Inoculación en plantas
Métodos de inoculación
Curso: Métodos en fitopatología
Unidad de Fitopatología
Dto. de Protección Vegetal
Facultad de Agronomía.
Dr. Pedro Mondino
24 de abril al 5 de mayo de 2012
Inoculación de plantas
„ El inóculo de hongos puede ser: Esporas o
micelio, mientras que en el caso de bacterias es
la propia célula bacteriana.
„ En general se debe tener en cuenta cual es la
manera en que naturalmente penetra a la planta
dicho inóculo.
„ Por ejemplo: en aquellos casos en que el
patógeno penetra por heridas será conveniente
depositar el inóculo en una herida.
Inoculación de plantas
„ Podemos inocular para probar patogenicidad.
En ese caso, si no lo hacemos de manera
correcta podemos llegar a resultados erróneos
en el diagnóstico.
„ Podemos inocular plantas para evaluar el
efecto de alguna medida de control. Por
ejemplo evaluar el efecto de un fungicida o de
un producto biológico.
„ La inoculación en plantas la realizamos con el fin de
producir enfermedad a las mismas o, en el caso de
controladores biológicos, para protegerlas del ataque de
patógenos.
„ Debemos disponer de inóculo viable.
„ Debemos poner ese inóculo en contacto con la planta.
„ La planta debe estar en un estadio susceptible.
„ Debemos dar las condiciones necesarias para que ese
inóculo colonice la planta y se produzca la enfermedad.
Inoculación de plantas
„ Es muy importante conocer cual es la cantidad
mínima de inóculo necesaria para producir
infección.
„ En un ensayo en que inoculamos una serie de
plantas es necesario que todas sean inoculadas
de la misma manera y con cantidades similares
de inóculo.
„ Luego de la inoculación es común mantener a
las plantas en condiciones de humedad y
temperatura apropiadas para que el patógeno
pueda desarrollarse.
Inoculación de plantas
„ En los ensayos es esperable que las plantas
testigo manifiesten la enfermedad, mientras que
las plantas tratadas (si el tratamiento es
efectivo) los niveles de enfermedad sean
menores.
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 Inoculación de bacterias Inoculación de bacterias

„ Las bacterias pueden inocularse mediante la

aspersión de los órganos de la planta con una
suspensión de células bacterianas.

„ Es necesario saber ajustar la concentración en

la suspensión de bacterias.

„ Inoculación de hojas con una suspensión bacteriana. Mediante

carborundum se producen pequeñas heridas.

Inoculación de bacterias Inoculación de bacterias

„ Resultado de la Inoculación de hojas. „ Embolsado para mantener la humedad de los brotes inoculados.

Inoculación de bacterias Inoculación de bacterias

„ Inoculación de Pseudomonas syringae pv papulans en frutos

de manzana mediante aspersión con una suspensión de
„ Aparición de síntomas. esporas.

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 Inoculación de bacterias Inoculación de bacterias

„ Papa infectada por Ralstonia solanacearum mostrando la

„ El racimo de frutos luego de inoculados son embolsados para evitar zooglea.
inoculaciones naturales.

Inoculación de bacterias
Inoculación de bacterias

„ Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum „ Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum
mostrando marchitamiento de la hoja. La inoculación se mostrando marchitamiento de la hoja. La inoculación se
realizó mediante punción en una yema lateral. realizó mediante punción en una yema lateral.

Inoculación de bacterias Inoculación de bacterias

„ Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum „ Inoculacion de Xanthomonas campestris pv cucurbitae
mostrando marchitamiento de la hoja.
mediante aspersion de cotiledones

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 Test de hipersensibilidad en NO
Inoculación de suelo
Huésped
„ Ralstonia inoculada mediante riego con suspension
bacteriana

„ Método de inoculación mediante infiltración del mesófilo..

Test de hipersensibilidad en NO Test de hipersensibilidad en NO

Huésped Huésped
„ Resultado de la inoculación (mesófilo infiltrado) izq.
„ Resultado positivo (reacción de hipersensibilidad) der.
„ Resultado positivo

Diferentes tipos de inoculación Inoculación de frutos

„ Inoculación en plantas de olivo de hojas, tallos, raíces y cuello
„ A partir de una colonia esporulada se realiza una suspensión de
conidios en suero fisiológico estéril.
Tallos
„ Pequeñas heridas de 1 a 2 mm de profundidad se practican con
un objeto punzante en la zona ecuatorial de los frutos.
„ Cada herida es inoculada con 10 microlitros de una suspensión
de esporas de 104 esporas/ml

Cuello

Raíz Hojas

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 Inoculación de frutos Inoculacion de frutos

„ Inoculación de frutos cítricos con 10 µl una

suspensión de esporas de Penicillium digitatum (104
conidios/ml)

Inoculación de frutos Frutos de manzana inoculados

Secado a temp. Almacenamiento 1
Desinfección mes a 5ºC
superficial ambiente (2hs)

Herida
Inoculación de heridas con Inoculación de heridas con control
suspensión de antagonista Herida protegida
suspensión de patógeno

Inoculación de frutos Inoculación de frutos

„ Inoculación de frutos de kiwi con una suspensión de „ Inoculación se zapallos con Fusarium spp.
esporas de Botrytis cinerea

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 Inoculación de hojas mediante aspersión
Inoculación de frutos
de suspensión de esporas
„ Inoculación de zapallos con Fusarium spp. „ Manchas de las hojas y fruto de manzanos
causados por Glomerella cingulata en Río Grande
do Sul, Brasil.
„ Método: aspersión con una suspensión de 106
conidios/ml

Inoculacion con discos de micelio Inoculacion con discos de micelio

„ Botryosphaeria spp. „ Los discos son colocados sobre la rama previamente herida
„ Mediante sacabocado se marcan los discos de micelio superficialmente.
sobre la placa „ Posteriormente se cubre con film

Inoculación con discos de micelio Inoculación con discos de micelio

„ Cada rama se identifica. „ Resultado de la inoculación con diferentes aislamientos de
Botryosphaeria spp.

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Inoculación con discos de micelio
„ Resultado de la inoculación en plántulas de arándano
con discos de micelio de Botryosphaeria clavispora.
Inoculación de suelo
„ Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron.)
Deighton, agente causal de la mancha ocular del
trigo.
„ Inoculación de suelo estéril mezclando con trozos de
tallos afectados, y sembrando semillas de una
variedad susceptible, desinfectadas superficialmente.

Inoculación del sustrato Inoculación en bandejas

„ Inoculación con discos de micelio de Pythium „ Inoculación de lechuga con discos de micelio de
Sclerotinia sclerotiorum

Inoculación de tallos mediante discos de Inoculación al suelo.

micelio

„ Mediante riego de una

suspensión de conidios
(haciendo heridas o no)

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 Inoculación de semillas Inoculación de semillas
„ Inoculación de plantines de citrus „ Resultado

Inoculación de semillas Cuantificación de esporas

„ Uso de la cámara de Neubauer
„ Bacterización de semillas

Cámara de Neubauer Cámara de Neubauer

„ Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro. „ Esquema

„ en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un
diamante una cuadrícula .
„ Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos
lineas consecutivas de 0.25 mm.
„ Así pues el área de un cuadrado corresponde a 1 milimetro
cuadrado.
„ La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm
respecto a la superficie.
„ De forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista
de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen
comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.

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 Cámara de Neubauer Cámara de Neubauer
„ Si contamos las cuatro áreas sombreada (L)
observando un total de 20 esporas (en las cuatro áreas „ En la cámara de Neubauer el límite mínimo de conteo
sumadas) es de 1 x 104 esporas/ml.
„ la concentración en la suspensión será :
„ concentración en la suspensión (esporas / mL) =
(20/4) y eso multiplicado por 10.000
„ 5 x 104 esporas por mililitro.

5 esporas por cada 0,1 microlitro

50 por microlitro
50.000 por mililitro

Recuento en placa Recuento en placa

„ Consiste en sembrar en placas con medio de cultivo
alícuotas de la suspensión de microorganismos.
„ las condiciones óptimas de conteo se dan cuando se
desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa.
„ Como las colonias pueden originarse tanto de una
célula como de un grupo de células, se utiliza el
término: UNIDADES FORMADORAS DE
COLONIAS (u.f.c.).
„ Se preparan diluciones sucesivas de 1 en 10.
„ Para la segunda dilución se toma 1 mL de la primer
dilución y se descarga en 9 mL de diluyente y así
sucesivamente
„ Las diluciones a sembrar se eligen según la carga
esperada o permitida.
„ Generalmente, se siembran no menos de tres
diluciones consecutivas.
„ Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3).

Diluciones Diluciones

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 Recuento en placa Recuento en placa

„ Este método permite determinar sólo las células

microbianas viables

„ Esquema

Siembra en superficie Uso de la filtración

„ Cuando la concentración es baja mediante filtración y
„ Se deposita 0.1 mL de cada dilución en la superficie
de las placas que ya contienen el medio de cultivo. siembra del filtro se pueden medir la concentración de
„ Se realiza duplicado para cada dilución. bacterias en medio liquido.
„ Se emplea la misma pipeta para todas las diluciones
comenzando por la más diluida.
„ Se debe extender sobre toda la superficie de la placa
usando un rastrillo estéril.
„ Se usa un único rastrillo para todas las diluciones en el
mismo orden (de la más diluida a la más concentrada)

Escala de Mc Farland Escala de Mcfarland

Tubo Cl2Ba al 1% SO4H2 al 1% u.f.c./ml.
1 0,1 9,9 3,0 x 108
2 0,2 9,8 6,0 x 108
3 0,3 9,7 9,0 x 108
4 0,4 9,6 1,2 x 109
5 0,5 9,5 1,5 x 109
6 0,6 9,4 1,8 x 109
7 0,7 9,3 2,1 x 109
8 0,8 9,2 2,4 x 109
9 0,9 9,1 2,7 x 109
10 1.0 9,0 3,0 x 109

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