El ensayo del cometa: un método para medir el daño del ADN en células individuales

Peggy L Olive y Judit P Banáth Centro de Investigación del Cáncer de la Columbia Británica, 675 W. 10th
Avenue, Vancouver, Columbia Británica V5Z 1L3, Canadá. La correspondencia debe ser dirigida a la OLP.
(polive@bccrc.ca)

Publicado en línea el 27 de junio de 2006: doi: 10.1038 / nprot.20

Presentamos un procedimiento para el ensayo del cometa, un método basado en electroforesis en gel
que se puede usar para medir el daño del ADN en células eucarióticas individuales. Es versátil,
relativamente simple de realizar y sensible. Aunque la mayoría de las investigaciones hacen uso de su
capacidad para medir roturas de una sola hebra de ADN, las modificaciones al método permiten la
detección de roturas de doble hebra de ADN, enlaces cruzados, daño de la base y núcleos apoptóticos.
El límite de sensibilidad es de aproximadamente 50 roturas de hebra por célula diploide de mamífero. El
daño al ADN y su reparación en suspensiones unicelulares preparadas a partir de levaduras, protozoos,
plantas, invertebrados y mamíferos también se pueden estudiar utilizando este ensayo. Originalmente
desarrollado para medir la variación en el daño del ADN y la capacidad de reparación dentro de una
población de células de mamíferos, las aplicaciones del ensayo del cometa ahora van desde la
biomonitorización animal humana y centinela (por ejemplo, el daño del ADN en lombrices de tierra que
se arrastran a través de sitios de desechos tóxicos) hasta el daño de medición en genómica específica.
secuencias El protocolo se puede completar en menos de 24 h

INTRODUCCIÓN

Desarrollo del método El concepto de electroforesis de microgel se introdujo por primera vez en 1984
por Ostling y Johanson como un método para medir las roturas de una sola hebra de ADN que causaron
la relajación de los superenrollamientos de ADN. Singh y sus colegas publicaron una versión modificada
en 1988, que utilizaba condiciones alcalinas2. La idea era combinar la electroforesis en gel de ADN con
microscopía de fluorescencia para visualizar la migración de las cadenas de ADN de las células
individuales integradas en agarosa. Si el ADN cargado negativamente contenía roturas, los supercoils de
ADN se relajaron y los extremos quebrados pudieron migrar hacia el ánodo durante una breve
electroforesis. Si el ADN no estaba dañado, la falta de extremos libres y el gran tamaño de los
fragmentos impidieron la migración. La determinación de la cantidad relativa de ADN que migró
proporcionó una forma sencilla de medir el número de roturas de ADN en una célula individual. Aunque
a mediados de la década de 197034 se introdujeron métodos igualmente sensibles para la detección de
roturas de una sola hebra de ADN34, tres hechos (además del atractivo obvio de ver "el ADN dañado")
hicieron que este método fuera atractivo. Primero, solo se requerían alrededor de mil celdas. En
segundo lugar, las células no necesitaban ser etiquetadas con un radioisótopo, lo que permitía medir el
daño en cualquier célula nucleada. Quizás lo más importante, el método podría usarse para medir las
variaciones en la respuesta de los agentes que dañan el ADN entre células de la misma población
expuesta. En 1990, se introdujo una modificación del método original de Ostling y Johanson, que se
denominó "ensayo del cometa" después de su aparición. del ADN de una célula individual. La cabeza
del cometa que contiene el ADN de alto peso molecular y la cola del cometa que contiene los extremos
principales de los fragmentos migratorios se midieron en tiempo real a partir de imágenes digitalizadas
utilizando un software desarrollado para este fin. El momento de la cola, una medida de la cantidad de
ADN en la cola y la distribución del ADN en la cola, se convirtió en un descriptor común junto con la
longitud de la cola y el porcentaje de ADN en la cola. El grupo de interés del ensayo del cometa ofrece
una introducción útil a esta área, información útil sobre varios protocolos y sistemas de análisis de
imágenes, y un foro para la discusión de temas relacionados con este método (http://cometassay.com)

Aplicaciones del ensayo del cometa

Desde el desarrollo inicial del ensayo del cometa, se han realizado esfuerzos para mejorar la sensibilidad
y la fiabilidad del ensayo, extender las aplicaciones al análisis de diversos tipos de daño al ADN en
diversos tipos de células 7-9, aumentar la capacidad de manejo de muestras0 ,, y estandarizar los
protocolos y analisis12. Varios grupos13,14 realizaron esfuerzos para optimizar la concentración de
agarosa, los tampones de lisis y las tinciones de ADN. Se introdujo una versión del método realizado en
condiciones neutrales que permitió la detección de roturas de doble cadena del ADN
independientemente de la presencia de roturas de una sola cadena15. El daño de la base se puede
identificar incubando células lisadas con endonucleasas específicas del daño de la base antes de la
electroforesis16. Los enlaces cruzados entre cadenas se pueden identificar por la falla en la detección de
roturas de una sola cadena que se sabía que estaban presentes17. La extensa fragmentación del ADN
que se produce en las células apoptóticas hace que estas células sean fáciles de detectar18 La capacidad
de medir la heterogeneidad en respuesta a los agentes de envejecimiento del ADN se probó por primera
vez en células expuestas al fármaco quimioterapéutico contra el cáncer, la bleomicina9. Una amplia
gama de apariencias de los cometas indicó que algunos núcleos contenían grandes números de roturas
de cadenas, mientras que otros estaban intactos. La importancia de la heterogeneidad en el daño del
ADN para explicar la resistencia al tratamiento del cáncer se demostró posteriormente en células de
modelos de tumores animales y biopsias clínicas20-22. El potencial para predecir la respuesta tumoral a
tratamientos específicos que causan daños en el ADN se ha demostrado ahora para varios agentes23-25.
Gran parte del interés en este método proviene de sus aplicaciones potenciales en la biomonitorización
humana y en la evaluación ecológica de organismos centinela expuestos a contaminantes
ambientales26. Las nuevas aplicaciones incluyen la identificación con perlas magnéticas de los
marcadores de la superficie celular presentes en las células integradas en agarosa27 y la hibridación in
situ fluorescente para detectar efectos específicos de secuencia en ADN dañado 28,29 nants26.

Las nuevas aplicaciones incluyen la identificación con perlas magnéticas de marcadores de superficie
celular presentes en las células integradas en agar y la hibridación in situ fluorescente para detectar
efectos específicos de secuencia en ADN dañado28,29 Variaciones en el método para células de
mamíferos Aunque existen varios protocolos para preparativos, lisado de células Como resultado de la
electroforesis y la tinción de los portaobjetos, los resultados son notablemente más o menos un exceso
de 1.000 veces más de roturas de una sola hebra frente a una doble hebra, incluso a concentraciones
milimolares36. Debe enfatizarse que la simple realización del ensayo del cometa en condiciones no
desnaturalizantes no Asegurar la medición de roturas de doble hebra de ADN. De hecho, el método
original de Ostling y Johanson utilizó lisis neutra, pero los autores pensaron claramente que estaban
detectando una pérdida del superenrollamiento de ADN causada por roturas de la cadena de ADN.
Debido a que alrededor de 2.000 o más descansos son adecuados para relajar todos los supercoils, el
método se limitó a la detección de roturas de una sola hebra a niveles de daño más bajos. La versión del
procedimiento descrito aquí realizado en condiciones neutrales se puede usar para medir la doble hebra
en un rango de aproximadamente 50-10,000 roturas por celda Limitaciones del método similar para las
células de mamíferos usando la mayoría de los métodos publicados. Las diferencias más significativas
son la duración de la incubación en la solución alcalina y salina, y si una etapa de lisis del detergente
precede a la etapa 2 de desnaturalización alcalina. Aquí incluimos un período de lisis durante la noche
para una sensibilidad y reproducibilidad óptimas14, pero hay ventajas para completar el protocolo en un
tiempo más corto. Al igual que con todas las técnicas, prestar una atención rigurosa a los detalles
técnicos mejorará la reproducibilidad del ensayo. Para la monitorización biológica, existen importantes
ventajas en la estandarización de los protocolos de análisis de cometas y los métodos de análisis. Las
recomendaciones para realizar el ensayo del cometa para este propósito han evolucionado a partir de
varios talleres y grupos de trabajo2,30-32. También están disponibles las consideraciones de varios
enfoques estadísticos3,34 Los resultados de varias mediciones del daño del ADN por análisis no suelen
distribuirse normalmente. Por lo general, los valores medios o medianos para 25-100 cometas junto con
los valores del percentil 75, que se muestran como una gráfica de caja, pueden describir adecuadamente
la mayoría de los conjuntos de datos Las gráficas bivariadas del porcentaje de ADN en la cola versus el
contenido de ADN también son útiles para apreciar el papel de Ciclo celular o ploidía en el daño del
ADN. Cuando el objetivo es medir la heterogeneidad en la degradación del ADN dentro de una
población, se analizan más cometas y también se deben modificar los métodos de análisis de datos35.
Sigue habiendo discusión sobre qué descriptor de cometa puede describir mejor los resultados.
Porcentaje de ADN en la cola, longitud de la cola (solo en niveles de daño bajos) y momento de la cola,
que es el porcentaje de ADN en la cola multiplicado por la distancia entre los medios de Las
distribuciones de cabeza y cola son todas medidas útiles. A continuación se describen dos variaciones en
el protocolo del cometa. El primero puede usarse para detectar la combinación de roturas de una sola
hebra de ADN, roturas de doble hebra y sitios lábiles alcalinos en el ADN del cometa. Si bien se
recomienda un tiempo de lisis prolongado para permitir que una cantidad suficiente de ADN
desnaturalizado se desenrolle de los puntos de ruptura, los tiempos de lisis más cortos son suficientes
para fines de detección. Aunque no se describen aquí, las modificaciones de este método también se
pueden usar para detectar enlaces cruzados de ADN y daños en la base30. El segundo procedimiento se
realiza en condiciones neutrales y detecta solo roturas de doble cadena de ADN. Esto se puede
confirmar tratando las células con peróxido de hidrógeno que proproduce un exceso de 1.000 veces o
más de roturas de una sola hebra versus hebra doble, incluso a concentraciones milimolares36. Se debe
enfatizar que el simple hecho de realizar el ensayo en condiciones no desnaturalizantes no garantiza la
medición de las roturas de doble cadena del ADN. De hecho, el método original de Ostling y Johanson
usó lisis neutra, pero los autores pensaron claramente que estaban detectando una pérdida de
supercoiling de ADN causada por ADN sin gle-strad brks. Debido a que alrededor de 2.000 o más
descansos son adecuados para relajar todos los supercoils, el método se limitó a la detección de roturas
de una sola hebra a niveles de daño más bajos. La versión del procedimiento descrito aquí realizado en
condiciones neutrales se puede usar para medir la doble hebra en un rango de aproximadamente 50-
10,000 roturas por celda Limitaciones del método La capacidad de analizar células individuales es una
ventaja en términos de identificar subpoblaciones Que responden de manera diferente al tratamiento.
Sin embargo, existen limitaciones prácticas para el número de células y muestras que pueden analizarse.
Al mejor nivel, se pueden calificar 600 capas por hora si se analizan individualmente, y en el orden de 50
diapositivas por día se pueden calificar utilizando sistemas automatizados. Como se indicó
anteriormente, el tamaño de muestra recomendado de 50 cometas puede no ser adecuado si existe una
heterogeneidad significativa en la degradación del ADN en una población. Una segunda limitación es el
requisito de una suspensión de células únicas viable. Si las muestras contienen células
predominantemente necróticas o apoptóticas, no se puede obtener información precisa sobre la
presencia de lesiones específicas como roturas de cadenas o daños en la base. Se deben desarrollar
métodos de agregación de tejidos para minimizar cualquier daño al ADN producido por el
procedimiento. Si se realiza de manera suficientemente rápida, los métodos de disociación mecánica
(corte y filtrado) pueden ser efectivos37. Pero debe considerarse la posibilidad de que haya una pérdida
preferencial de células muy dañadas durante la preparación de una sola célula. El ensayo del cometa no
proporciona información sobre el tamaño del fragmento de ADN desde el período del fragmento. En
cambio, a medida que aumenta el número de rupturas de ADN, los bucles superenrollados se relajan,
más extremos libres pueden migrar y, por lo tanto, no se separan en forma citotóxica durante la elección
corta

Figura 1 | Las relaciones típicas de dosis-respuesta para células humanas expuestas a radiación
ionizante utilizando los dos métodos descritos en este protocolo (a, b) células de linfoblasto humano
WIL2NS se examinaron utilizando el método alcalino durante la noche que detecta roturas de una sola
hebra de ADN, roturas de doble hebra y álcalis. Lesiones lábiles. (c, d) Se examinaron células de
carcinoma cervical humano SiHa utilizando el método de lisis neutra que detecta roturas de doble
cadena. Las suspensiones de células individuales se expusieron a rayos X en hielo para inhibir la rotura
de la hebra. En a y c se muestran los resultados de los controles (izquierda), después de 2 o 30 Gy (gris;
medio) y después de 8 o 60 Gy (derecha). Los gráficos en b y d muestran las curvas de dosis-respuesta
típicas (media t s.d .; n 3). Note la diferencia de 40 veces en las pendientes de las dos curvas de dosis-
respuesta, consistente con la diferencia en la inducción de roturas de una sola hebra frente a roturas de
doble hebra por radiación ionizante. Se muestra la apariencia de las imágenes microscópicas de los
cometas representativos para las tres dosis, y los gráficos bivariados del contenido de ADN versus el
momento de la cola del cometa indican la respuesta de las células individuales en varias fases del ciclo
celular (a, c). Aunque el ADN de la fase S contiene el mismo número de roturas de cadena simple y
doble inducidas por radiación por Dalton, en condiciones de desnaturalización, las horquillas de
replicación aparecen como roturas de una sola cadena y, por lo tanto, el ADN de la fase S migra más
rápido que el ADN de las células en G1 o Fase G2 Lo contrario ocurre con el método neutro porque las
burbujas de replicación en las células de la fase S retrasan la migración del ADN durante la electroforesis

una fracción mayor del ADN se aleja del calor del cometa Se puede obtener cierta información midiendo
la distribución del daño del ADN en la cola del cometa, pero la medición precisa del tamaño del
fragmento requerirá el uso de una técnica como la electroforesis en gel de campo pulsado38. Las células
que replican activamente su ADN se comportan de manera diferente durante la electroforesis en gel, y
esto puede confundirse con una diferencia de sensibilidad inherente. En condiciones alcalinas, las
horquillas de replicación se comportan como roturas de una sola cadena, de modo que el ADN de la fase
S migra más rápidamente. En condiciones neutrales, el ADN de fase S funciona como burbujas de
replicación que retardan la migración durante la electroforesis39. Este problema es evidente en la Figura
1. Pero como el ensayo del cometa puede proporcionar una medida tanto del contenido de ADN como
del daño al ADN, es posible analizar el daño en cualquier fase del ciclo celular. La interpretación de los
resultados del cometa se complica por el hecho de que no existe una relación simple entre la cantidad de
daño en el ADN causado por un químico específico y el impacto biológico de ese daño. Cada
medicamento puede diferir en términos de la cantidad de rupturas de ADN que están asociadas con un
efecto biológico dado36. Los productos químicos que producen líneas cruzadas entre cadenas se
eliminan mediante bloqueos de las roturas de una sola hebra17,22. Por esta razón, el análisis de los
efectos de mezclas de fármacos o un fármaco con dos mecanismos diferentes para producir daño en el
ADN puede ser particularmente problemático. Es necesario comparar los resultados del ensayo del
cometa con otras medidas de daño en el ADN (por ejemplo, micronúcleos, mutaliones, niveles de
aductos, aberraciones de cromosomas o muerte celular) para interpretar el efecto biológico.

Relevancia del daño. Es importante apreciar que el daño al ADN medido en el ensayo del cometa no es
necesariamente un resultado de genotoxicidad directa; el daño mitocondral o de la membrana puede
causar una fragmentación extensa del ADN a través de la apoptosis o necrosis. Muchos investigadores
están interesados en examinar la capacidad de reparación de ADN de las células al medir la disminución
del daño como una función del tiempo después de la exposición a un agente genotóxico conocido. Si se
puede administrar rápidamente (p. Ej., Rayos X) o en condiciones de reparación inbi (4 C), el tiempo
medio de recuperación se puede determinar al colocar las células tratadas en condiciones que permitan
su reparación (p. Ej., Completa). medio de crecimiento a 37 ° C) Sin embargo, los procesos de reparación
a menudo pueden complicar la medición del daño en el ADN10. Para exposiciones durante largos
períodos de tiempo, el daño al ADN es una medida tanto de la inducción como de la reparación. De
manera similar, los enlaces cruzados inducidos por platino requieren varias horas para formarse, de
modo que tanto la cantidad de daño como la eficiencia de la reparación contribuyen al daño general
detectado. Para algunos agentes (p. Ej., Radiación ultravioleta C y N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina, el
daño medido con el ensayo del cometa puede ser el resultado de una incisión en los sitios de daño de la
base producido durante la reparación por escisión de nucleótidos4. En esta situación, el 'daño' se
convierte en una medida de reparación. Finalmente, la reparación de algunos tipos de daño en el ADN
puede ser muy rápida, lo que dificulta la detección en organismos vivos. Las roturas de la hebra inducida
por la radiación ionizante y algunos tipos de daño en la base por especies reactivas de oxígeno pueden
repararse con haf-time menos de 30 min y tan corto como 3 min

REACTIVOS DE MATERIALES Agarosa de baja temperatura de gelificación (Sigma; Tipo VII, n.º de cat. A-
4018) Solución salina tamponada con fosfato (libre de Ca2 + y Mg2) Proteinasa K (EMD Chemicals; cat.
24568-2) 0.5 M Na EDTA (pH 8.0): agregue 55.8 g de Na, EDTA y 6.4 g de NaOH a 270 ml de agua
destilada (agite durante aproximadamente 2 horas y ajuste el pH a 8.0 con NaOH adicional) Solución
madre 5M de NaOH: agregue NaOH lentamente a hielo agua destilada ! PRECAUCIÓN El NaOH es
cáustico. Tinción de ADN fluorescente: 10 ug / ml de yoduro de propidio (Sigma; nº de catálogo P-4170);
También se pueden usar otras tinciones de ADN (por ejemplo, SYBR-green, YO-PRO-, DAPI), pero la
fotoestabilidad debe evaluarse especialmente con tintes excitables a los rayos UV13. PRECAUCIÓN El
yoduro de propidio es mutagénico; llevar guantes protectores. (Oplional; solo en el Paso 15A) A,
solución de lisis alcalina para la ruptura de una sola hebra: NaCl 1.2 M, Na 100 mM, EDTA,
laurilsarcosinato sódico al 0.1%, NaOH 0.26 M (pH> 13); equilibrar a 4 ° CA CRÍTICO Preparar fresco el
día de la experiencia (Opcional; Solo paso 15A) A2, Solución alcalina de enjuague y electroforesis NaOH
0.03 M, Na 2 mM, EDTA (pH 12.3) (Opcional; Solo paso 15B) N1, lisis cutánea solución para la detección
de brcak de doble cadena: sarkosyl al 2%, Na 0,5 M, EDTA, proteinasa K 0,5 mg / ml (pH 8,0); equilibrar a
4°C

(Opcional; Solo paso 15B) N2, Neutral 90 mM 'Iris buller, 90 mM EQUIPOS Tubos de plástico desechables
(5 ml; Falcon; n.º de cat. 35-2054) Baños de agua para fundir la agarosa a 100 ° C y mantener la agarosa a
40 C Hemómetro o contador eléctrico de partículas (p. Ej., Contador de Couler) para ajustar los números
de células Portaobjetos de microscopio con extremo escarchado A CRÍTICO Se puede obtener una mejor
adherencia utilizando portaobjetos completamente congelados (Fisher Scientific; número de catálogo
12-544-5CY), pero Los portaobjetos no se pueden secar y almacenar después de la tinción. Pluma con
diamante para marcar diapositivas Recipientes de vidrio cubiertos para lisis, tinción y almacenamiento
de diapositivas Cámara de electroforesis de gel horizontal de lecho grande y fuente de alimentación. El
microscopio de efluorescencia con el objetivo es el mejor y el conjunto de filtros para la excitación con
luz verde si se utiliza yoduro de propidio para teñir el ADN. (Excitación de 546 nm de una bombilla de
mercurio de 100 vatios; emisión monitoreada utilizando un reflector de 580 nm y un ilter de paso
manual) Cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) (la cámara de 8 bits en blanco y negro es
adecuada); se prefieren la alta sensibilidad y la alta resolución de píxeles software de análisis de
computadora y cometa (sistemas comerciales o software gratuito disponible en Internet; consulte
http://cometassay.com). 5x objetivo (larga distancia de trabajo)

PROCEDIMIENTO Preparación de agarosa 1 Combine dos baños de agua: uno a y uno a-100 T 40 2 un
vaso de precipitados o botella de clase. Prepare un 1% de agar en polvo agar de agarre en polvo con
temperatura de gelificación con agua destilada 3 Coloque la botella en el baño de agua a 100 "C durante
varios minutos. Alternativamente, coloque la botella en el microondas a baja potencia durante intervalos
cortos (evite llamar la atención del agarcse y ersure que toda la agarosa está disuelta). PROTOCOLO DE
RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS 4 Coloque la botella con agarcse en un baño de agua a 40 ° C. Si la muestra
de células contiene células de sangre roja o hemoglobina, agregue DMSO al 2% a la solución de agarosa
o lisis alcalina para evitar daños por fr Especies reactivas catalizadas y catalizadas, que pueden causar
roturas de las hebras. Recubrimiento previo con portaobjetos 5 Para probar la adherencia de los ácaros,
marque los bordes de los portaobjetos del micrcscope con extremos escarchados libres de polvo con una
punta de diamante por 6. Agarosa al 1% y limpieza lateral. Es mejor hacerlo en un ambiente de baja
humedad para asegurar la adherencia de la agarosa. RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS 7 Deje que la agarosa
se seque al aire para obtener una película delgada. Preparación de muestras a tiempo y almacenadas
con desecante. Prepare un suspensorio de una sola célula utilizando desagregación de enzimas o
disocieto mecánico. Nunca use células fijas porque las células eep en medio helado o 5ae tamponadas
con fosfato para gregar e inhibir la exposición a peróxido de hidrógeno recién preparado 20 M o 8 rayos
X grises en hielo para la versión alcalina, y 75 Gy para el neutro versión) es útil cuando se configura el
método. 7 MEDICIÓN DE AVERÍAS medidor o contador de partículas, ajuste la densidad celular a
aproximadamente 2 x 10 células / el en solución salina tamponada con fosfato cki lt una diapositiva de
10 etiquetas en el extremo helado con un lápiz, no un bolígrafo. 11 Pioet 0,4 ml de células en un tubo
desechable alastico 5 al. 12 Agregue 1,2 ml de agarosa al 1% a baja temperatura de gelificación a 40 "C.
Mezcle y pipetee rápidamente 1,2 ml de suspensión celular en la superficie de cobertura cubierta con
agarosa de un pretratado deslice; evite la formación de burbujas. 14 Aglajee la agarosa al gel durante
aproximadamente 2 minutos. Sea consistente con el tiempo y la temperatura utilizados para la
gelificación, y asegúrese de que esté completamente configurado antes de sumergirlo en la solución de
lisis. La dosis de agarosa y la electroforesis se pueden realizar en alcalina (opción A ) o condiciones
neutrales (opción B). Use la opción A para detectar la combinación de roturas de una sola hebra de ADN,
roturas de doble hebra y sitios lábiles alcalinos en el ADN, y la opción B para detectar. solo rupturas de
doble hebra de ADN ( A) Electroforesis de lisis alcalina, sidides suhmerae sedides en un Cavesedrish
cantaininu A1 sis solutinn. Manejar portaobjetos también.

RESULTADOS ANTICIPADOS El ensayo del cometa es sensible al daño por encima de aproximadamente 50
roturas por célula de mamífero diploide, y tendrá una sensibilidad superior a aproximadamente 10,000
rupturas por célula. Las relaciones de respuesta a la dosis lineal deben observarse en ese rango para las
células expuestas a los rayos X y examinadas utilizando el método de lisis alcalina (Fig. 1). El contenido
de ADN (fluorescencia total de la imagen) debe permanecer relativamente constante a medida que
aumenta el número de roturas de ADN (es decir, con dosis crecientes). Pero los cambios en la estructura
de la cromatina después de la desnaturalización y la renaturalización de los álcalis pueden afectar la
unión del colorante después de bajas cantidades de daño 44. Utilizando un sistema de imágenes, debería
ser posible identificar células en diferentes fases del ciclo celular según la intensidad de fluorescencia de
los cometas individuales. Tenga en cuenta que la aparición de cometas con colas en el método alcalino
podría ser indicativa de la presencia de horquillas de replicación en las células en fase S, así como en las
células que contienen roturas de una sola hebra inducidas por el tratamiento. Se rompe, pero son
precursores esenciales de las aberraciones cromosómicas. Las células preparadas usando el método de
lisis neutra desarrollan un halo 'de bucles de ADN que les da a los cometas una apariencia ligeramente
diferente en comparación con los cometas preparados usando el método alcalino. las células no tratadas
parecen más alargadas, de modo que se asigna más ADN a la región de la "cola" en las células no
tratadas (observe el momento de la cola más alto para las células "O Gy" analizadas utilizando el método
neutral en la Fig. 1). Como se indicó anteriormente, el aumento en el ADN medido después de dosis
bajas de un agente dañino del ADN puede ser el resultado de la relajación de los supercoils de ADN
causados por roturas de una sola hebra, no es un indicio de una inducción de rotura de doble hebra 36.
Un aumento rápido del daño en dosis bajas seguido por un aumento mucho más lento pero lineal en el
rango de dosis más altas (verdaderas rupturas de doble hebra ) por lo tanto, se anticipa, aunque el
tiempo de lisis más largo recomendado aquí debería ser adecuado para relajar los supercoils de ADN