David Santiago Barbery Váquiro1, Nilson Steven Alba
Carreño2
Universidad Nacional de Colombia–Sede Bogotá, Facultad de Ciencias,
1,2
Departamento de Química, Laboratorio de Técnicas Básicas en Química,
Cuantificación colorimétrica
de la concentración en
disoluciones de azul de
metileno utilizando
espectrofotometría
Resumen
En las últimas décadas, el increíble desarrollo
y perfeccionamiento de las técnicas
colorimétricas (puntualmente en la
espectrofotometría) han permitido el
reconocimiento de las mismas como asiduas
herramientas en la industria, investigación y
medicina. Es por ello que haciendo uso de
estos procesos aplicados a la Ley de Lambert-
Beer se buscó determinar la concentración de
una única solución acuosa de azul de metileno
problema (P3) a partir de una curva de
calibración construida con los resultados de
absorbancia arrojados por mediciones
preliminares de diferentes diluciones
concentradas de azul de metileno (4 ppm, 3
ppm, 2,5 ppm, 2 pmm, 1,5 ppm, 1 ppm)
provenientes de una única muestra (stock) la
cual contaba con una concentración de 5,00
ppm. Se encontró que la concentración de la
solución problema (P3) fue de 2,26 ppm.
Actualmente este método basado en la Ley de
Lambeert-Beer , pese a sus limitaciones,
resulta muy útil y exacto a la hora de
determinar la concentración de una sustancia
en una disolución desconocida además de
tener fuerte impacto y solidas aplicaciones en
el campo de la ciencia tales como el análisis
cuantitativo de proteínas en la determinación
de ácidos nucleicos incluyendo ARN, ADN y
enzimas.
Palabras clave: espectrofotometría, curva de
calibración, concentración, diluciones, azul de
metileno.
Bogotá D.C., Colombia.
Colorimetric quantification
of concentration in
methylene blue solutions
using spectrophotometry
Abstract
In the last years, the incredible development
and improvement of the colorimetric
techniques (punctually in the
spectrophotometry) have allowed the
recognition of these as assiduous tool in
industry, research and medicine. That is why
using these processes applied to Lambert-
Beer Law, we sought to determine the
concentration of a problem aqueous solution
of methylene blue (P3) from a calibration
curve made with the absorbance results
showed by preliminary measurements of
different concentrated dilutions of methylene
blue ( 4 ppm, 3 ppm, 2.5 ppm, 2 ppm, 1.5 ppm,
1 ppm) from an only simple (stock) which had
5.00 ppm of concentration. It was found the
problem solution (P3) concentration was 2.26
ppm. Currently this method base on Lambert-
Beer law, despite its limitations, its very useful
and accurate to determining concentration of
a substance in an unknown solution in
addition to having strong impact and solid
aplications in science such as the quantitative
analysis of proteins in determination of
nucleic acids including RNA, DNA and
enzymes.
Keywords: spectrophotometry, calibration
curve, concentration, solutions, methylene
blue.
Quantificaçao colorimétrica
Labto. de Técnicas Básicas
da concentraçao em
soluçoes de azul de metileno
usando espectrofotometria
Resumo
Nas últimas décadas, o incrivel
desenvolvimento e aperfeiçoamento das
técnicas colorimétricas (pontualmente na
espectrofotometría) permitiram
reconohece-las como ferramentas assiduas
nas industria, pesquisa e medicina. Por isso,
usando esses processos aplicados a Lei de
Lambert –Beer , procuramos determinar a
concentraçao de uma única soluçao acuosa
do problema do azul de metileno (P3) a partir
de uma curva de calibraçao construida com
os resultados de absorbancia gerados por
mediçoes preliminares de diferentes diluçoes
concentradas de azul de metileno (4 ppm, 3
pmm, 2,5 pmm. 2 ppm, 1,5 ppm, 1 ppm) a
partir de uma única amostra (stock) que tinha
uma concentraçao de 5,00 ppm. Verificouse
que a concentraçao da soluçao de teste (P3)
foi de 2,26 ppm. Atualmente este método
baseado na Lei de Lambert-Beer, a pesar de
suas limitaçoes e muito útil e preciso ao
determinar a concentraçao de uma substancia
em uma soluçao desconhecida alem de ter
forte impacto e applicaçoes solidas no campo
da ciencia tais como a análise quantitativa de
proteínas na determinaçao de acidos
nucleicos incluindo RNA, DNA e enzimas.
Palavras-chave: espectrofometria, curva de
calibraçao, concentraçao, diluçoes, azul de
metileno.
Introducción Tabla 1. Concentración de soluciones patrón.

Concentración del Volumen de solución Volumen de agua (mL)

Las espectrofotometría es una técnica colorimétrica que aprovecha las patrón (ppm) stock (mL)
propiedades de absorción y transmitancia de radiación de una o varias 5.00 Stock Stock
sustancias en solución, y así, a partir de soluciones patrón obtener 4.00 8.00 2.00
información cuantitativa con la que luego se podrán comparar futuras 3.00 6.00 4.00
soluciones; ha cobrado gran relevancia en los últimos años gracias a la 2.50 5.00 5.00
sensibilidad, confianza y calidad en los resultados que brinda. Se emplea un
2.00 4.00 6.00
espectrofotómetro el cual corresponde a un instrumento que nos permite
1.50 3.00 7.00
medir la absorbancia de diluciones a diferentes longitudes de onda. Para este
1.00 2.00 8.00
análisis se utilizó el 3,7-bis(dimethylamino)-phenothiazin-5-ium chloride o
azul de metileno, un compuesto químico utilizado en tinciones para Se muestra el volumen de solución stock tomado y su respectivo afore con agua para
observaciones al microscopio. Adicionado a ello, le atribuye un pigmento completar 10 mL.
intenso al solvente en donde se disocia otorgándole características de
absortividad y transmitancia lo que posibilitara el proceso de medición con Obtención de datos
el instrumento y la subyacente elaboración de una curva espectral que se
tomara como referencia para medir a una longitud de onda determinada la
absorbancia de diferentes diluciones patrón. Para hacer el análisis de las disoluciones se recurrió al equipo LabQuest2
Resulta primordial establecer un parámetro de longitud de onda en el que (Vernier Software & Technology, Beaverton OR 97005, USA) al que se le
van a coincidir todas las mediciones puesto que se tratan de los mismos acopló una interfase SpectroVis Plus Spectrophotometer (Vernier
componentes pero en diferente cantidad. Si nos damos cuenta que la Software & Technology, Beaverton OR 97005) que incluía tres celdas para
concentración tiene una relación lineal con la absorbancia estaremos el análisis (1cm de ancho, 7cm de largo y 1 cm de profundidad). Se inició
enunciando la ley de Lambert-Beer que no solo relaciona la absorbancia con el dispositivo y se configuro en el modo Full Spectrum, una vez allí, se
calibro el sensor utilizando el blanco de reactivos (agua destilada) y se
la concentración, sino también la distancia recorrida por el fotón y la
colocó una muestra en la celda de análisis de la solución 5.00 ppm de azul
constante de absortividad inherente a la naturaleza de cada sustancia; es así
de metileno. Una vez leída la muestra, se registraron los valores de
como a partir de muestras que absorban radiación se puede establecer una
absorbancia de la misma en intervalos de 20 nm hasta completar 19 datos,
curva de calibración para cada sustancia con la cual se va a poder identificar
se tuvo en cuenta la coordenada en donde la solución presentaba mayores
posteriormente la concentración de cualquier dilución de la misma índole lecturas de absorbancia (entorno a los 660.30 nm).
mientras este en el rango de valores calibrados previamente. Aplicando
estos principios se pueden obtener expresiones matemáticas que conjuguen Se repitió el proceso con las demás diluciones, esta vez configurando el
e integren todas las variables constitutivas de las sustancias, es gracias a esto aparato en el modo Time Based, recalibrándolo para evitar errores en la
que la espectrofotometría es la predilecta en muchas investigaciones lectura y definiendo la medición a 660.30 nm correspondiente a la longitud
científicas, biológicas, en la industria e inclusive en la medicina forense. de onda de la primera medición en donde el valor de absorbancia fue
mayor.
Gracias a los avances en tecnología y ciencia, han venido surgiendo
nuevos y mejorados aparatos que son destinados para tareas específicas en
el marco de la colorimetría, además de facilitar la medición y obtención de
datos, disminuir drásticamente los errores por reflexión de luz e incluso
Resultados y Discusión
algunos pueden desempeñar un amplio abanico de técnicas colorimétricas.

Construcción de la curva espectral

Materiales y métodos La información correspondiente a la absorbancia de la solución stock
tomada a diferentes longitudes de onda se tabulo a fin de presentar
adecuadamente la información y servir como molde para la construcción de
Preparación de diluciones patrón la curva. (Tabla 2).
Tabla 2. Absorbancia de la solución stock a diferentes longitudes de onda.
Se utilizó una solución de azul de metileno 5 ppm elaborada previamente
en el laboratorio (stock), posterior se prepararon diluciones con volumen 10
ml cuyas concentraciones fueron estandarizadas (Tabla 1). Para ello se Longitud de onda (nm) Absorbancia (0,001) (U.A)
tomaron alícuotas de solución stock de acuerdo al volumen calculado con 380.40 0.043
la igualdad Vi.Mi = Vf.Mf, se llevaron a un matraz de 10.00 0.01 mL y se 400.60 -0.030
aforó con agua. También se preparó un blanco de reactivos el cual, para este
caso, fue agua destilada. 420.80 -0.065
440.10 -0.051
460.30 -0.026
480.50 -0.006
500.70 0.025
 Cuantificación colorimétrica de la concentración en diluciones de azul de metileno utilizando espectrofotometría

Continuación de la Tabla 2.
Es importante identificar el valor de longitud de onda en el que la
absorbancia es máxima para de esta forma replicar las medidas con
520.20 0.036
esta longitud de onda y así asegurar que la transmitancia sea mínima
540.20 0.069 y las mediciones sean lo más certeras posibles.
560.20 0.125
580.20 0.206
Construcción de la curva de
600.00 0.357
620.10 0.445 calibración
640.20 0.551
660.30 (*) 0.720(*) El resultado de las mediciones de absorbancia del
680.50 0.380 restante de diluciones se expresa en la Tabla 3.
700.00 0.076
720.00 0.030 Tabla 3. Absorbancia de diluciones patrón de azul de metileno.
760.70 0.018 Concentración dilución patrón Absorbancia (0.001)(U.A)
(*) Valor máximo de absorbancia (ppm)
4.00 0.515
Las mediciones se realizaron en el rango del espectro visible. Se
observa como en principio los valores son negativos lo que indica que 3.00 0.362
la muestra no absorbe radiación electromagnética de esa longitud de 2.50 0.322
onda, contrario a ello, los valores de absorbancia aumentan a medida
que la longitud de onda es mayor llegando a un punto extremo en 2.00 0.234
donde el espectro alcanza su rango mayor. Se construyó la curva 1.50 0.227
espectral con los 19 datos de absorbancia de la solución stock tomados
a diferentes longitudes de onda (Figura 1). 1.00 0.114

Analizando la información contenida en la tabla se logra reconocer una

relación lineal directa entre la absorbancia y la concentración, esto
comprende un aspecto clave del estudio, pues al ser estas variables
directamente proporcionales, se estaría cumpliendo la Ley de Lambert-
Beer (una muestra absorberá mayor radiación cuando la concentración de
la disolución sea mayor), no obstante, hay que tener en cuenta que esta
Ley presenta una gran limitante, pues no aplica para soluciones muy
concentradas (superior a 1M).
Es aquí en donde se da uso a la ecuación Lambert-Beer A=.l.c en donde:
A: absorbancia, : coeficiente de extinción; l: longitud de la celda (cm),
c: concentración de la disolución. Dado que tenemos una relación lineal
entre absorbancia y concentración y que la variable “l” es igual a 1 (la
celda que se utilizó para el análisis tenía 1 cm de anchura), se hace posible
la construcción de una curva de calibración (Figura 2B) con los puntos
que nos brinda la Tabla 3 (Figura 2A).

A)
Figura 1. Curva espectral disolución stock de azul de metileno. Con
claridad se observan el pico máximo y el mínimo.

Se puede afirmar que la solución toma su punto máximo en la longitud

de onda correspondiente al color rojo, es decir, si se irradiase luz roja
sobre la muestra podríamos observar que la transmitancia de esa
solución será casi nula, de lo contrario, si irradiásemos luz violeta con
seguridad la transmitancia de dicha solución será alta. B)
En concordancia con lo anterior, y analizando los resultados
objetivamente se puede expresar manifestativamente que la relación
entre absorbancia y transmitancia es linealmente inversa pues si una
aumenta la otra disminuye y viceversa. En este principio nos basamos
para anticipar los resultados y garantizarnos que el proceso se estaba
llevado a acabo correctamente. En efecto, es un principio que se aplica
a toda sustancia en dilución, siendo uno de los pilares fundamentales
en la espectrofotometría.

3
 D. Barbery-Váquiro, N. Alba-Carreño

Figura 2. Absorbancia en función de la concentración. A) Relación de

coordenadas pseudolineales dispuestas en el espacio. B) Línea de tendencia
Conclusiones
equidistante a todos los puntos.
En conclusión, nos hemos familiarizado con el espectrofotómetro y su
Como la relación fue encontrada lineal, se trazó una recta que abarcara adecuado uso, aprendiendo su funcionalidad y capacidad en la lectura de
equidistantemente las coordenadas, con esto simularíamos generalizando medidas de absorbancia y longitud de onda en una solución en diferentes
una línea recta con infinitos puntos pertenecientes a esta, en donde se modos, además de los cuidados pertinentes que se deben tomar y el uso de
incluyen los valores de absorbancia de las diluciones patrón y en cuyo un blanco de reactivo como calibrador del instrumento para evitar
dominio se puede encontrar la concentración de cualquier dilución desviaciones en las medidas.
conociendo su absorbancia y viceversa. La ecuación lineal y=0,1365x-
0,019 que es análoga a A=.l.c establece que los valores constantes  y l Se ha construido satisfactoriamente una curva de calibración aprovechando
corresponden a 0,1365, los pares coordenados x,y son la concentración de la relación lineal existente entra la absorbancia y la concentración de una
la solución y la absorbancia respectivamente y -0,019 es el intersecto con sustancia a partir de un diagrama de dispersión aplicando a éste una regresión
el eje de las ordenadas. Para hallar cualquier variable basta con despejarla lineal y de esta forma generar una recta con su respectiva ecuación y 𝑅2 .
de la ecuación, pero se necesita conocer el valor de alguna de las dos. Se cuantificó la concentración de azul de metileno en la solución problema
De la solución problema P3 de concentración desconocida podemos medir P3 exitosamente usando la curva de calibración como patrón contra el cual
la absorbancia gracias al espectrofotómetro, como se mencionó se comparó la absorbancia de dicha solución problema a través de la ecuación
anteriormente, basta conocer el valor de una de las 2 variables para hallar de la recta.
la otra, en este caso conocemos la absorbancia y queremos cuantificar la Además de esto, nos hemos contextualizado del uso de la colorimetría, más
concentración, para esto comparamos la absorbancia con la curva de específicamente la espectrometría y las aplicaciones de la ley de Lambert-
calibración a través de la ecuación y al despejarla obtenemos que la Beer en la medicina, biología y demás campos de la ciencia que son cruciales
𝑦−0.019
concentración 𝑥 en la solución problema P3 está definida por 𝑥 = , en el desarrollo actual del ser humano.
0.1365
al reemplazar 𝑦 por el valor medido de la absorbancia de dicha solución
problema y resolver algebraicamente obtenemos que la concentración de la
solución problema P3 es de 2.26 ppm, Este valor de concentración resultó Bibliografía
cercano al intuido basados en la coloración de la solución, puesto que no
tenía la misma intensidad en el color azul como la solución muestra (stock)
de 5 ppm, por el contrario se lograba observaba un tenue tinte azul en su http://www.iib.unsam.edu.ar/archivos/docencia/licenciatura/biotecnologia
apariencia. /2018/QuimicaBiol/1527862563.pdf TRABAJO PRÁCTICO N°5, ÁCIDOS
NUCLEICOS, DOCENTES DR. ANDRÉS CIOCHINNI, DRA.
Como esta curva solo aplica para un tipo de disolución y para el dominio GABRIELA NIEMIROWICZ.
de absorbancia medido podría resultar desventajoso en cuanto al factor
tiempo ya que se precisa del preparar múltiples diluciones patrón y medirlas UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. Facultad de Ciencias,
una a una, elaborar un blanco de soluciones y adaptar y calibrar el equipo. Departamento de Química. Guía LABORATORIA DE TÉCNICAS
Sumado a esto se encuentra el inconveniente de no poder adquirir BÁSICAS I de 2019. Pág. 43-56
fácilmente el instrumento de medida debido a su costo el cual es elevado https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/quimbiotec/FQpractic
según el mercado actual, además de sumos cuidados que se deben tener a a4.pdf FUNDAMENTOS DE QUÍMICA-PRÁCCTICA 4
la hora de manipularlo, pues utiliza lámparas especializadas que son
delicadas y es susceptible a vibraciones, de modo que si la muestra en
análisis es perturbada, la medición se altera y es necesario repetir el 1.
procedimiento, adicionado a ello, cuando se trabaja con analitos acuosos, elgado, D. R.; Rodríguez, G. A.; Martínez, J. A.; Rojas, J. H.; Martínez, F.
se debe garantizar que el interior de la ranura en donde se dispone el analito Validación de una metodología analítica empleando espectrofotometría
se mantenga seco pues, inmediatamente al contacto con el agua las lentes ultravioleta para el estudio de la solución de algunas sulfamidas en mezclas
se pueden deteriorarse inutilizando el aparato. cosolventes alcohol + agua. Rev Colomb Quim. 2013. 42(3): 31-40
Cabe señalar que no todas las disoluciones poseen una misma curva 2.
espectral y en consecuencia la misma curva de calibración, a lo que habrá artín, J.F & Castañeda, J. (2016) Análisis de la clorofila de spinacia oleracea
que responder: ¿qué factores inciden en que una muestra absorba una cierta y cuantificación de albumina de espagueti utilizando espectrofotometría.
longitud de onda y transmita otra? La respuesta a este planteamiento en UGCiencia 22, 99-109.
sencilla, las moléculas que conforman una sustancia o un cuerpo se excitan
cuando se hace incidir una fuente de radiación ya sea electromagnética,
lumínica o ionizante, esta excitación se da gracias a que la energía se va
propagando a través de los orbitales atómicos de un menor nivel energético
a uno mayor, sin embargo, este estado no es estable, por lo que las
moléculas rápidamente descargan esa energía acumulada y es allí en donde
se retransmite hacia el exterior. En resumen, las características de cuánto
absorberá una muestra y a que longitud de onda lo hará en mayor o menor
grado, corresponde a la naturaleza de la sustancia en sí misma.
Adelantados estudios en química han demostrado que en la industria
farmacéutica se aplica necesariamente la técnica de espectrofotometría, una
de estas aplicaciones se usa en el estudio de la solubilidad de sulfoamidas
en mezclas de alcohol + agua, para determinar la posibilidad del diseño de
fármacos para combatir la tuberculosis no sin antes determinar las
propiedades fisicoquímicas de las sulfoamidas [1]. Así mismo puede
manifestarse como un recurso para concretar los niveles de clorofila en
productos vegetales, aplicación integral en agronomía y biología [2].

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Cuantificacion colorimétrica de la concentración en disoluciones de azul de metileno utilizando espectrofotometría