, huevo, cerebro, corazón, trozos o extracto de hígado,
carne o levadura, etc.

La mayoría de estas sustancias por ser proteicas coagulan con el calor, lo cual impide que sean
esterilizadas en autoclave. Deben por lo tanto ser esterilizadas por filtración o ser agregadas a los
medios previamente esterilizados, en condiciones de rigurosa asepsia. Ejemplo: Agar Sangre, Agar
Cerebro Corazón, etc.

2.2 Medios Selectivos: generalmente el microorganismo patógeno causante del cuadro

infeccioso que se desea aislar a partir de la muestra, no se encuentra puro sino que convive con
otras especies sin interés diagnóstico. Así por ejemplo es frecuente que las fecas, orina, exudados,
alimentos, agua, etc. estén altamente contaminadas con bacterias saprófitas que por su desarrollo
exuberante en los medios de cultivo corrientes, inhiben el crecimiento o enmascaran la presencia
del agente patógeno buscado.

Los medios selectivos se caracterizan por estimular el desarrollo de ciertas especies bacterianas y
a la vez inhibir el desarrollo de otras especies, lo que permite es aislamiento y diagnóstico de las
bacterias con facilidad y rapidez. Estas características se obtienen por la adición de sustancias tales
como colorantes de anilinas, sales biliares, antibióticos, etc. Ejemplo: Agar Brucella, Caldo Selenito
Cistina, etc.

2.3 Medios Indicadores o Diferenciales: son medios comunes o mejorados, con adicción de
ciertas sustancias que ponen de manifiesto determinadas propiedades bioquímicas, inherentes a
algunas especies bacterianas, como por ejemplo: producción de gas, H2S, de ácidos, de sustancias
alcalinas, acción proteolítica, acción lipolítica, etc.
Estas sustancias o indicadores permiten diferenciar rápidamente una especie microbiana de otra
semejante; por este motivo se denominan medios indicadores o diferenciales. Ejemplo: Agar Baird
Parker, Agar Rambach, etc.

a) El agar Mac Conckey se utiliza para el aislamiento e identificación de Escherichiacoli. Es un

medio mejorado ya que tiene Cristal Violeta y Sales Biliares que inhiben el desarrollo bacterias
Gram positivas.

b) El Caldo Tripticasa Soya es un medio corriente, ya que permite el desarrollo de una amplia
variedad de bacterias. Puede hacerse más selectivo para el desarrollo de Staphylococcusaureus, si
se le agrega un 10% de NaCl, lo que no permite el crecimiento de otras bacterias saprófitas.

SEGÚN SU ORIGEN

1. Origen animal ( Caldo Cerebro Corazón) 2. Origen vegetal ( Caldo papa, Caldo
Levadura ) 3. Sintéticos ( Medios deshidratados )

Los medios de cultivo comerciales deshidratados son productos a los cuales se le ha eliminado el
agua y todas las interferencias de tipo químico, con un pH ajustado, que se han controlado física,
química y bacteriológicamente. Es decir es un producto estandarizado.

COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Según la finalidad, los medios de cultivo pueden tener en su composición los siguientes
ingredientes:

1) Aminoácidos, hidrolizado de proteínas ( peptonas ) 2) Extractos 3) Productos biliados

4) Carbohidratos 5) Productos bioquímicos 6) Colorantes e indicadores

1) Productos Bioquímicos A los medios de cultivo se les agrega generalmente una diversa
variedad de sustancias bioquímicas, que pueden tener el efecto de estimular el desarrollo
bacteriano o ser agentes selectivos, como es el caso de los antibióticos.
2) Colorantes e indicadores Estas sustancias se utilizan en los medios selectivos y
diferenciales. Los colorantes actúan como agentes bacteriostáticos o como inhibidores del
crecimiento. Se utilizan principalmente: Fucsina básica, Verde brillante, Verde de Malaquita,
Cristal Violeta, Eosina, Azul de Metileno, Tionina, etc.

Los indicadores son sustancias químicas que varían de color según el pH del medio. Se utilizan en
los medios diferenciales y permiten visualizar, por cambios de color del medio de cultivo o de las
colonias, la ocurrencia de distintas reacciones bioquímicas.

Los medios de cultivo en microbiología

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una
serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas,
así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los
nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo
contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a

los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una
infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se

licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados.
Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por
aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias
provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como

hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por
dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar
reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos
resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la
formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo
Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-
positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una

serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio
medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo,

carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas
vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las
sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones
químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos

de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su
aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona
que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría
de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen
capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la
peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios
sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y
sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas
actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos
microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como

albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión
de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay
también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal.
Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos
anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno
ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en
condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras
los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas
condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un
buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando
una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los
cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz
solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque
los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o
bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o
incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros
como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores
(hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura
mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de
formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar
los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente
esterilizante)

La evolución de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiología empieza su verdadero desarrollo como ciencia en el momento
en que se descubre el microscopio y comienza la observación de los primeros microorganismos,
pero es indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la utilización del agar como
solidificante, marcan dos importantes puntos de inflexión en su evolución.

La primera noticia de la utilización de medios de cultivo nos llega del micólogo Brefeld, que
consiguió aislar y cultivar esporas de hongos en medios sólidos realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamaño) y no fue
hasta el año 1878 cuando Lister popularizó un método enfocado al cultivo puro basado en
diluciones seriadas en un medio líquido.

Koch realizó sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte
nutritivo sólido, pero no tardó en recurrir al caldo de carne líquido, diseñado por Loeffler, al que,
en 1881, añadió gelatina, logrando un medio sólido transparente ideal para la observación de la
morfología macroscópica de las colonias microbianas.

En el año 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiología en relación con los
medios de cultivo: el médico alemán Walter Hesse introduce el agar-agar (polisacárido extraído de
algas rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se
llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clásicas bandejas de vidrio cubiertas con
campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre las bacterias
quimioautótrofas (utilización de nitrógeno y azufre sobre todo) tuvieron gran importancia en el
desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento. Diseñaron este tipo de medios de tal
forma que su especial composición química favorecía el crecimiento de ciertos tipos de
microorganismos que, en función de sus procesos metabólicos, eran los únicos capaces de utilizar
para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Würtz impulsó el uso de los medios diferenciales, incorporando indicadores de pH a la

composición de ciertos medios con lo cual se podía observar la producción de ácidos en la
fermentación en ciertos microorganismos.
Tipos básicos de medios de cultivo

atendiendo a su estado físico:

líquidos

semisólidos

sólidos

atendiendo a su utilidad práctica:

Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de
hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX,
FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre,
Schaeadler, etc)

selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el
crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando
las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-
Vancomicina)

enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el

cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen

requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación (Lowenstein).

Medios para identificación:

diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas
(nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios
adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación)