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Revista Facultad
de Farmacia Universidad Perfil Fitoquímico y Farmacológico de Croton 2
Central de Venezuela micans Sw. Una Visión General
Vol. 75 - Nº 2 - 2012 - ISSN: 0041-8307 ALÍRICA I SUÁREZ, ELSA MATEU, KATIUSKA CHÁVEZ,
Depósito legal: 195902 DF 224 REINALDO S COMPAGNONE, GIOVANNINA ORSINI,
Caracas/Venezuela STEPHEN TILLETT, RICARDA RIINA, WILMER ALCAZAR,
Indexada en LILACS, Latindex y Revencyt MARGARITA SALAZAR-BOOKAMAN,
FRANCISCO ARVELO y ANITA ISRAEL
Universidad Central de Venezuela
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Facultad de Farmacia
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Coordinadora de Extensión y MARYSABEL CORDERO TROCONIS
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Efectos deletereos del JC25 sobre 50

Revista Facultad de Farmacia
la bioenergética celular y la biosíntesis
Editora de esteroles de Leishmania braziliensis
Dra. Anita Stern Israel
JORGE NÚÑEZ-DURÁN, DAZNIA BOMPART, JAIME CHARRIS,
Editora Asociada JOSÉ CAMACHO, DANIEL RODRÍGUEZ, TANIA RODRÍGUEZ,
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y XENÓN SERRANO-MARTÍN
Comité Editorial
Dra. María Margarita Salazar Bookaman
Dra. Alírica Suárez
Dra. María del Rosario Garrido ÍNDICE DE DESCRIPTORES 59
Dr. Jaime Charris
Dra. Isabel Andueza
Dr. David De Souza
Dra. Miriam Regnault ÍNDICE DE AUTORES 60

Diagramación y montaje
Dora Nicholls de García y Carlos Pérez Cárdenas
NORMAS DE PUBLICACIÓN 61
Impresión
Diseño Gráfico WILMARIS, s.r.l.
Tiraje: 300 ejemplares

Dirección
Facultad de Farmacia UCV - Apartado 40.109 Esta revista se publica bajo los auspicios
Caracas 1040-A - Venezuela del Consejo de Desarrollo Científico
y Humanístico de la UCV
 Perfil Fitoquímico y Farmacológico
de Croton micans Sw.
Una Visión General
Phytochemical and Pharmacological Profile of Croton micans Sw.
An Overview

ALÍRICA I SUÁREZa*, ELSA MATEUa, KATIUSKA CHÁVEZa, REINALDO S COMPAGNONEb,

GIOVANNINA ORSINIa, STEPHEN TILLETTa, RICARDA RIINAc, WILMER ALCAZARa,
MARGARITA SALAZAR-BOOKAMANa, FRANCISCO ARVELOd Y ANITA ISRAELa

Resumen
Se presentan los resultados del estudio fitoquímico y farmacológico de la planta Croton micans Sw (Euforbiaceae). La
investigación química de los extractos orgánicos obtenidos de flores, hojas y tallos de Croton micans, condujo al ais-
lamiento e identificación de 18 compuestos, siete de los cuales han sido reportados por primera vez en la literatura
de productos naturales: dos diterpenos de tipo 3,4-seco-entkaureno, cinco dímeros con estructuras de 3,4-seco-ent-
kaurenos, tres kauranos, tres esteroides triterpénicos, dos sesquiterpenos, un monoterpeno, un flavonoide y un ácido
graso. Se identificó igualmente la composición del aceite esencial obtenido de flores y hojas, encontrándose como
compuesto mayoritario el acetato de fenchilo. La evaluación farmacológica permitió determinar los efectos tóxicos del
extracto acuoso sobre animales de experimentación y con ellos se obtuvo la dosis tóxica cincuenta (DT50). Igualmente,
se determinó su acción sobre la musculatura lisa del íleon de cobayo, en la respuesta cardiovascular, su actividad anal-
gésica y antihistamínica así como la acción citotóxica de metabolitos aislados sobre células tumorales humanas.

Palabras clave: Croton micans, fitoquímica, farmacología, metabolitos secundarios, citotoxicidad.

Abstract
This review presents the results the of a phytochemical and pharmacological study of the plant Croton micans Sw.
Chemical investigation of organic extracts obtained from Croton micans flowers, leaves and stems, led to isolation and
identification of 18 compounds, seven of them reported for the first time in natural products literature: two 3,4-seco-
ent-kaurene diterpenes, five 3,4-seco-ent-kaurene dimers, three ent-kaurenes, three steroids with triterpene skeletons,
two sesquiterpenes, a monoterpene, a long chain acid and a flavonoid. Composition of essential oil obtained from flo-
wers and leaves was also identified, fenchil acetate being the major compound. Pharmacological evaluation allowed
determining toxic effects of Croton micans aqueous extract on experimental animals and the TD50, were determined. In
addition, the effects on guinea pig ileal smooth muscle, cardiovascular response, and analgesic and antihistamine acti-
vity were also determined. Cytotoxic activity of organic extracts and isolated metabolites on human tumor cells are also
shown.

Key words: Croton micans, phytochemistry, pharmacology, secondary metabolites, citotoxicity.

Introducción Croton es el género más grande de la subfamilia Cro -

El género Croton pertenece a la familia Euforbia - tonoideae (Caruzo y col., 2011). Se han reportado
ceae, una de las más grandes del reino vegetal; está aproximadamente unas 1.300 especies diseminadas
formado por hierbas, arbustos, árboles y, aunque en las regiones cálidas del planeta, especialmente en
menos comunes, algunos se presentan como lianas. América del Sur y en África; en Venezuela se han iden-

a Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

b Escuela de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela.
c University of Michigan Herbarium and Department of Ecology and Evolutionary Biology, Ann Arbor, Michigan, USA.
d Instituto de Biología Experimental (IBE), Universidad Central de Venezuela.

2
 Perfil fitoquímico y farmacológico de Croton miCans Sw.
tificado 80 especies (berry, 1999). Las plantas están
recubiertas por pelos estrellados o escamosos, y tie-
nen hojas enteras, dentadas o lobuladas. Las plantas
son monoicas o dioicas y sus flores están reunidas en
espigas terminales o axilares.
Los estudios fitoquímicos realizados sobre un gru-
po considerable de especies, han conducido al aisla-
miento de esteroides, alcaloides, flavonoides, cumari-
nas, y una gran variedad estructural de diterpenos con
esqueleto carbonado tipo labdano, kaurano, cleistan-
tano, crotofalano así como clerodano, siendo éste últi-
mo el más abundante. Muchas especies son ricas en
mono y sesquiterpenos (junior y col., 2006), y en re-
cientes reportes se señala la presencia de péptidos cí-
clicos (quintyne-Walcott y col., 2007; Mehmood y
Malik, 2010).
Varias especies de Croton, contienen un látex ro -
jo viscoso el cual es utilizado ampliamente en la me-
dicina tradicional de Sur américa para el tratamiento
de heridas, inflamación, infecciones, diarreas y cán-
cer (Cai y col., 1993). La savia de la especie C. pala-
nostigma contiene un alcaloide llamado taspina, el
cual es el principio activo responsable de las propie-
dades antiinflamatorias, así como de sanar heridas y
de su actividad biológica como agente antitumoral
(Sandoval y col., 2002). Muchas especies de Croton
son utilizadas con propósitos medicinales específi-
cos, por ejemplo C. zehntneri (Craveiro y col., 1978;
oliveira y col., 2002) y C. cajucara (do Socorro y col.,
2003) son comúnmente utilizadas en brasil para tra-
tar problemas gastrointestinales y como anti-parasita-
rio, C. lechleri es empleado en toda Sur américa para
el tratamiento de la inflamación, de úlceras gástricas,
del cáncer y para cicatrizar heridas (Cai y col., 1993).
C. nepetaefolius se usa en la medicina folclórica de
brasil como antiespasmódico (abdon y col., 2002).
Los usos, la química y la farmacología de una gran
cantidad de especies han sido y continúan siendo re -
portadas (Salatino y col., 2007).
En Venezuela, la corteza de C. malambo se reco-
mienda para el tratamiento de enfermedades tales
como: diabetes, diarreas, reumatismo, úlcera gástrica,
así como antiinflamatorio y analgésico. Un extracto
acuoso de C. malambo mostró actividad antinocicep-
tiva en ratas (Suárez y col., 2003). C. cuneatus es una
planta medicinal utilizada por los nativos del amazo-
nas para tratar problemas gastrointestinales, y la infla-
macion (Webster y col., 1999); un extracto acuoso de
las partes aéreas de dicha planta mostró propiedades
antiinflamatorias en animales de experimentación
(Suárez y col., 2006); tres alcaloides con estructura
glutarimídica, aislados de hojas y tallos de esa planta,
han demostrado ser los responsables de la acción an -
tiinflamatoria y antioxidante (Mijares y col., 2012).
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
Dentro de las actividades farmacológicas experimen-
talmente comprobadas para el género Croton se en -
cuentra su potencial como agente antidiabético (Torri-
co y col., 2007; okokon y col., 2006).
Croton micans Sw., es un arbusto que crece en la
zona norte-costera de Venezuela, y hasta el presente
no ha sido documentado nombre común ni usos tera-
péuticos para esta especie en nuestro país (berry y
col., 2005). Sin embargo, en brasil, a la especie Cro-
ton micans Müll. arg., conocida como alecrim-de-va-
quero se le atribuyen propiedades medicinales tales
como: tratamiento para problemas cardíacos, influen-
za y como sedante (agra y col., 2008). Por ello, y debi-
do a la variada actividad y riqueza estructural de los
compuestos de especies del género Croton y el esca -
so conocimiento de la actividad biológica y composi-
ción química de la especie C. micans Sw., en la pre-
sente revisión se presentan resultados tanto desde el
punto de vista químico como farmacológico que nos
permiten señalar que la especie C. micans Sw., puede
ser considerada como otra de las especies del género
con propiedades medicinales y que presenta nuevos
compuestos con actividad terapéutica en analgesia,
efectos cardiovasculares, antihistamínicos, anticoli-
nérgicos y citotóxicos.
química
El aislamiento y purificación de los compuestos
aislados de los diferentes extractos de las flores, ho-
jas y ramas de C. micans fue realizada por diferentes
técnicas cromatográficas y su caracterización e identi-
ficación por medio de técnicas espectroscópicas: re-
sonancia Magnética nuclear de protones y carbono
(rMn 1H y rMn 13C), DEPT 135, HMbC, HMqC, noESY,
ir y por espectrometría de masas (EM).
En el estudio fitoquímico de las flores, los diterpe-
nos de tipo 3,4-seco-ent-kaurenos caracasina (1) y el
ácido de caracasina (2), fueron los compuestos mayo-
ritarios; los mismos se reportaron como estructuras
nuevas en la literatura de productos naturales (Suárez
y col., 2009). adicionalmente, se aisló e identificó los
sesquiterpenos: óxido de cariofileno (3) y espatulenol
(4), el monoterpeno 3,7-dimethyl-1,5-octadien-3,7-
diol (5), los esteroles estigmasterol (6) y ß-sitosterol
(7), el flavonoide tilirosido (8) y el ácido palmítico
(Chávez, 2007).
De los extractos orgánicos obtenidos por extrac-
ción de las hojas se aislaron los seco-ent-kaurenos 1
y 2 conjuntamente con los ya conocidos diterpenos
16a, 17-ß-diol-ent-kaureno (9), kaurenal (10) y kaure-
nol (11). En los extractos de las hojas igualmente se
caracterizó los esteroles ß-sitosterol (6) y el estigmas-
ten-4-ene-2-ona (12) (Mateu, 2011). El estudio de los
3
alírica i Suárez, elSa mateu, KatiuSKa chávez, reinaldo S comPagnone, giovannina orSini, StePhen tillett, ricarda riina, wilmer alcazar, margarita Salazar-BooKaman, franciSco arvelo y anita iSrael

extractos orgánicos obtenidos de las ramas permitió
el aislamiento e identificación de cinco nuevas estruc-
turas diterpénicas diméricas: ácido micansinoico
(13), ácido isomicansinoico (14) y los dimetil (15),
monoetil (16) y monometil (18) ésteres del ácido mi-
cansinoico (Mateu y col., 2012) (Figura 1). Los extrac-
tos acuosos polares de hojas y tallos mostraron ser ri-
cos en taninos.
aCEiTES ESEnCiaLES Y SUS ConSTiTUYEnTES
La evaluación fitoquímica de la especie C. micans,
incluyó el aislamiento por hidro-destilación y la carac-
terización por análisis de Cromatografía CG-FiD y cro-
matografía gases-masas CG–EM, de los aceites esen-
ciales obtenidos de flores y hojas. Los análisis revela-
ron 67 compuestos en la composición del aceite de
las flores, cuyos principales componentes fueron: ace-

r1 = r2 = H, Ácido micansinóico (13) Ácido isomicansinóico (14)

r1 = r2 = CH3, Dimetil éster (15) r1 = H, r2 = CH3, Monometil éster (16)
r1 = H, r2 = ET, Monoetil-éster de micansinóico (17)

Figura 1. estructuras de los compuestos aislados de C. micans

4
 Perfil fitoquímico y farmacológico de Croton miCans Sw.

tato de fenchilo (41,6%), a-cariofileno (12,6%), b-cu - Tabla i (continuación)

bebeno (5,0%), b-cariofileno (5,5%), a-cubebeno área de pico (%
(5,3%), b-elemeno (4,7%) y valenceno (4,6%). En el C. micans
aceite de las hojas se identificó al acetato de fenchilo compuesto ri hojas Flores identificación
(25,3%), a-cariofileno (20,7%), a-selineno (12,8%) y
ar-curcumeno 1482 nd nd MS
al b-bourbeno (9,3%) como los componentes mayori-
Valenceno 1485 2.9 4.6 ri, MS
tarios (Tabla i) (Compagnone y col., 2010).
a-Selineno 1501 12.8 nd ri, MS
Metilisoeugenol 1509 tr tr ri, MS
Tabla i
b-bisaboleno 1509 0.2 tr ri, MS
composición de los aceites esenciales
bisaboleno 1520 nd 0.3 ri, MS
de Croton micans
d-Cadineno 1526 0.2 tr ri, MS
área de pico (% Calameneno 1532 tr tr ri, MS
C. micans
Elemol 1540 0.2 0.2 ri, MS
compuesto ri hojas Flores identificación Ledol 1545 0.2 tr ri, MS
a-thujeno 925 0.1 0.2 ri,MS Desconocido 1548 1.0 0.1 ———
a-pineno 936 0.3 0.1 ri, MS Elemicina 1550 1.6 1.1 ri, MS
a-fencheno 945 0.6 1.5 ri l- Eudesmol 1560 tr 0.2 ri, MS
Sabineno 962 0.1 0.3 ri, MS Espathulenol 1565 0.9 0.1 ri, MS
Verbeneno 965 0.3 0.1 ri, MS Globulol 1580 0.5 tr ri, MS
ß-myrceno 972 0.2 1.3 ri, MS óxido de
ß-pineno 986 0.9 0.2 ri, MS caryophillene 1587 0.2 1.1 ri, MS
d-3-careno 1010 0.2 0.1 ri, MS Humulene epóxido 1593 nd tr ri, MS
Limoneno 1018 2.9 1.3 ri 3,4,5-Trimetoxiben-
p-Cymeno 1030 0.7 1.1 ri, MS zaldehido 1623 0.1 nd ri, MS
d-terpineno 1063 nd 0.1 ri,MS Desconocido 1595 0.1 0.1 ri, MS
Fenchona 1068 0.3 0.4 ri, MS Cedrol 1638 0.1 tr MS
Linalool 1091 2.2 1.5 ri, MS Carotol 1649 0.1 nd ri, MS
a-fenchol 1104 2.0 0.1 ri, MS b-bisabolol 1653 0.1 0.3 ri, MS
b-fenchol 1110 0.6 0.2 ri, MS isoelimicine 1656 0.2 tr ri, MS
Terpinen-4-ol 1158 1.1 1.2 ri, MS agarospirol 1664 tr tr ri, MS
norborneol 1167 nd tr ri, MS a-bisabolol 1667 nd 0.1 ri, MS
a-Terpineol 1190 0.5 tr ri, MS Cubenol 1669 0.1 nd ri, MS
Myrtenal 1198 0.3 0.1 ri, MS a-Cadinol 1672 tr 2.1 ri, MS
Trans-carveol 1212 nd 0.2 ri, MS t-Cadinol 1673 nd 0.1 ri, MS
a-acetato de fenchilo 1223 25.3 41.6 ri, MS d- Cadinol 1684 0.1 tr ri, MS
Geraniol 1242 nd 0.1 ri, MS a-11-Eudesmeno 1688 nd 0.2 ———-
Pulegona 1234 0.2 0.2 ri Desconocido 1690 0.2 0.3 ri, MS
Thymol 1291 nd tr ri, MS Selina-4-11-diene 1692 nd 0.2 ri, MS
Carvacrol 1293 0.1 nd ri Ledenol 1761 0.2 tr ri, MS
Eugenol 1347 1.1 tr ri, MS a-Cyperona 1783 0.1 0.3
a-cubebeno 1380 1.8 5.3 ri, MS Total 97.3 98.9
b-bourbeno 1382 9.3 nd MS nd=no detectado; tr= área de pico < 0,05
b-cubebeno 1386 2.7 5.0 ri, MS
b-elemeno 1392 0.5 4.7 ri, MS
Metileugenol 1400 nd 0.1 ri, MS ActividAd toXicológicA
b-caryophylleno 1422 0.7 5.5 ri, MS y FArMAcológicA
a-humuleno 1442 nd 1.1 ri, MS ToxiCiDaD aGUDa
a-caryophylleno 1448 20.7 12.6 ri, MS
La administración del extracto acuoso de las hojas
Desconocido 1459 nd nd —-
de C. micans causó varios efectos tóxicos en ratones
Germacreno-D 1467 nd 1.1 ri, MS tratados intraperitonealmente con dosis crecientes (4,
alloaromadendreno 1474 01 nd ri, MS 8, 16, 32 y 64 mg/Kg, i.p.) de dicho extracto. En efec-
Veratral 1480 0.4 0.2 ri, MS to, destaca la presencia de diarrea e irritación visceral

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 5

alírica i Suárez, elSa mateu, KatiuSKa chávez, reinaldo S comPagnone, giovannina orSini, StePhen tillett, ricarda riina, wilmer alcazar, margarita Salazar-BooKaman, franciSco arvelo y anita iSrael
evidenciada por la contorsión del abdomen, efecto
conocido como «síndrome de contorsión», asociado
con toxicidad intraperitoneal. Este efecto apareció
en los primeros 60 minutos post-inyección y mostró
un perfil dependiente de la dosis. La dosis tóxica 50
(DT50) para este efecto (Litchfield y Wilcoxon, 1949),
fue de 16 mg/kg, con límites de confianza al 95% en -
tre 7,19 mg/kg y 35,60 mg/Kg. asimismo, las curvas
tiempo-efecto para las distintas dosis evaluadas del
extracto, mostraron un tiempo de efecto pico (TEP) de
30 minutos (Figura 2).
Figura 2. curva tiempo-efecto del efecto tóxico (síndrome de
contorsión) del extracto acuoso de hojas de Croton micans
administrado en dosis crecientes.
aún más, se observaron tres aspectos interesan-
tes en el estudio de la toxicidad aguda del extracto
acuoso de esta planta: la intermitencia del fenómeno
evaluado, la desaparición del mismo a los 90 minutos
y la inexistencia de efectos letales a las dosis eva-
luadas, lo cual no permitió obtener la dosis letal 50
(DL50). Estas características señalan una baja toxici-
dad aguda del extracto. Estos hallazgos son similares
a los reportados previamente en los estudios de la to-
xicidad aguda del extracto acuoso de hojas de C. cu-
neatus (Suárez y col., 2006), en el cual se reporta la
aparición del síndrome de contorsión como el efecto
tóxico más resaltante, con una DT50 = 103 mg/Kg, el
cual resultó ser mucho mayor que la obtenida para C.
micans, mientras que es coincidente con el TEP de
30 minutos. adicionalmente, se ha descrito la toxici-
dad aguda de un extracto de corteza de C. malambo
reportándose conducta estereotipada como el efecto
tóxico más notorio, con una DT50 de 12,3 mg/Kg y un
TEP de 10 minutos (Suárez y col., 2003).
aCTiViDaD SobrE La MUSCULaTUra LiSa DEL ÍLEon
DE CobaYo
La presencia de diarrea como efecto tóxico, des-
pués de la administración en el animal entero del ex -
tracto acuoso de la hojas de C. micans, sugirió una po-
sible actividad estimulante del extracto sobre la mus-
6
culatura lisa intestinal. Por ello, se evaluó la actividad
sobre la musculatura lisa del íleon aislado de cobayo,
una preparación que carece de vías aferentes (Perry,
1968). nuestros hallazgos muestran que el extracto
acuoso de hojas de C. micans en el íleon aislado de
cobayo, no fue capaz de activar la musculatura lisa in-
testinal (Figura 3). Esto sugiere que los efectos tóxicos
intestinales observados in vivo (diarrea) y el síndrome
de contorsión no se relacionan con la activación direc-
ta de los receptores de la musculatura lisa, sino con la
actividad refleja mediada por el sistema nervioso para-
simpático en respuesta a la irritación peritoneo-visce-
ral que produce el extracto. Estos resultados son simi-
lares a los obtenidos en estudios previos, donde se
evaluó la actividad de los extractos de C. malambo y
C. cuneatus sobre el íleon aislado de cobayo (Suárez y
col., 2003, 2006), o del aceite de Croton administra-
do intraperitonealmente que produjeron síndrome de
contorsión en ratones debido a una intensa irritación
del mesenterio abdominal (Pol y col., 1994).
Figura 3. efecto del extracto acuoso de Croton micans sobre
la contracción isométrica inducida por agonistas en el íleon
aislado de cobayo. cm: Croton micans a dosis crecientes
(100 µg/ml, 1 y 100 mg/ml). carbacol: 0,01 µg/ml; nicotina:
2,0 µg/ml e histamina: 0,2 µg/ml.
además del efecto directo del extracto sobre la
musculatura lisa del íleon aislado de cobayo, se estu-
dió el posible efecto del extracto acuoso de C. micans
sobre la acción estimulante (contracción isométrica)
de agonistas como el carbacol, la nicotina y la histami-
na. así, el extracto causó una disminución significati-
va, dependiente de la dosis, de la contracción isomé-
trica inducida por nicotina sobre el íleon aislado de
cobayo (Figura 3), lo que sugiere un posible efecto blo-
queante ganglionar del extracto. Por otra parte, se ob-
servó un efecto inhibidor sobre la contracción induci-
da por carbacol en el íleon aislado de cobayo. En este
caso la inhibición fue menos marcada y no se observó
dependencia de la dosis administrada. El carbacol es
un agonista colinérgico, resistente a la hidrólisis por la
colinesterasa, con predominio de acciones muscaríni-
 Perfil fitoquímico y farmacológico de Croton miCans Sw.

cas, aunque posee considerable actividad nicotínica,

particularmente sobre los ganglios del sistema nervio-
so autónomo (brown y Taylor, 2001). Es probable que
el efecto inhibidor observado, se deba al bloqueo del
componente nicotínico ganglionar de la contracción
muscular inducida por carbacol, y no al bloqueo de
los receptores muscarínicos presentes en la muscula-
tura lisa del íleon de cobayo. El extracto no alteró la
respuesta del íleon a la histamina.

EFECTo SobrE La aCTiViDaD LoCoMoTriz ESPonTÁnEa

Y La ConDUCTa ESTErEoTiPaDa En raTaS

Con el fin de evaluar un posible efecto del extracto

acuoso de C. micans sobre el sistema nervioso cen -
tral, se estudió su acción sobre la actividad locomotriz
espontánea y la conducta estereotipada, en una caja
de actividad (Letica, Modelo LE 8811) utilizando la es-
cala de Fuenmayor y Díaz (1984). nuestros hallazgos
mostraron que el extracto acuoso de hojas de C. mi-
cans fue incapaz de afectar la actividad locomotriz es-
pontánea y la conducta estereotipada en ratas a las
dosis evaluadas (2; 4 y 5,3 mg/Kg, i.p.), lo que indica
que el extracto no ejerce efectos centrales in vivo.

EFECTo SobrE EL METaboLiSMo HEPÁTiCo

Con el fin de establecer un posible efecto sobre el
metabolismo hepático del extracto acuoso de hojas
de C. micans sobre el metabolismo hepático, se eva-
luó su efecto en animales de experimentación trata-
dos con una dosis correspondiente a la mitad de su
DT50 (16 mg/Kg), dos veces al día (biD, 9:00 am y
4:00 pm) durante cuatro días consecutivos, por vía
intraperitoneal (i.p.). al final del tratamiento, se pro-
cedió a la extracción y determinación del peso de los
hígados, y a la preparación del homogeneizado de hí-
gado según el procedimiento descrito por Marshall y
McLean (1969). Posteriormente, 1ml del homogenei-
zado fue diluido en 9 ml de buffer fosfato pH 7,4, te-
niendo ahora una dilución al 1%, la cual se utilizó pa-
ra la determinación de las proteínas totales por el Mé -
todo de Lowry (1951).
Los resultados mostraron que el extracto acuoso
de C. micans no presenta actividad sobre el metabo-
lismo hepático microsomal en ratas tratadas durante
4 días con dosis de 8 mg/Kg, biD i.p., ya que el peso
del hígado y la concentración de proteínas totales fue-
ron similares a los del control (Figura 4). Estos resulta-
dos contrastan con los obtenidos con el fenobarbital,
agente inductor del metabolismo hepático el cual
incrementó significativamente tanto el peso del híga-
do como la concentración de proteínas hepáticas y los
obtenidos con la cimetidina, un inhibidor del metabo-
lismo, el cual redujo el peso hepático (Figura 4).
Figura 4. efecto de diferentes tratamientos sobre el peso del
hígado de la rata (panel A) y sobre el contenido de proteínas
hepáticas totales (panel B). (n=24, 6 por grupo). tratamien-
tos: control: solución fisiológica (nacl 0,9%); Fenobarbital
sódico (40 mg/Kg); cimetidina (100 mg/Kg); extracto acuo-
so de hojas de Croton micans (16 mg/Kg). *p<0,05.
aCTiViDaD anaLGéSiCa DEL ExTraCTo aCUoSo
DE CROTON MICANS
Para determinar el posible efecto analgésico del
extracto acuoso de C. micans se empleó la prueba de
la retirada de la cola en ratones (Davies y col., 1946).
Los animales de experimentación fueron selecciona-
dos de acuerdo al tiempo de respuesta (retirada de la
cola) al estímulo de calor radiante, descartándose
aquellos animales que tenían un tiempo de respuesta
mayor que seis (6) segundos. El estímulo nociceptivo
de tipo térmico fue aplicado en la cola de los ratones
utilizando un analgesímetro (LETiCa, Scientific instru-
ments, LE 7106, España), para determinar el tiempo
que tarda el animal en retirarla (período de latencia).
El ácido acetilsalicílico (aSa), un analgésico y antiin-
flamatorio no esteroideo (ainE) y la morfina (Mor),
un opioide, se utilizaron como analgésicos de refe-
rencia. El período de latencia fue medido a los 15,
30, 60, y 90 minutos después de la administración de
los tratamientos. El tiempo máximo de exposición al
estímulo térmico fue de 15 segundos.

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 7

alírica i Suárez, elSa mateu, KatiuSKa chávez, reinaldo S comPagnone, giovannina orSini, StePhen tillett, ricarda riina, wilmer alcazar, margarita Salazar-BooKaman, franciSco arvelo y anita iSrael
Los resultados muestran que el extracto acuoso
de C. micans es efectivo como analgésico, ya que el
tiempo de latencia de retirada de la cola, en los ani-
males tratados con el extracto de C. micans, fue sig-
nificativamente mayor en todos los tiempos evalua-
dos, con respecto al control y comparables con los
obtenidos en los grupos tratados con el ácido acetil-
salicílico (aSa) y menor que aquellos obtenidos con
la morfina (Figura 5).
Figura 5. efecto del extracto acuoso de hojas de C. micans
sobre el tiempo de latencia de retirada de la cola en ratones
(Método térmico). la nocicepción térmica fue determinada
por el ensayo de retirada de la cola. los animales selecciona-
dos se dividieron en cuatro grupos (n=7 c/u) y recibieron los
siguientes tratamientos: control (nacl 0,9%, i.p.); extracto
acuoso de C. micans [1/2dt50 (16 mg/kg, i.p.)]; ácido acetil-
salicílico (ASA) (200 mg/kg, p.o.) y Morfina (Mor) (3 mg/kg,
i.p.). *p<0,05; **p<0,01 comparado con el grupo control.
Estos hallazgos son similares a los reportados pa-
ra la especie C. malambo, la cual mostró un efecto
analgésico superior al de la aspirina y menor que él
de la morfina en ratones tratados por vía intraperito-
neal con el extracto acuoso de la corteza, a la dosis
de 6 mg/Kg, ya que prolongó el tiempo de retirada de
la cola ante el estímulo térmico (TEP: 90 min.) (Suá-
rez, 2000). Esto indica que ambas especies, C. ma-
lambo y C. micans, comparten propiedades analgési-
cas junto con otras especies como C. celtidifolius,
planta que abunda en el sur de brasil, la cual mostró
un efecto analgésico dependiente de la dosis (10-300
mg/Kg, p.o.) en el ensayo de dolor inducido por la for-
malina en ratones, reduciendo significativamente la
respuesta nociceptiva de lamido en la pata posterior
derecha (nardi y col., 2006). De la misma manera, los
extractos hexánico, clorofórmico y metanólico de las
hojas de C. cajucara, de la amazonia brasilera, ejer-
cieron un efecto antinociceptivo en ratones tratados
por vía oral, a las dosis de 100 y 200 mg/Kg (Campos
y col., 2002). De igual forma, el aceite esencial de C.
nepetaefolius, especie oriunda del noreste de brasil,
administrado oralmente en ratones, produjo un incre-
mento significativo en el período de latencia, obser-
8
vado en la prueba de la plancha caliente, a las dosis
de 30 y 300 mg/Kg (abdon y col., 2002). aún más, se
encontró una notable acción antinociceptiva del acei-
te esencial de C. zehntneri (300 mg/Kg, p.o.) en rato-
nes, mediante la prueba de dolor inducido por la for-
malina y la prueba de la plancha caliente (oliveira y
col., 2002). Toda esta evidencia indica, sin lugar a du-
das, que las diferentes especies de Croton evaluadas
presentan uno o varios compuestos de alto valor far-
macológico, desde el punto de vista analgésico. Se
hace necesario entonces estudios adicionales a fin de
obtener y caracterizar los compuestos responsables
de esta actividad.
aCTiViDaD anTiinFLaMaToria
El efecto antiinflamatorio del extracto acuoso de
las hojas de C. micans se evaluó utilizando el método
del edema inducido por carragenina en la pata de la
rata, descrito por bhatt y col. (1977), a la dosis de 16
mg/Kg i.p. La inyección intraplantar de la carragenina
provocó un edema significativo en la pata de la rata
del grupo control. Sin embargo, no se observó activi-
dad antiinflamatoria significativa inducida por el ex-
tracto acuoso de C. micans, obteniéndose solamente
un 14% de inhibición del edema inducido por la carra-
genina en la pata trasera de rata, a los tiempos evalua-
dos: 1, 3 y 5 horas post administración de la l-carra-
genina (Figura 6).
Figura 6. efecto del tratamiento y del extracto acuoso de
hojas, sobre el edema inducido por la l-carragenina en la pata
trasera de rata. grupos de tratamiento: control (vehículo), fe-
nilbutazona (FBz) y C. micans, a la 1, 3 y 5 horas post-carra-
genina. los resultados se expresan como la media ± eeM.
*p<0,01, comparado con el grupo control.
aCTiViDaD SobrE La rESPUESTa CarDioVaSCULar
FrEnTE aL ESTÍMULo ELéCTriCo PLanTar En La raTa
Para evaluar la actividad del extracto de C. micans
sobre el sistema cardiovascular, se utilizó el modelo
de estrés agudo inducido por el estímulo eléctrico
plantar (EEP) en la rata, un método que consiste en so-
 Perfil fitoquímico y farmacológico de Croton miCans Sw.
meter a los animales en experimentación a estrés me-
diante descargas eléctricas en la zona plantar. El estí-
mulo (EEP) provoca un incremento significativo de los
niveles plasmáticos de norepinefrina y epinefrina
(Kvetnansky y Mikulaj, 1970), es decir, es un modelo
experimental de estrés agudo que estimula la activi-
dad del sistema simpático-adrenal y que se refleja en
incrementos de la frecuencia cardíaca (FC) y la presión
arterial media (PaM) (Cierco e israel, 1994).
Tal y como se muestra en la figura 7, el estímulo
eléctrico plantar (1Hz) incrementó significativamente la
presión arterial media y la frecuencia cardíaca. El incre-
mento sobre el valor basal de la presión arterial media
inducido por el estímulo eléctrico plantar fue de 35 + 3
mmHg. La administración intragástrica del extracto
acuoso de las hojas de C. micans no alteró significa-
tivamente la presión ni la frecuencia cardíaca basales.
Sin embargo, el extracto acuoso de las hojas de C. mi -
cans redujo significativamente la respuesta presora al
estrés eléctrico plantar (p<0,01) sin alterar la respues-
ta de la frecuencia cardíaca. Es interesante que los
efectos observados fueron similares a los observados
por el antagonista del receptor aT1 de la angiotensina,
el valsartán, un agente antihipertensivo de referencia
(Figura 7). Estos hallazgos abren la posibilidad del em-
pleo de compuestos derivados de Croton micans co -
mo potenciales agentes antihipertensivos y anti-estrés.
Figura 7. efecto del extracto acuoso de Croton micans sobre
el cambio en la presión arterial media (arriba) y sobre la fre-
cuencia cardíaca (abajo); basal (post-tratamiento) y en res-
puesta al estímulo eléctrico plantar (1 hz) (post-eep) en
ratas. *p<0,05 comparado con el control.
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
aCTiViDaD anESTéSiCa LoCaL
Se evaluó la actividad anestésica local del extrac-
to acuoso de C. micans en cobayos, mediante el mé-
todo descrito por bulbring y Wajda (1945) y modifica-
do por Luduena y Hoppe (1958), encontrándose que
el extracto acuoso de C. micans no mostró efecto
anestésico local a las concentraciones usadas (0,25;
0,50; 0,75 y 1 % p/v).
aCTiViDaD anTiHiSTaMÍniCa
La actividad antihistamínica, del extracto acuoso
de hojas de C. micans, fue evaluada mediante el mé -
todo de inducción de broncoespasmo en cobayos
mediante un aerosol de histamina (armitage y col.,
1961; Stone y col., 1961). Los resultados mostraron
que a la dosis de 8 mg/Kg, el extracto acuoso de ho-
jas de C. micans aumentó significativamente el «tiem-
po de respuesta» al comparar este efecto con el grupo
control (p<0,001). Por otra parte, no se evidenciaron
diferencias estadísticamente significativas entre el
efecto del extracto vegetal en estudio y la difenhidra-
mina, antihistamínico de referencia (p=0,102). En
términos de porcentaje de protección [(1 -Tl/T2) x
100] y la potencia antihistamínica, el extracto acuoso
de las hojas de la planta exhibió una potencia de
68,5% respecto a la difenhidramina que protegió a
los cobayos del broncoespasmo inducido por la hista-
mina en un 100% (Figura 8).
Figura 8. efecto del tratamiento sobre el tiempo requerido
para inducir el broncoespasmo en cobayos sometidos a una
atmósfera de histamina 0,5% p/v. **p<0,01 comparado con el
control.
9
alírica i Suárez, elSa mateu, KatiuSKa chávez, reinaldo S comPagnone, giovannina orSini, StePhen tillett, ricarda riina, wilmer alcazar, margarita Salazar-BooKaman, franciSco arvelo y anita iSrael
Es importante destacar que por primera vez se
reporta la existencia de actividad antihistamínica en
un extracto de una planta del género Croton. De ma -
nera interesante, se observó que cuando se evaluó el
efecto del extracto sobre la musculatura lisa del íleon
aislado de cobayo, no se evidenció antagonismo fren-
te a la histamina, lo cual pudo deberse a que la con-
centración ensayada en el baño para órgano aislado
(100 µg/mL) no fue suficiente para bloquear el efecto
contráctil de la histamina. Por otra parte, se sabe que
el músculo liso bronquial de los cobayos es exquisita-
mente sensible a la histamina; por ende, en el mode-
lo de estimulación directa de las vías respiratorias uti-
lizado, se espera que se pueda observar más clara-
mente el posible efecto antihistamínico de un deter-
minado agente. Experimentos in vitro han demostra-
do que existen diferencias entre los tipos de interac-
ción de los antagonistas H1 con los receptores de his-
tamina localizados tanto en el íleon como en la trá-
quea del cobayo (Skidgel y Erdös, 2007). así, en térmi-
nos del antagonismo competitivo ejercido por la di-
fenhidramina, en el íleon aislado de cobayo, se repor-
tó un pa2 = 7,8, mientras que en tiras de tráquea de
cobayo, se observó un valor diferente, pa2 = 7,0, in -
dicando una ligera variación en la afinidad del antago-
nista por su sitio de unión quizás dependiendo de la
localización anatómica de los receptores, pero se ha
demostrado que en ambos tejidos los receptores de
histamina son del tipo H1, y que quizás estén intervi-
niendo diferentes mecanismos para este antagonis-
mo (Labrid y col., 1977).
Durante la caracterización fitoquímica de la C. mi-
cans, en la composición de los extractos orgánicos se
encontró la presencia de sustancias terpenoides en
abundancia (Mateu, 2012; Chávez, 2007). Se ha re-
portado previamente que la combinación de un anti-
histamínico con un terpenoide, administrada por vía
oral en humanos, favorece sinergísticamente la pre-
vención y el tratamiento de la rinitis alérgica, asma y
urticaria (ogunlesi y col., 2009). Por otra parte, dos
terpenos: 19-nor-clerodano trans-dehidrocrotonina y
ácido acetil aleuritólico, aislados de la corteza de C.
cajucara en brasil, presentaron actividad antihistamí-
nica en el modelo del edema de la pata de la rata in-
ducido por histamina, donde ambos compuestos inhi -
bieron la formación de edema en más de 40%, efecto
comparable al de la ciproheptadina utilizada como
antihistamínico de referencia en el citado estudio
(Perazzo y col., 2007). Estos antecedentes conducen
a proponer la posibilidad de que el efecto antihistamí-
nico observado en el extracto acuoso de hojas de C.
micans, podría atribuirse, al menos en parte, a la pre-
sencia de los compuestos de tipo terpénico aislados
y caracterizados durante su estudio fitoquímico.
10
EVaLUaCión DE La CiToToxiCiDaD DE aLGUnoS
DE LoS CoMPUESToS aiSLaDoS DE C. MICANS
Para evaluar la citotoxicidad inducida por algunos
compuestos aislados de C. micans en líneas celulares
humanas de diferente origen, se realizó el ensayo de
supervivencia celular in vitro desarrollado por Mos-
man (1983), el cual consiste en la formación de púr-
pura de formazán a partir de una sal de tetrazolio, el
MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil
tetrazolio), en donde esta sal es reducida por la ac-
ción de la enzima succinato deshidrogenasa mitocon-
drial (complejo ii). nuestros resultados realizados en
nueve líneas celulares de cáncer humano de diferen-
tes orígenes y uno en cultivo primario mostraron que
los compuestos caracasina, ácido de caracasina y áci-
do micansinoico tienen una marcada actividad cito -
tóxica sobre las líneas celulares evaluadas. Los valo-
res de Ci50 se muestran en la Tabla ii. resulta intere-
sante que en fibroblastos normales y en las líneas
celulares HeLa, MCF-7, PC-3, LoVo, jurkat E6.1 y jur-
kat jCaM1.6, los valores de Ci50 del ácido de caracasi-
na fueron significativamente más bajos que los obte -
nidos con la caracasina. no se observaron diferencias
de las Ci50 entre ambos compuestos en las líneas celu-
lares leucémicas U937 y K562 (Suárez y col., 2009)
(Tabla ii). Esto indica que la porción ácida presente
en la estructura incrementa el efecto citotóxico de la
caracasina por algún mecanismo que no parece acti-
vo en las células leucémicas evaluadas. En relación al
ácido micansinoico, el mismo exhibió la mayor poten-
cia, siendo de 2 a 10 veces más activo que la caraca-
sina y el ácido de caracasina en las líneas evaluadas,
excepto para MCF-7. Estas observaciones sugieren
que la presencia en la molécula de dos unidades
monoméricas activas, duplica el poder citotóxico del
dímero en cuestión. Los valores de Ci50 se muestran
en la Tabla ii.
Los hallazgos ratifican los efectos citotóxicos y
pro-apoptóticos del género Croton. En efecto, en el
estudio realizado con el compuesto ent-16b-17a-dihi-
droxikaurano 9, aislado de la Croton malambo, en el
que se evaluó su efecto citotóxico sobre la línea celu-
lar de cáncer mamario humano MCF-7 y sobre un cul-
tivo primario de fibroblastos dérmicos, se determinó
que el compuesto evaluado posee un efecto citotóxi-
co 2,6 veces mayor para las células MCF-7 que para
los fibroblastos, encontrándose una potencia citotó-
xica excelente a las 48 horas de tratamiento con una
iC50 = 12,5 µg/ml (Morales y col., 2005). aún más, al
estudiar el efecto del diterpeno 9 sobre la regulación
de la apoptosis, o muerte celular programada, se de-
mostró que el mismo es capaz de activar la apoptosis
en las células tumorales MCF-7 (Morales y col., 2011).
El mecanismo de acción molecular del diterpeno 9
 Perfil fitoquímico y farmacológico de Croton miCans Sw.

Tabla ii
Actividad antiproliferativa de los compuestos caracasina, ácido de caracasina
y ácido micansinoico sobre líneas tumorales humanas.

línea celular caracasina ácido de caracasina ácido micansinoico

MCF-7 15.7±1.02 6.00±1.00* 12.00+1.84
PC3 12.1±1.05 3.30±2.57* 1.33±1.10&**
HeLa 24.3±1.08 3.70±1.11* 0.32±1.08&**
x-17 18.3±1.00 3.30±1.59* 0.30±1.08&**
LoVo 17.8±1.04 3.40±1.20* 1.99±1.09&**
U937 2.70±0.68 4.00±1.95 –
K562 9.60±3.01 10.90±1.34 –
jurkat E6.1 10.8±5.91 1.70±0.82* –
jurkatCaM1.6 10.10±5.29 1.80±1.38* –
Fibroblastos 13.60±1.00 3.40±4.11* 12.14±0.34

Los valores representan el iC50 (µM) ± intervalo de confianza 95%

*p<0,01 comparado con caracasina.

implica que el mismo participa en la regulación de la Agradecimientos

transcripción del gen anti-apoptótico bcl-2, mediante
la disociación de la activación del complejo ap2a-rb,
afectando así su capacidad de unión al promotor del
gen del bcl. Este efecto es de suma importancia ya
que se sabe que las células tumorales comúnmente
se desvían del proceso de apoptosis hacia la prolifera-
ción celular incontrolada convirtiéndose eventual-
mente en células cancerosas, por lo que este efecto
pro-apoptótico es de potencial aplicación terapéutica
(Morales y col., 2011).
conclusiones
Se presenta una visión general del estudio fitoquí-
mico y farmacológico realizado con la planta Croton
micans Sw. Los resultados de la evaluación farmaco-
lógica sugieren que la planta, así como muchas otras
pertenecientes a este género, tiene propiedades medi -
cinales, mostrándose la presencia de efectos analgé-
sicos, antihistamínicos, bloqueante ganglionar, anti-
hipertensivos y citotóxicos; sin embargo, se requieren
estudios más amplios que validen su eficacia y su ino-
cuidad. Los resultados obtenidos, en el estudio fito-
químico y la evaluación biológica de los constituyentes
mayoritarios, señalan que los compuestos reportados
por primera vez en esta especie muestran un verda-
dero potencial para ser considerados en el desarrollo
de moléculas líderes potencialmente útiles como
analgésico y en el tratamiento de la hipertensión y del
cáncer.
agradecemos el apoyo financiero al Consejo de
Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad
Central de Venezuela a través del Proyecto PG-06-
7342-2008.
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1999. pp. 72-228.
recibido: 26 de abril de 2012
aceptado: 11 de mayo de 2012
13
 desarrollo de un modelo matemático
para optimizar el proceso de granulación
húmeda en un mezclador tipo Sigma®
development of a mathematical model to optimize
the wetgranulation process in a Sigma type blender®

Jenny F SAturno AriAS1*, MArielA M SAlAzAr de SAAvedrA1

resumen
En este trabajo se desarrolló un modelo matemático para optimizar el proceso de granulación húmeda utilizado en la
obtención de gránulos de lactosa monohidratada en un granulador tipo sigma®. aplicando un diseño experimental cen-
tral compuesto de dos factores con un a de 1,414 se determinó el efecto de la concentración de la povidona (PVP) y del
tiempo de mezclado sólido-líquido (variables independientes) sobre las propiedades de flujo, la friabilidad, el porcen-
taje de polvo fino y el tamaño de partícula de los gránulos obtenidos (variables dependientes). a los resultados experi-
mentales de las propiedades de los granulados, se les realizó un análisis de regresión múltiple, con el cual se generó
las ecuaciones matemáticas que representaron a cada una de las variables dependientes estudiadas. Luego con estas
ecuaciones se desarrolló un modelo matemático que incluía a las variables dependientes en función a las indepen-
dientes, con la aplicación de restricciones. Para generar los valores óptimos se empleó sobre dicho modelo matemáti-
co, el método de barrera y el algoritmo del Simplex. Los resultados obtenidos se verificaron experimentalmente, per-
mitiendo concluir que se logró la optimización del proceso de granulación húmeda, fijando el valor óptimo de la con-
centración de la Povidona en 1,13% en base seca y 4 minutos de tiempo de mezclado sólido-líquido.

palabras clave: optimización, Proceso de Granulación Húmeda, Granulador Sigma, Modelo Matemático.

Abstract
in this study, a mathematical model was developed to optimize the wet granulation process used to obtain monohydra-
ted lactose granules in a sigma type blender ®. applying a two factor central compose experimental design with an a of
1.414, it determined the povidone (PVP) concentration effect and the solid-liquid mixing time (independent variables)
over granules properties: flow properties, granule size, friability and percentage of fine particles (dependent variables).
a multiple regression analysis was applied to the experimentally measured granule properties, in order to generate the
mathematical equations that represent each one of the dependent variables studied. Then, with these equations, a
mathematical model that includes the dependent variables studied as a function of independent variables with restric-
tions was developed. in order to generate the optimal values, the barrera method and the Simplex algorithms were
applied. a verification of the obtained experimental results was done. The study concluded that the wet granulation
process was optimized using the optimal values of 1.13% PVP dried concentration and fixing the solid-liquid mixing
time to 4 minutes.

Key words: optimization, Wet Granulation, Sigma Granulator, Mathematical Model.

introducción tiendo mejorar las deficientes propiedades de flujo y

Los gránulos son formas farmacéuticas sólidas
que contienen principios activos (Pa) y excipientes, en
su mayoría se obtienen por el método de granulación
húmeda, donde se incrementa el tamaño de las partí-
culas con el añadido de un líquido aglutinante permi-
la baja compresibilidad de las materias primas (Far-
macotecnia, 2004). Este proceso de mezclado de los
sólidos con el líquido aglutinante se puede realizar en
el mezclador sigma®, que es un recipiente cilíndrico
de acero inoxidable con uno o dos agitadores de aspa

1 Mención de Tecnología industrial Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela.

E-mail: jennysaturno81@yahoo.com,
* autor a quien dirigir la correspondencia.

14
 deSarrollo de un modelo matemático Para oPtimizar el ProceSo de granulación húmeda en un mezclador tiPo Sigma®
en forma de z que giran en sentido contrario y permi-
ten la formación de los gránulos (navascués, 2002).
El proceso de granulación húmeda es afectado por
varios factores dentro de los cuales se pueden encon-
trar: la cantidad del agente aglutinante utilizado, la ve-
locidad de añadido de la solución aglutinante, la velo-
cidad y el tiempo de mezclado sólido-líquido (badawy
y col., 2000). al final del proceso a los gránulos que se
obtienen se les puede determinar las siguientes pro-
piedades: forma y tamaño de las partículas, área su-
perficial, densidad del granulado, dureza, friabilidad,
propiedades de flujo, empaquetamiento, porosidad,
porcentaje de polvo fino, etc. (banker, 1986).
al variar los factores del proceso de granulación
húmeda anteriormente mencionados se pueden ob-
tener gránulos con las propiedades deseadas, para
lograrlo se puede ir cambiando un factor a la vez y de-
jando los otros constantes, hasta obtener dichas pro-
piedades, lo cual aumenta el costo en la producción.
Por esta razón, hoy en día se emplean el conjunto de
técnicas matemáticas agrupadas con el nombre de in-
vestigación de operaciones para realizar la optimiza-
ción del proceso y de esta manera obtener más rápi-
damente la forma farmacéutica con las características
deseadas a un menor costo (Doornbos, 1998).
La optimización es el camino para encontrar aque-
llos valores de las variables independientes contro-
lables (factores que afectan el proceso) que darán el
valor más deseado de las variables dependientes que
serán el objetivo (propiedades de los granulados
(Doornbos, 1998). En ella se pueden emplear diversos
diseños experimentales, uno de los más utilizados en
la industria farmacéutica para generar las ecuaciones
matemáticas de cada variable dependiente, es el dise-
ño central compuesto (DCC). además una excelente
estrategia que permite obtener los valores óptimos de
las variables independientes que generarán los valo-
res deseados de las variables dependientes, es el de-
sarrollo de un modelo matemático.
Un modelo matemático es una representación
idealizada, es una forma eficiente de ver las cosas en
la medida que se incluyen los aspectos relevantes del
sistema de estudio, se encuentra conformado por
una función objetivo y un conjunto de restricciones,
la mayoría no lineales. Para resolver dichos modelos
y generar valores óptimos de las variables indepen-
dientes existen métodos como el de barrera (Hillier y
Liberman, 2004) que permite transformar el modelo
matemático que contiene la función objetivo y las
restricciones a una ecuación matemática, donde in-
troduce las restricciones en la función objetivo me-
diante una llamada función de penalización-barrera
(Castillos, 2001).
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
Materiales y métodos
En esta investigación se emplearon como mate-
rias primas de uso farmacéutico a la lactosa monohi-
dratada y la povidona tipo K-29, además de materia-
les y equipos de laboratorio.
Como diseño experimental se implementó un di -
seño central compuesto de dos factores con un a de
1,414, con el cual se elaboraron 9 muestras por du-
plicado cuyos valores codificados dados por el DCC
fueron decodificados aplicando el análisis explorato-
rio previamente descrito en el artículo de Saturno y
Salazar (2010), los valores codificados del DCC para
dos factores se presenta en la Tabla i.
Tabla i
valores codificados del diseño experimental central
compuesto para dos factores con un valor
de a de 1,414
x1 x2
Muestra (concentración del (tiempo de mezclado
agente aglutinante) sólido-líquido)
1 1 1
2 1 -1
3 -1 1
4 -1 -1
5 0 0
6 1,414 0
7 0 1,414
8 -1,414 0
9 0 -1,414
Tomado de Doornbos Durk y De Hann (1998).
a través del diseño experimental se determinó el
efecto de las variables independientes: cantidad de
agente aglutinante en base seca (x1) y el tiempo de
mezclado sólido-líquido (x2) sobre las variables de-
pendientes: índice de compresibilidad (Y1), tamaño
de las partículas definido por el diámetro geométrico
(Y2), porcentaje de polvo fino (Y3), friabilidad (Y4) y la
velocidad de flujo (Y5).
ELaboraCión DE LaS MUESTraS
a escala piloto se elaboraron 9 lotes por duplica-
do de 1.000 gramos de lactosa monohidratada y dife-
rentes concentraciones del agente aglutinante PVP en
base seca de acuerdo al diseño central compuesto.
Se realizó el mezclado sólido-líquido en un mezclador
sigma® a una velocidad constante de 292 rpm y a di-
ferentes tiempos de mezclado (4-10 minutos). La ma-
sa húmeda se pasó por un granulador oscilante mar-
ca Erweka® con un tamiz de abertura de malla nº 12,
se dejaron secar los gránulos obtenidos en una estufa
Memmert® por 12 horas a una temperatura de 60 ºC.
15
 Jenny f Saturno ariaS, mariela m Salazar de Saavedra
Posteriormente, se pasaron nuevamente por el gra-
nulador oscilante que tenía un tamiz con una abertu-
ra de malla nº 16, luego se procedió a la evaluación
de estos.
EVaLUaCión DE LoS GranULaDoS
Los granulados obtenidos fueron evaluados a tra-
vés de la determinación de las variables dependien-
tes anteriormente mencionadas.
Determinación del porcentaje de índice de com-
presibilidad: Se pesó una muestra de 20,00 gramos
y se determinó el volumen que ésta desalojaba en
un cilindro graduado de 50,00 mililitros de capaci-
dad, con estos datos se cálculo la densidad aparente
usando la ecuación 1. Luego se determinó la densi-
dad compactada de la misma muestra en el densitó-
metro de compactación Vanderkamp® trascurridos
1000 taps con la ecuación 2. Con los resultados de
las densidades aparentes y compactadas, se cálculo
el porcentaje de índice de compresibilidad usando la
ecuación 3.
M
pa =
Va
ecuación 1. Determinación de la densidad aparente
M talmente (0,1125 gramos y 0,233 pulgadas). Se de-
pc =
Vc
ecuación 2. Determinación de la densidad
compactada.
pc – pa
%iC = x100
pc
ecuación 3. Determinación del índice
de compresibilidad
Donde:
pa = Densidad aparente.
pc = Densidad compactada.
M = Masa.
Va = Volumen aparente.
Vc = Volumen compactado.
% iC = Porcentaje de índice de compresibilidad.
Evaluación del tamaño de partícula: Se pesaron
10,00 g del granulado, se usó el Tamizador Tyler® con
una batería de tamices de mallas nº 10, 20, 40, 80,
16
100 y 200, se empleó un tiempo de vibración de 5
minutos y se determinó el diámetro geométrico a tra-
vés de una gráfica log-probabilística.
Evaluación del porcentaje de polvo fino (Menor
a 74 micras): Se pesaron 10,00 g del granulado, se
agitaron por 5 minutos en el tamizador Tyler® con ma-
llas nº 80, 200, se determinó el porcentaje de polvo
fino con la ecuación 4 tomando en consideración que
el porcentaje de polvo fino es menor a 74 micras.
(M200)
%PF = x100
M
ecuación 4. Determinación del porcentaje de polvo
fino de lo gránulos.
Donde:
%PF = Porcentaje de polvo fino.
M200 = Cantidad de masa que atravesó la malla nº 200
(74 micras).
M = Cantidad de masa previamente pesada.
Evaluación de la friabilidad: Se pesó 10,00 g del
granulado, se agitó por 5 minutos en el tamizador Ty-
ler® con mallas n° 45, 60 y 20 esferas de plástico de
peso y diámetro promedio determinado experimen-
terminó la friabilidad con la ecuación 5.
(Mi – Mf)
F= x100
Mi
ecuación 5. Determinación de la friabilidad
de lo gránulos.
Donde:
F = Friabilidad.
Mi = Cantidad de masa retenida en malla nº 60.
Mf = Cantidad de masa retenida en malla nº 60 con
las 20 esferas de plástico.
Evaluación de la velocidad de flujo: Se utilizaron
muestras de 100,00 gramos, las cuales se introduje-
ron dentro de un cilindro graduado de 200,00 milili-
tros de capacidad. Se dejó caer la muestra previa-
mente pesada sobre una balanza marca ohauss®,
con el cual se determinó la cantidad de muestra por
unidad de tiempo usando un flujómetro de Vankel® a
través de una matriz de diámetro de 11/32 pulgadas.
 deSarrollo de un modelo matemático Para oPtimizar el ProceSo de granulación húmeda en un mezclador tiPo Sigma®

DETErMinaCión DE LaS ECUaCionES MaTEMÁTiCaS
Para establecer las ecuaciones matemáticas, se
consideraron los resultados obtenidos en la caracteri-
zación de las variables dependientes (Y1, Y2, Y3, Y4,
Y5), en función a las variables independientes (x1, x2).
Estos datos se introdujeron en el software Stat-
graphics Plus® versión 5.1, con el cual se determina-
ron las ecuaciones matemáticas que representaron a
cada una de las variables utilizando el módulo Com -
pare opción anoVa multifactor para realizar una re-
gresión múltiple. Los resultados de dicho análisis mos -
traron la significancia de cada variable independiente
(x1, x2) con p-valores menores a 0,05.
DESarroLLo DEL MoDELo MaTEMÁTiCo
Se desarrolló un modelo matemático en el cual
fue necesario definir el problema, las variables, crear
la función objetivo a través de la generación de núme-
ros aleatorios que tomó en cuenta a cada una de las
variables dependientes en función a las independien-
tes. Las restricciones de este modelo fueron las ecua-
ciones matemáticas obtenidas con el Statgraphics
Plus® versión 5.1 para cada variable dependiente,
además se incluyeron los rangos deseados de cada
una de estas.
DETErMinaCión DE LoS ranGoS DE LoS VaLorES
óPTiMoS Con EL DESarroLLo DEL MoDELo MaTEMÁTiCo
Una vez generado el modelo matemático no lineal
se usó el método de barrera, con el cual se transformó
el modelo matemático conformado por una función
objetivo y un conjunto de restricciones en una ecua-
ción lineal, para ello se empleó la función de penali-
zación-barrera. Una vez obtenido el problema de pro-
gramación lineal fue resuelto con el programa Tora®
creado por Taha Hamdy (1997), el cual es un sofware
que permite maximizar o minimizar un problema de
programación lineal utilizando el método Simplex
para lograr la optimización.
resultados y discusión
La lactosa monohidratada utilizada en este traba-
jo, presentó un tamaño promedio de partículas de
153,33 micras y un índice de compresibilidad de 34,
94%. Estas propiedades son indicativas de unas de-
ficientes propiedades de flujo y de un pequeño tama-
ño de partícula.
Decodificación de los valores codificados
del DCC
Con el análisis exploratorio descrito en el artículo
de Saturno y Salazar (2010) se decodificaron los valo-
res codificados dados por el DCC de dos factores con
un a de 1,414, estos resultados se presenta en la
tabla ii.
Evaluación de los granulados
Los 9 lotes elaborados por duplicado fueron eva-
luados a través de las determinación de las variables
dependientes (Y1, Y2, Y3, Y4, Y5), en la tabla iii se pre-
sentan los resultados de las propiedades de los gra-
nulados con sus respectivos valores promedios y des-
viaciones estándares.

Tabla ii
valores decodificados del diseño experimental central compuesto para dos factores
con un valor de a de 1,414
x1 x2
(concentración del agente (tiempo de mezclado
Muestra aglutinante) sólido-líquido)
codificados decodificados codificados decodificados
1 1 1,13 % 1 9 Min.
2 1 1,13 % -1 5 Min.
3 -1 0,63 % 1 9 Min.
4 -1 0,63 % -1 5 Min.
5 0 0,88 % 0 7 Min.
6 1,414 1,23 % 0 7 Min.
7 0 0,88 % 1,414 10 Min.
8 -1,414 0,53 % 0 7 Min.
9 0 0,88 % -1,414 4 Min.
Tomado de Doornbos Durk y De Hann (1998).

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 17

 Jenny f Saturno ariaS, mariela m Salazar de Saavedra

Tabla iii
evaluación de los lotes decodificados
% ic velocidad de flujo % Friabilidad diámetro % polvo
(gramos/segundo) geométrico (micras)
promedio desviación promedio desviación promedio desviación promedio desviación promedio desviación x1 x2
estándar estándar estándar estándar estándar
1 19,96 0,08 3,68 0,18 5,37 0,69 550 0,03 7,24 0,03 1,13 9
2 19,06 0,16 5,39 0,24 6,79 0,43 350 0,04 8,81 0,15 1,13 5
3 19,97 0,45 4,14 0,06 1,46 0,12 480 0,10 8,38 0,08 0,63 9
4 21,79 0,06 5,59 0,35 5,53 0,37 350 0,09 8,41 0,26 0,63 5
5 11,17 0,61 3,99 0,46 1,8 0,24 435 0,04 6,72 0,16 0,88 7
6 20,32 0,07 4,15 0,14 2,24 0,06 455 0,13 5,47 0,04 1,23 7
7 16,83 0,28 0,20 0,57 1,58 0,39 1000 0,00 8,05 0,14 0,88 10
8 20,36 0,34 2,42 0,02 2,51 0,56 455 0,10 5,76 0,06 0,53 7
9 24,32 0,09 5,65 0,11 11,67 0,54 255 0.03 15.56 0.31 0,88 4
iC = Índice de compresibilidad.

Determinación de las ecuaciones Desarrollo del modelo matemático

matemáticas que representan a cada
una de las variables dependientes
Con los resultados obtenidos de la evaluación de
los granulados (Tabla iii) se construyeron las ecuacio-
nes matemáticas utilizando el módulo Compare op-
ción anoVa multifactor del software Statgraphics
Plus® versión 5.1, con sus respectivos valores de r2
ajustados para grados de libertad. Estos resultados
se muestran en la Tabla iV.
Se desarrolló un modelo matemático que repre-
sentó a todas las variables dependientes (Y1, Y2, Y3, Y4
y Y5) en función a las independientes x1, x2. Este mo -
delo se encontró conformado por una función objeti-
vo y por un número de restricciones. a continuación
se presentan los pasos utilizados en la construcción:
1. Definición del problema: Se desea optimizar el
proceso de granulación húmeda de la lactosa mo-

Tabla iV
determinación de las ecuaciones matemáticas que representan
a cada una de las variables dependientes
variables % r2
dependientes ecuación (ajustada a grados
de libertad)

Índice de compresibilidad ecuación 6

(Y1) Y1 = 127,185 – 141,02x1 + 76,9004x12 – 69,40
14,35351x2 + 1,02641 x22

Diámetro geométrico ecuación 7

(Y2) Y2 = 797,367 – 1573,18x1 + 1287,85x12 69,55

Porcentaje polvo fino ecuación 8

(Y3) Y3 = 49.9693 – 95.3801x1 + 50.7217 x12 57,25

Friabilidad ecuación 9
(Y4) Y4 = 39,5419 – 77,2057x1 + 36,8147x12 + 66,83
0,35624x1x2

Velocidad de flujo ecuación 10

(Y5) Y5 = 2,85274 + 1,13483x1 – 0,839x1x2 + 31,54
0,769761x2

18
 deSarrollo de un modelo matemático Para oPtimizar el ProceSo de granulación húmeda en un mezclador tiPo Sigma®
nohidratada a escala piloto en un granulador tipo
sigma®.
2. Definición de las variables: Las variables inde-
pendientes que permitieron tomar las decisiones
en la optimización del proceso de granulación
húmeda de la lactosa monohidratada fueron:
x1 = La cantidad de agente aglutinante en base seca.
x2 = El tiempo de mezclado sólido – líquido.
3. Definición de la función objetivo: En la ecua-
ción 11 se presenta la función objetivo de la opti-
mización del proceso de granulación húmeda de
la lactosa monohidratada, la cual fue expresada
como la minimización de una función matemática
de las variables independientes o también llama-
das variables de decisión, con sus respectivos coe-
ficientes de costos. Estos coeficientes de costos
que acompañan a x1 y x2, se obtuvieron seleccio-
nando números aleatorios que permitieron mini-
mizar el uso de los equipos, los costos de obten-
ción del granulado y por ende obligan a reducir o
minimizar la concentración del agente aglutinante
utilizado y el tiempo de mezclado sólido líquido.
Min F(x1, x2) = –0,4x1 + 1,89x2
ecuación 11. Función objetivo del modelo mate-
mático desarrollado
4. Definición de las restricciones: Para definir
las restricciones del modelo matemático se utili-
zaron las ecuaciones 6, 7, 8, 9 y 10, obtenidas
con el programa Statgraphics Plus® versión 5.1
(Tabla iV) y se adicionó el rango establecido como
el deseado para cada una de las variables inde-
pendientes x1 y x2.
rango de la variable x1 0,53 ≤ x1 ≤ 1,13
rango de la variable x2 4 ≤ x2 ≤ 10
5. Modelo matemático: El modelo matemático re -
sultó ser:
Min F(x1, x2) = –0,4x1 + 1,89x2
Sa: 127,185 – 141,2x1 + 76,9x12 + 14,35x2 + 1,03x22
797,37 – 1573,18x1 + 1287,85x12
49,97 – 95,3801x1 + 50,7217x12
39,54 – 77,21x1 + 36,8147x12 + 0,3562x1x2
2,85274 + 1,13x1 – 0,84x1x2 + 0,76976x2
0,53 ≤ x1 ≤ 1,13
4 ≤ x2 ≤ 10
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
Determinación de los rangos de los valores
óptimos con el desarrollo del modelo
matemático
Este modelo matemático fue resuelto por el méto-
do de barrera, en función a cada una de las variables
independientes x1 y x2, con el cual se obtuvo la ecua-
ción matemática 12 que se presenta a continuación:
–5489,17x1 + 1,703x2 + 3569,33 = 0
ecuación 12. Solución por el método de barrera
Por ser la ecuación anterior lineal se pudo traba-
jar con los métodos de programación lineal, básica-
mente con el algoritmo del Simplex, utilizando para
ello el programa Tora®.
VEriFiCaCión DE LoS rESULTaDoS
Para realizar la verificación de los resultados se fi-
jaron los rangos deseados de las variables depen-
dientes, tal y como se muestra a continuación:
Y1 = El índice de compresibilidad = 5% – 15%.
Y2 = El diámetro geométrico > 100 Micras.
Y3 = El porcentaje de polvo fino = 10% – 20%.
Y4 = La friabilidad = 0,1-0,9%.
Y5 = La velocidad de flujo > 4 gramos/segundo.
al utilizar el programa Tora® se obtuvieron los si-
guientes valores para x1 y x2:
x1 = 1,13% base seca.
x2 = 4 Minutos.
Con estos resultados se calcularon los valores
teóricos para cada una de las variables dependientes
Y1, Y2, Y3, Y4 y Y5
Y1 = El índice de compresibilidad = 12%.
Y2 = El diámetro geométrico > 660 Micras.
Y3 = El porcentaje de polvo fino = 6,95%.
Y4 = La friabilidad = 0,91%.
Y5 = La velocidad de flujo > 3,42 gramos/segundo.
Se verificaron experimentalmente los valores de
x1 y x2 mediante la elaboración de un lote por triplica-
do de lactosa monohidratada. Estos resultados se
muestran en la Tabla V. Se observó que el índice de
compresibilidad disminuyó de un valor de 34,94% a
10,95% lo cual es indicativo de una mejoría de las
propiedades de flujo, adicionalmente se considera
que la especificación establecida para este índice se
19
 Jenny f Saturno ariaS, mariela m Salazar de Saavedra
encuentra dentro de los límites previamente estable-
cidos (5%-15%). La velocidad de flujo de los granula-
dos de lactosa monohidratada fue de 3,63 gramos
por segundo encontrándose fuera de los límites pre-
viamente establecidos para esta especificación. El
diámetro geométrico de los granulados de lactosa
monohidratada aumentó a 580 micras lo cual permi-
tió mejorar el índice de compresibilidad y adicional-
mente se encuentra dentro de los límites previamen-
te establecidos para dicha propiedad. La friabilidad
disminuyó a 0,73% lo cual indica que se encuentra
dentro de los límites.
Tabla V
resultados obtenidos para las variables dependientes en función al modelo matemático
rangos establecidos
de la especificaciones previas
Índice de compresibilidad (Y1) 5 – 15
Diámetro geométrico (micras) (Y2) > 100
Porcentaje de polvo fino (Y3) 10 – 20%
Friabilidad (Y4) 0.1 – 0.9
Velocidad de flujo (Y5) > 3gramos/segundo
al analizar los resultados obtenidos se infiere que
lo valores experimentales de las variables: diámetro
geométrico, índice de compresibilidad y la friabilidad
se encuentran dentro de los límites previamente esta-
blecidos. En todos lo casos se obtuvo un porcentaje
de error mayor al 5% entre el valor predicho por el
modelo y el valor obtenido experimentalmente. Con
respecto al porcentaje de polvo fino, se puede obser-
var que los resultados se encuentran fuera de los limi-
tes previamente establecidos, sin embargo, al obser-
var el valor teórico predicho por el modelo, se deter-
minó fácilmente que el resultado experimental se
encuentra cercano a dicho valor. al igual que con el
caso de las otras variables el porcentaje de error en-
tre los valores teóricos y los experimentales es mayor
al 5%.
conclusiones
• Para predecir los valores óptimos del proceso de
granulación húmeda, los factores cantidad de agen -
te aglutinante (x1) en base seca y el tiempo de mez-
clado sólido – líquido (x2) mostraron tener gran re -
levancia.
20
• El desarrollo de un modelo matemático que inclu-
ya a todas las variables dependientes e indepen-
dientes es un método ideal en la optimización del
proceso de granulación húmeda.
• El modelo matemático es un método que necesita
de herramientas matemáticas, de programación
lineal y no lineal.
• La función objetivo desarrollada para el modelo
ma temático permite minimizar la cantidad de
agente aglutinante utilizado y el tiempo de mezcla-
do sólido-líquido, permitiendo disminuir los costos
del proceso de granulación húmeda.
valor valor %
teórico real error
12 10,95 8,75
660 580 12,12
6,95 6,21 10,64
0,91 0,73 19,78
3,42 3,63 6,14
• quedo demostrado en el presente trabajo que pa-
ra las variables independientes el error encontra-
do entre la predicción y el valor experimental es
mayor al 5%, sin embargo, la mayoría de estas va-
riables se encuentran dentro de los rangos desea-
dos para cada una de ellas.
• Se logró la optimización del proceso de granula-
ción húmeda fijando el valor de la cantidad de
agente aglutinante en 1,13 % en base seca y 4 mi-
nutos de tiempo de mezclado sólido-líquido.
Agradecimientos
al instituto de investigaciones de la Facultad de
Farmacia de la Universidad Central de Venezuela por el
financiamiento otorgado al proyecto i.i.F nº 05/2004.
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recibido: 22 de junio de 2012
aceptado: 25 de julio de 2012
21
 el Farmacéutico y el uso racional
de los productos biológicos terapéuticos*
the pharmacist and rational use of biological
therapeutic products

MAgAly pedrique de AulAcio**

resumen
Este artículo describe conceptos básicos importantes sobre los productos biológicos terapéuticos, sus diferencias con
los medicamentos convencionales obtenidos por síntesis química y las tendencias regulatorias aplicadas a este tipo de
producto. También destaca la contribución del farmacéutico, en su calidad de profesional experto en medicamentos,
para el uso racional de los productos biológicos terapéuticos.

palabras clave: Productos biológicos terapéuticos, tendencias regulatorias, uso racional, farmacéutico.

Abstract
This article describes important basic concepts about therapeutic biological products, the difference with conventio-
nal drugs obtained by chemical synthesis and the regulatory trends applied to these products. it also highlights the
pharmacist’s contribution, as a medication expert, on the rational use of therapeutic biological products.

Key words: Therapeutic biological products, regulatory trends, rational use, pharmacist.

introducción como: evidencias clínicas convincentes que demues-

Los productos biológicos terapéuticos constituyen
la categoría de productos farmacéuticos que marca el
mayor crecimiento anual en el mercado farmacéutico
mundial. El arsenal terapéutico de los productos bioló-
gicos incluye una gran variedad de fármacos, entre los
cuales podemos citar: eritropoyetinas, interferones,
factores estimulantes del crecimiento de colonias de
granulocitos, anticuerpos monoclonales, insulina re -
combinante humana, somatotropina, heparinas de
bajo peso molecular, etc.
Los productos biotecnológicos, como también se
les denomina, constituyen la esperanza de encontrar
nuevas curas y tratamientos para enfermedades gra-
ves. Sin embargo, la complejidad de los procesos de
fabricación y control exigen estrictas normas para su
producción y comercialización. En efecto, para obte-
ner la aprobación de comercialización de un producto
bioterapéutico, la autoridad regulatoria del país donde
será comercializado exige una serie de recaudos, tales
tren la seguridad y la eficacia del producto, informa-
ción que demuestre la consistencia lote a lote, la esta-
bilidad del producto, etc.
a medida que se van venciendo las patentes de
los productos biotecnológicos, comienzan a surgir
productos con efectos similares. a éstos se les deno-
mina biosimilares o productos biotecnológicos simila-
res, y en muchas ocasiones los fabricantes de dichos
productos pretenden que las autoridades apliquen
una vía de aprobación abreviada, como suele suceder
con los productos farmacéuticos de síntesis química.
Sin embargo, el deber ser es que los fabricantes de
biosimilares proporcionen datos preclínicos y clínicos
pertinentes para la autorización de comercialización,
además de un conjunto completo de datos de calidad
y datos comparativos. Este es el caso en Europa, don-
de las autoridades son bastante exigentes con los fa-
bricantes de productos biosimilares.
Hay múltiples razones por las cuales el nivel de
exigencia asociado a los productos biosimilares debe

* artículo publicado bajo el auspicio de Sanofi de Venezuela, S.a.

** Facultad de Farmacia - Universidad Central de Venezuela. apartado 40109. Caracas, Venezuela.

22
 el farmacéutico y el uSo racional de loS ProductoS BiológicoS teraPéuticoS
mantenerse elevado. Entre éstas podemos resaltar el
hecho de que los productos biotecnológicos son es -
tructuras complejas, con un alto peso molecular, in-
volucrando a menudo no sólo una secuencia precisa
de aminoácidos (estructura primaria), sino también
un plegamiento tridimensional (estructura secundaria
y terciaria) y una disposición específica de las subuni-
dades (estructura cuaternaria). adicionalmente, mu-
chos productos biológicos sufren modificaciones pos-
teriores a la traducción, tales como la glicosilación,
para producir la forma biológicamente activa (Kuhl-
mann y Covic, 2006). otro aspecto a considerar es el
hecho de que su producción involucra la manipula-
ción de células vivas. Esto hace que los procesos de
producción comprendan muchos pasos críticos y su
caracterización completa resulte difícil. Finalmente, a
pesar de que tanto los productos originales como los
biosimilares pueden presentar impurezas, éstas no
son necesariamente las mismas (Prugnaud, 2007).
EL ProDUCTo ES EL ProCESo
La fabricación de productos bioterapéuticos es un
proceso de múltiples pasos y cada paso está asocia-
do a una variabilidad inherente. además, los proce-
sos utilizados en la fabricación de productos biotera-
péuticos son muchísimo más complejos que los que
se usan en la elaboración de productos genéricos tra-
dicionales (Kuhlmann y Marre, 2010). Pequeñas dife-
rencias en el proceso de fabricación pueden dar lugar
a productos diferentes. Por eso, las características de
los productos biotecnológicos están en gran parte de-
terminadas por su proceso de fabricación. Diferen-
cias menores en la clonación, fermentación o purifi-
cación pueden conducir a variaciones de las estructu-
ras terciarias y cuaternarias, así como de los patrones
de modificación post-traduccional de las proteínas
(WHo; 2009).
Por otra parte, los productos biológicos terapéuti-
cos procedentes de diferentes fabricantes pueden ser
similares en apariencia, sin tener los mismos perfiles
de calidad, seguridad clínica y eficacia. Esto se debe
a que los sistemas de expresión pueden ser diferen-
tes entre los biosimilares y los productos biológicos
originales, de modo que los pasos de cultivo y de pro-
ducción de proteínas serán diferentes.
La tecnología actual no permite una caracteriza-
ción completa de las diferencias moleculares, por lo
cual la variabilidad en pureza y estabilidad es inevita-
ble. Estas variaciones pueden modificar de manera
importante la actividad, la estabilidad, la especifici-
dad y la inmunogenicidad, haciendo diferir significati-
vamente el producto biosimilar del producto original.
Por estas razones las vías abreviadas de aproba-
ción para el registro de moléculas químicas sencillas
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
no deben ser aplicadas a los productos biotecnológi-
cos. Si bien las pruebas que se le aplican a los medi-
camentos genéricos de síntesis química son necesa-
rias, éstas son insuficientes para evaluar la eficacia
de los productos biosimilares. Es necesario realizar
ensayos clínicos para comparar la seguridad de los
biosimilares con los productos bioterapéuticos origi-
nales (Prugnaud, 2007).
En la literatura científica existen múltiples casos
que nos ayudan a comprender la importancia del pro-
ceso de fabricación sobre los perfiles de seguridad y
eficacia de los productos. a título de ejemplo, dos ca-
sos fueron seleccionados.
Caso de las insulinas Marvel
Un ejemplo de cómo el desarrollo y registro de los
biosimilares es más complejo que el de los genéricos
de moléculas pequeñas se puede encontrar en el ca-
so de Marvel Life Sciences Ltd. Este caso ilustra, tanto
los efectos de las variaciones en los procesos de fa-
bricación, como las exigencias de la EMa (agencia
Europea de Medicamentos) para la aprobación de un
producto biosimilar. Marvel presentó una solicitud a
la EMa en Marzo de 2007 para la aprobación de tres
formulaciones diferentes de insulina recombinante:
insulina humana rápida Marvel (insulina soluble), in-
sulina humana de larga duración Marvel (insulina iso-
fánica) y la mezcla de insulina humana 30/70 Mar vel
(30% soluble/ 70% de insulina isofánica) (Kuhlmann
y Marre, 2010).
La EMa encontró que el expediente Marvel estaba
incompleto en muchos aspectos relacionados con la
calidad, incluyendo detalles en los procesos de fabri-
cación y purificación, controles en proceso, ensayos
de impurezas y la elección de un producto de referen-
cia. Los datos clínicos presentados por Marvel tampo-
co incluyeron los estudios farmacocinéticos recomen-
dados, y por otro lado, los resultados de los estudios
farmacodinámicos de clamp euglucémico sugirieron
que los productos diferían, de una manera clínicamen-
te significativa, del producto de referencia. Por ejem-
plo, el producto “rápido” mostró una absorción más
rápida, un efecto más potente sobre la glucosa en
plasma y un tiempo de eliminación más rápido que el
producto de referencia (European Medicines agency,
2007, 2008a, 2008 b).
Un ensayo clínico fue realizado para probar la se-
guridad y eficacia de las tres insulinas. Era un ensayo
comparativo, doble ciego de 12 meses de duración,
que comparó las tres formulaciones de insulina Mar -
vel contra sus respectivos productos de referencia,
seguido por una extensión abierta del estudio duran-
te 6 meses. Este estudio incluyó 526 pacientes con
23
 magaly Pedrique de aulacio
diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2. Los resultados mos-
traron una tasa de descontinuación en los grupos de
insulinas Marvel significativamente mayor que en los
grupos de insulinas de referencia. además, la eficacia
a largo plazo (medida por el efecto sobre la hemoglo-
bina a1C) mostró tendencias consistentes en favor de
los productos de referencia.
Entre las objeciones de la EMa a la solicitud des-
tacan, la evaluación incompleta de la inmunogenici-
dad y el incumplimiento a las exigencias de la EMa en
el plan de manejo de riesgos. En enero de 2008, la
EMa anunció que Marvel Life Sciences había retirado
sus solicitudes de las tres formulaciones de insulina
(Kuhlmann y Marre, 2010).
Caso de la eritropoyetina Eprex
Este caso ilustra cómo un cambio en la formula-
ción de un producto biotecnológico tuvo consecuen-
cias graves en pacientes tratados con el producto
reformulado. Se trata del producto biológico original
Eprex®/Erypo®. Kuhlmann y Marre (2010), hacen una
completa descripción de este caso, que representa
un ejemplo de la complejidad del proceso de fabrica-
ción de un producto biológico original.
En los años 2000 a 2002, hubo un aumento del
número de casos reportados fuera de los EE.UU. de
aplasia pura de glóbulos rojos, (PrCa, por sus siglas
en inglés) con anticuerpos contra la eritropoyetina
positivos, entre los pacientes que recibieron eritropo-
yetina humana recombinante. Estos casos de PrCa
coincidieron con la sustitución de albúmina sérica
humana (HSa, por sus siglas en inglés) por polisorba-
to 80 en jeringas prellenadas de Eprex®/Erypo® y dis-
tribuidas fuera de los EE.UU. (Krämer y Vulto, 2008).
El mecanismo preciso del efecto provocado por el
cambio en el proceso de fabricación todavía está en
debate. Se ha sugerido que el polisorbato 80, un sur-
factante que tiende a formar micelas, puede haber
promovido la formación de micelas conteniendo eri-
tropoyetina, y que éstas pueden parecerse a patóge-
nos extraños, lo cual podría haber desencadenado
una ruptura de la autotolerancia inmune. Una explica-
ción alterna es que el polisorbato 80 podría haber
reaccionado con los tapones de goma no recubiertos
de las jeringas pre-llenadas, produciendo lixiviados
que pueden haber actuado como adyuvantes provo-
cando una respuesta inmune. Por otra parte, la nueva
formulación podría haber sido más vulnerable a la
desnaturalización o la agregación bajo condiciones
inadecuadas de almacenamiento o manipulación. En
el 2003, el fabricante reemplazó los tapones de goma
no cubiertos por tapones de goma recubiertos con
teflón, mejoró la cadena de frío del producto y emitió
24
directrices e instrucciones detalladas enfatizando la
importancia del almacenamiento entre 2 y 8ºC. ade-
más, recomendaron hacer la administración por vía
intravenosa en lugar de vía subcutánea. Después de
tales cambios, la incidencia de casos de PrCa dis-
minuyó a niveles similares a los vistos antes de la apa-
rición del problema.
TEnDEnCiaS rEGULaToriaS Para La aProbaCión
DE ProDUCToS bioTECnoLóGiCoS
Las exigencias regulatorias son muy variadas en
los diferentes países. La agencia Europea del Medica-
mento (EMa) ha sido pionera en la regulación de la
aprobación de los productos biosimilares que apare-
cen en el mercado luego de vencidas las patentes.
Para la aprobación de esos productos se ha tomado
como marco legal la Directiva 2001/83/EC de la
Unión Europea, modificada por la Directiva 2003/
63/EC y llamada anexo i, así como la 2004/27/EC,
que entró en vigor en octubre de 2005. Estas directi-
vas establecen que un producto biológico similar a
otro de referencia, generalmente no reúne todas las
condiciones para ser considerado como genérico, de-
bido al proceso de fabricación. También hace referen-
cia a los aspectos de calidad, seguridad y eficacia.
Los grupos de trabajo de la EMa han desarrollado
diferentes directrices generales y específicas para fa-
cilitar los procesos regulatorios. De ahí que haya sido
en Europa donde nació el concepto de biosimilitud.
éste se sustenta en la demostración de una calidad,
seguridad y eficacia comparables entre el biosimilar y
el producto de referencia. De esta manera, para que
un producto pueda ser considerado como biosimilar,
se debe realizar un ejercicio de comparabilidad, así
como estudios no clínicos y clínicos apropiados. Si el
medicamento innovador tiene diferentes indicacio-
nes, el medicamento que se estudia debe justificar
que es biosimilar en cada indicación. En algunos ca-
sos puede extrapolarse la similitud terapéutica, en
función de la evidencia disponible, según el mecanis-
mo de acción o el receptor de unión sean o no el mis-
mo en todos los casos. además, la legislación de la
Unión Europea exige al fabricante un plan de manejo
de riesgos diseñado para identificar y cuantificar los
aspectos de seguridad.
En vista de que en muchos países ya existe una
amplia gama de Productos bioterapéuticos Similares
en desarrollo o ya autorizados, la organización Mun-
dial para la Salud (oMS) reconoció formalmente, en el
año 2007, la necesidad de elaborar directrices para
su evaluación y reglamentación general. En octubre
de 2009, este organismo publicó las recomendacio-
nes para la Evaluación de Productos bioterapéuticos
 el farmacéutico y el uSo racional de loS ProductoS BiológicoS teraPéuticoS
Similares (PbS). El documento tiene por objeto pro-
porcionar orientación para el desarrollo y la evalua-
ción de los productos bioterapéuticos. Los principios
generales afirman que el enfoque establecido para
medicamentos genéricos de moléculas pequeñas no
puede ser aplicado a los biosimilares. Estas directri-
ces indican la necesidad de un proceso de compara-
ción para establecer la similitud en calidad, seguridad
y eficacia. También contemplan que las recomenda-
ciones constituyen un documento dinámico que con-
tinuará siendo desarrollado, ajustándose al progreso
del conocimiento y la experiencia científica.
Del citado documento existen versiones en espa-
ñol y portugués, realizadas por el Grupo de Trabajo
de Productos biotecnológicos de la red ParF (red Pa -
namericana de armonización de la reglamentación
Farmacéutica) en 2011. éstas constituyen el Docu-
mento Técnico nº 7 de la red ParF que tiene por ob-
jeto facilitar la divulgación de su contenido en países
de habla hispana y portuguesa de la región de las
américas, de manera que dichas recomendaciones
puedan ser adoptadas total o parcialmente, o ser em-
pleadas como bases para el establecimiento de mar-
cos normativos nacionales para la autorización de
comercialización (registro sanitario) de productos bio-
tecnológicos similares.
a título informativo, la red ParF tiene como obje-
tivo armonizar la regulación de medicamentos en las
américas, e incluye la participación de todas las auto-
ridades reguladoras de la región, junto con represen-
tantes de la academia, la industria y otros expertos. El
punto de encuentro principal es la Conferencia Pana-
mericana en armonización de la regulación de Medi-
camentos, donde participan también otras organiza-
ciones de interés como CariCoM (Caribbean Com-
mon Market), MErCoSUr (Mercado Común del Sur),
naFTa (North American Free Trade Agreement) y Si-
Ca (Sistema de integración Centro americano). En
enero de 2010, la red ParF creó un Grupo de Trabajo
de Productos biotecnológicos cuya misión es «promo-
ver el desarrollo de la reglamentación de productos
biotecnológicos en los países de la Región de las
Américas, generando mecanismos más eficaces y
armonizados para la regulación de esta categoría
de medicamentos». Como producto de las reuniones
de este grupo de trabajo se realizó una revisión de la
reglamentación de productos biológicos y biotecnoló-
gicos en países de Latinoamérica y del Caribe, la cual
fue publicada por Pombo y col. (2009).
En Venezuela, el tema de la regulación de los pro-
ductos biológicos data de muchos años, como lo indi-
ca el boletín 27 de las normas de la junta revisora de
Productos Farmacéuticos (MSaS, 1993). Este docu-
mento contempla un capítulo para productos biotec-
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
nológicos, lo cual muestra que Venezuela es pionera
en contar con una normativa específica para este tipo
de medicamento. En la actualidad, la evaluación para
la comercialización de un producto biotecnológico en
Venezuela está basada en la norma para el registro,
Liberación de Lotes y Control de Los Productos bioló-
gicos (Documento aprobado por el Consejo del insti-
tuto nacional de Higiene «rafael rangel», en Sesión nº
36/2008 de fecha 09/12/08). En esta norma, las exi-
gencias son las mismas sin importar el origen del pro-
ducto (innovador o no). además, la reglamentación
hace énfasis en el método de fabricación, control de
calidad, exigencia de estudios clínicos y en un plan de
farmacovigilancia. En la actualidad, se está comenzan-
do un proceso de revisión de la citada norma, a fin de
incorporar el término de biosimilar y los recaudos
específicos para estos productos, de acuerdo a las
sugerencias de la Guía para la Evaluación de similares
bioterapéuticos emitida por la organización Mundial
de la Salud en octubre de 2009 (ibarz, 2011).
PLan DE ManEjo DE riESGo Y FarMaCoViGiLanCia
Dado el limitado programa clínico de los biosimila-
res, no sólo en términos de número de sujetos, sino
también en el tamaño y tipo de ensayos, es posible
que las reacciones adversas poco frecuentes y los pro-
blemas de inmunogenicidad no puedan ser detecta-
dos antes del lanzamiento de un producto biosimilar.
a veces es necesario que el producto sea utilizado por
muchos pacientes antes de la aparición de problemas.
Por lo tanto, a todos los fabricantes de biosimila-
res se les exige proporcionar un plan de manejo de
riesgos o plan de farmacovigilancia, con el fin de reco-
ger los datos de seguridad e inmunogenicidad de ma-
nera permanente después del lanzamiento. La inmu-
nogenicidad siempre debe ser tratada en el plan, te-
niendo en cuenta todos los riesgos identificados du-
rante el desarrollo del producto y todos los posibles
riesgos y consecuencias para los pacientes en el caso
de una respuesta inmune no deseada. Sin embargo, la
utilización de datos post-comercialización para com-
plementar los datos de seguridad previos a la comer-
cialización de los biosimilares, sólo puede ser realiza-
da en países que cuentan con sistemas de farmaco -
vigilancia bien establecidos.
inMUnoGEniCiDaD CoMo EL Gran riESGo
Es importante estudiar la inmunogenicidad poten-
cial de un producto biotecnológico de manera exhaus-
tiva. Debido a las limitaciones de la metodología analí-
tica disponible y a la carencia de pruebas estándar pa-
ra la inmunogenicidad, así como a la carencia de datos
consistentes sobre la inmunogenicidad provenientes
25
 magaly Pedrique de aulacio
de diferentes laboratorios analíticos que estén utili-
zando las mismas pruebas, los datos de inmunogeni-
cidad sólo pueden ser evaluados mediante el análisis
de los datos clínicos después del lanzamiento del pro-
ducto. Cambios frecuentes de productos podrían au-
mentar el riesgo de inducir inmunogenicidad o produ-
cir confusión en las evaluaciones retrospectivas de
reacciones adversas.
Las directrices sobre inmunogenicidad del Comité
de la EMa de los Medicamentos para Uso Humano
(CHMP) (EMa; 2007a) proporcionan recomendacio-
nes generales para la realización de una evaluación
sistemática de la inmunogenicidad. Desde el punto
de vista de la autorización de comercialización, de-
ben recogerse los datos de un número suficiente de
pacientes.
El programa de muestreo para la detección de
una respuesta inmune debe ser adaptado y definido
de forma individual para cada producto. En caso de
un tratamiento crónico continuo, los datos de inmu-
nogenicidad obtenidos generalmente durante un año,
deben estar disponibles antes de la autorización.
además, deben recogerse datos sobre la eficacia y la
seguridad para entender plenamente las consecuen-
cias clínicas de la respuesta inmune. Por ejemplo, en
el caso de los biosimilares de insulina soluble, la EMa
exige que la inmunogenicidad de estos productos ha-
ya sido estudiada clínicamente en ensayos con una
duración mínima de 12 meses y con incorporación de
una fase comparativa de al menos 6 meses.
algunos autores coinciden en que el problema de
la intercambiabilidad de los medicamentos biosimi-
lares con el producto de referencia proviene de la
posible existencia de problemas inmunológicos. no
obstante, esta situación también puede ser obser -
vada cuando se intercambian dos medicamentos bio-
tecnológicos innovadores. Por ejemplo, cuando se in-
tercambia un producto de primera generación por
otro de segunda (como es el caso de darbepoetina y
eritropoyetina alfa o de filgastrim pegilado y filgas-
trim) o cuando se intercambia un biológico innovador
por el mismo biológico modificado en su proceso de
fabricación.
Las reacciones inmunológicas a los productos bio-
tecnológicos pueden ser agudas, tales como anafila-
xia, exantema, urticaria, angioedema y enfermedad
del suero, principalmente. También existen reaccio-
nes a largo plazo que se manifiestan después de mu-
chas administraciones (normalmente después de
más de un año) y que son mediadas por anticuerpos
(neutralizantes o no). Las agudas suelen ser reaccio-
nes inmediatas a la infusión y, excepto en el caso de
alergia grave y angioedema, los fármacos se manejan
con una premedicación que incluye paracetamol y an -
26
tihistamínicos. En los casos graves, estas reacciones
pueden impedir la repetición del tratamiento desde la
segunda o tercera administración del fármaco, a cau-
sa de la severidad de la reacción. En algunos casos de
alergia grave, los pacientes incluso han podido llevar
a cabo tratamientos de desensibilización al medi-
camento.
Con respecto a la producción de anticuerpos neu-
tralizantes, la cual puede ser atribuida al intercambio
de productos biosimilares, es importante tener en
cuenta que, en la mayor parte de los casos, la presen-
cia de estos anticuerpos tiene poca o ninguna conse-
cuencia. Sin embargo, en algunos casos, no sólo pue-
den disminuir la eficacia del medicamento sino que
pueden reaccionar con la propia molécula endógena,
provocando serios efectos adversos. La probabilidad
de crear anticuerpos, así como su repercusión clínica,
varían con el tipo de molécula, su secuencia amino-
acídica y glucídica, el tipo de plegamiento, la existen-
cia de impurezas tales como contaminantes y adyu-
vantes, el estado de agregación y la vía, frecuencia y
dosis de administración.
otros factores que influyen en la aparición de reac-
ciones adversas a medicamentos (ra) de tipo inmu-
nológico son la idiosincrasia o predisposición genética
del propio paciente, la enfermedad de base, los trata-
mientos concomitantes y la sensibilización previa al
producto en cuestión o a productos similares.
La aparición de estos eventos adversos de tipo in-
munológico puede predecirse, con cierto grado de
aproximación, a través de análisis físico-químicos (de-
terminación de epítopos de células T), de algoritmos
informáticos (análisis de secuencia y predicción de
epítopos de células T), de determinación de inmuno-
genicidad en modelos animales (ratones, monos y ra-
tones transgénicos) y de ensayos clínicos en huma-
nos. En los dos últimos análisis, se determina el tipo
de anticuerpos producidos por inmunoensayo, radio-
inmunoprecipitación, resonancia de plasma superfi-
cial (plasmon resonancia), técnicas de Western blot
(immunoblotting) y bioensayos que son esenciales
para determinar si los anticuerpos producidos son
neutralizantes o no. Todos estos ensayos, llevados a
cabo con una estrategia adecuada, pueden dilucidar
si la molécula analizada producirá problemas inmu-
nológicos. no obstante, en algunos casos, sólo un pe-
queño porcentaje de pacientes producen anticuer-
pos, y entre éstos, una subpoblación produce anti-
cuerpos neutralizantes. Estos casos sólo pueden ser
detectados con un plan de manejo de riesgos y de far-
macovigilancia adecuado, posterior a la comercializa-
ción. Esto aplica, no sólo a los biosimilares, sino a to-
do fármaco biotecnológico nuevo que sale al merca-
do, así como a cualquier producto biológico ya co-
 el farmacéutico y el uSo racional de loS ProductoS BiológicoS teraPéuticoS
mercializado, para el cual se modifique el proceso de
producción e incluso de envasado. Estas son las exi-
gencias de la EMa en materia de medicamentos bio-
tecnológicos.
aHorroS PoTEnCiaLES En EL USo DE bioSiMiLarES
actualmente, los precios de los biosimilares se
encuentran alrededor de 20-30% por debajo del pre-
cio del producto original. Un aumento en la compe-
tencia del mercado podría conducir a reducciones
adicionales, pero debido a los costos de producción y
control de los biotecnológicos, es poco probable que
las grandes diferencias de precio encontradas en los
productos genéricos de fármacos de síntesis química
sean alcanzadas.
inTErCaMbio Y SUSTiTUCión DE LoS ProDUCToS
bioTECnoLóGiCoS
Un punto de discusión interesante es lo relativo
al intercambio y sustitución de los productos biotec-
nológicos. Debido a que la tecnología actual no per-
mite una comparación precisa de productos biotec-
nológicos complejos, no existen datos que apoyen la
seguridad de la sustitución de este tipo de produc-
tos. De esta manera, el tema debe ser abordado con
precaución.
El concepto de «sustitución» se refiere a una políti-
ca nacional que permita dispensar a un paciente un
producto diferente al que le ha recetado su médico
tratante, siempre y cuando éste tenga la misma cali-
dad, seguridad y eficacia. La sustitución se produce
normalmente en la farmacia.
Las políticas de sustitución son específicas de ca-
da país. En algunos países está completamente prohi-
bida la sustitución de cualquier producto biológico.
Es el caso de Francia, alemania, los Países bajos, no-
ruega y Suecia entre otros. También en España, la or-
den SCo/2874/2007 del 28 de septiembre, que con-
tiene la lista de los medicamentos no sustituibles en
la dispensación por las oficinas de farmacia, incluye a
los medicamentos biotecnológicos.
La sustitución entre productos biológicos puede
tener consecuencias clínicas para el paciente y puede
causar problemas de salud. además, la sustitución
automática de estos productos dificulta el monitoreo
de los perfiles de seguridad de los diferentes produc-
tos. Por ejemplo, a causa de una sustitución automá-
tica, un paciente podría recibir una marca de produc-
to diferente al que ha recibido previamente, sin el co-
nocimiento o el consentimiento del paciente o de su
médico.
En Venezuela la Ley de Medicamentos en su ar -
tículo 40 establece que cuando no se disponga del
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
medicamento prescrito, el farmacéutico, previa con-
sulta al prescriptor e información al paciente, puede
sustituir el medicamento por otro que posea igual
composición, forma farmacéutica y dosificación, de
acuerdo al listado que el Ministerio de Salud y Desarro-
llo Social haya publicado a tal efecto. Por otra parte, el
prescriptor, cuando así lo dicte su juicio profesional,
podrá colocar en el récipe la palabra «insustituible» al
medicamento que así lo considerare (república boli-
variana de Venezuela; 2000).
DEnoMinaCión DE LoS ProDUCToS bioTECnoLóGiCoS
Es importante cuidar muy bien el detalle de la de-
nominación de productos provenientes de diferentes
fabricantes a fin de evitar sustituciones involuntarias
con posibles consecuencias para los pacientes. Se ha
propuesto que cada producto tenga una Denomina-
ción Común internacional (DCi) única y un nombre de
marca único para reducir el riesgo de sustituciones
inapropiadas. Es probable que, en el caso de una sus-
titución automática que traiga como consecuencia un
evento adverso, la trazabilidad del producto involu-
crado sea muy difícil. De igual manera, los argumen-
tos acerca de la trazabilidad de los productos biosi-
milares son extensibles a todos los medicamentos
biológicos.
ConCLUSionES iMPorTanTES SobrE EL FarMaCéUTiCo
Y EL USo DE LoS ProDUCToS bioTEraPéUTiCoS
El farmacéutico es el profesional que tiene como
responsabilidad el uso racional de los medicamentos,
para lo cual debe identificar, prevenir y resolver los
problemas relacionados con la farmacoterapia de sus
pacientes. Esto le permitirá evaluar cada uno de los
medicamentos que el paciente usa y determinar si un
producto es indicado, efectivo, seguro y conveniente
para ese paciente. Como se ha señalado, esta respon-
sabilidad comprende todos y cada uno de los medica-
mentos que el paciente usa, pero es aún mayor con
los productos bioterapéuticos. Debido a la compleji-
dad de estos productos, existen múltiples elementos
que el farmacéutico debe tener en cuenta cuando
presta asesoramiento para la compra, prescripción o
utilización de estos productos.
adicionalmente, el farmacéutico juega un papel
importante en el suministro de información relaciona-
da con los perfiles del paciente y con la exposición al
fármaco, a través de la participación en programas de
farmacovigilancia y en el reporte de eventos adversos
(Krämer y Vulto, 2008). También tiene la responsabili-
dad de garantizar que el producto originalmente pres-
crito sea dispensado al paciente hasta que el trata-
miento sea completado.
27
 magaly Pedrique de aulacio
Los farmacéuticos pueden hacer contribuciones
valiosas al plan de manejo de riesgos y de farmacovi-
gilancia, ya que ellos están involucrados en la selec-
ción, el almacenamiento y la distribución de los pro-
ductos dentro de la institución, y están en capacidad
de dar información acerca de la exposición de los pa-
cientes a estos productos. Tal información puede ayu-
dar a colocar los eventos adversos en contexto y a
complementar los datos limitados provenientes de
los ensayos clínicos, los cuales con frecuencia apor-
tan la información mínima necesaria para la autoriza-
ción de los productos.
Los fabricantes son responsables del almacena-
miento correcto de los productos, desde su produc-
ción hasta que llegan a su destino. Es imprescindible
disponer de sistemas que garanticen que las condicio-
nes requeridas sean mantenidas durante el trasporte.
Luego, dentro del hospital o de la farmacia, el farma-
céutico es el responsable del correcto almacenamien-
to y transporte de los productos biotecnológicos y del
asesoramiento a los pacientes para su uso adecuado
(Fernández y col., 2009).
Las decisiones para la inclusión de un producto,
en particular en el formulario de un hospital, no de -
ben estar únicamente fundamentadas en considera-
ciones de tipo económico. éstas deben tomar en
cuenta las evidencias disponibles de calidad, seguri-
dad y eficacia, por lo cual la formación y experiencia
del farmacéutico tienen un gran valor. En este aspec-
to, Krämer y Vulto (2008) proporcionan un lista de co-
tejo que recomendamos consultar como apoyo para
la toma de tales decisiones.
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recibido: 6 de abril de 2012
aceptado: 25 de abril de 2012
 determinación y confirmación de residuos
de tetraciclinas en muslo e hígado de pollos, por
cromatografía líquida de alta resolución (hplc)
detection and confirmation of tetracyclines residues in chicken
thigh and liver, by high resolution liquid chromatography

MAriSol góMez1*; AgriciA quintAnA de g2

resumen
Para la determinación de la presencia de residuos de oxitetraciclina (oTC), Tetraciclina (TTC) y Clortetraciclina (CTC) en
el muslo e hígado de pollos, por Cromatografía Líquida de alta resolución (HPLC) en Fase reversa con Detección
Ultravioleta, se utilizó el método analítico publicado por la aoaC y validado para las condiciones de trabajo en el labo-
ratorio, tomando en consideración los parámetros fijados por la organización de las naciones Unidas para la
agricultura y la alimentación (Fao). Se emplearon dos columnas cromatográficas: Spherisorb® C8, y Sun FireTM C18. Se
obtuvo linealidad en el rango de concentraciones estudiado en ambas columnas con coeficientes de correlación
>0,99. Los porcentajes de recuperación obtenidos correspondientes al muslo de pollo fueron oTC: 80,70% - 82,28%,
DEr promedio 7,40%; TTC: 80,61% - 83,14%, DEr promedio 5,95%; CTC: 75,91% - 82,95%, DEr promedio 8,18%,
respectivamente; y para el hígado de pollo oTC: 81,38% - 91,66%, DEr promedio 7,79%; TTC: 80,72% - 90,20%, DEr
promedio 6,50%; CTC: 76,16% - 84,75%, DEr promedio 7,79%, respectivamente. Los límites de detección y cuantifi-
cación obtenidos en ambas columnas para oTC, TTC y CTC fueron los adecuados para detectar las cantidades máxi-
mas de estos residuos de antibióticos aceptados (LMr) en dichas muestras (200 µg/kg y 600 µg/kg para el muslo e
hígado de pollo, respectivamente). De las 46 muestras analizadas de muslo e hígado de pollo, sólo 23 resultaron sos-
pechosas a la presencia de oTC, TTC y CTC, al confirmar estos resultados se encontró que los picos observados no
correspondían a la presencia de ninguna de las tres tetraciclinas estudiadas.

palabras clave: oxitetraciclina, Tetraciclina, Clortetraciclina, muslo e hígado de pollo, HPLC.

Abstract
residues of oxytetracycline (oTC), tetracycline (TTC) and chlortetracycline (CTC) in chicken thigh and liver samples were
assessed by a method published by the aoaC by reverse phase High Performance Liquid Chromatography (HPLC) with
ultraviolet detection, previously validated for working conditions in the laboratory. Parameters set by the organization
of the United nations Food and agriculture (Fao) was taking into account. Two chromatographic columns were used:
Spherisorb® C8, and Sun FireTM C18. Linearity was obtained in the concentration range studied in both columns with corre-
lation coefficients > 0.99. recovery rates obtained for the chicken thigh were oTC: 80.70% - 82.28%, average rSD
7.40%; TTC: 80.61% - 83.14%, average rSD 5.95%, CTC: 75.91% - 82.95%, average rSD 8.18%, respectively, and chic-
ken liver oTC: 81.38% - 91.66%, average rSD 7.79%; TTC: 80.72% - 90.20%, average rSD 6.50%; CTC: 76.16% -
84.75%, average rSD 7.79%, respectively. The detection and quantification limits obtained in both columns for oTC,
TTC and CTC were adequate to detect the maximum reference limits (MrLs) for these antibiotic residues in these sam-
ples (200 µg/kg and 600 µg/kg for chicken thigh and liver, respectively). of the 46 samples of chicken thigh and liver
analyzed, only 23 were suspicious of the presence of oTC, TTC and CTC. nevertheless, it was found that the observed
peaks did not correspond to the presence of any of the three tetracyclines studied when confirmation studies were run.

Key words: oxytetracycline, Tetracycline, Chlortetracycline, chicken thigh and liver, HPLC.

1 Cátedra de análisis Farmacéutico.

2 Laboratorio de análisis instrumental. Facultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.
* Marisol Gómez. Email: mgomezfernandez@hotmail.com

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 29

 mariSol gómez y agricia quintana de g
introducción
Las tetraciclinas constituyen un grupo de fárma-
cos, unos naturales (extraídas de hongos del género
actinomices) y otros semisintéticos, con actividad
frente a una gran diversidad de microorganismos. quí-
micamente estos compuestos están formados por la
fusión de cuatro anillos bencénicos con diversos susti-
tuyentes (derivados análogos de la naftacenocarboxa-
mida policíclica) (Figura 1).
congéneres Sustitutos posición (es)
Clortetraciclina -Cl (7)
oxitetraciclina -oH, -H (5)
Demeclociclina -oH, -H; -Cl (6;7)
Metaciclina -oH, -H; =CH2 (5;6)
Doxiciclina -oH, -H; -CH3, -H (5;6)
Minociclina -H, -H; -n(CH3)2 (6;7)
Figura 1. Fórmula estructural de las tetraciclinas (chambers,
2007).
Se emplean de rutina en la medicina veterinaria
para la prevención y el control de las enfermedades.
Se utilizan con fines profilácticos en los animales, ya
que, ha sido demostrada su importancia en la preven-
ción de una infección, por ejemplo en los ciclos inicia-
les de crecimiento de los animales especialmente en
aquellos más sensibles a agentes infecciosos.
En las aves se utilizan con los siguientes propósi-
tos: a) atacar en la fase aguda en algún brote infeccio-
so, considerado empíricamente el agente etiológico;
b) prevenir la asociación bacteriana ante un problema
viral, si se conoce una etapa de inmunodepresión de -
terminada mediante seroperfiles y pruebas específi-
cas; y, c) aplicar de una manera metafiláctica, basán-
dose en el conocimiento de las condiciones de salud
de la parvada y en el incremento de la severidad de
las lesiones de las aves que mueren a diario (Tanner,
1993; Puyt, 1995).
Del mismo modo, las tetraciclinas se utilizan como
aditivo a niveles subterapéuticos a los alimentos para
30
los animales a fin de facilitar su crecimiento, permi-
tiendo de esta manera el desarrollo acelerado de los
animales domésticos con el beneficio de los criadores
(oka y col., 1991; Cancho y col., 2000; Chopra y ro-
berts, 2001; Michalova y col., 2004; Martindale, 2005;
Cerniglia y Kotarski, 2005; Stolker y brinkman, 2005;
Doyle, 2006; Chambers, 2007). Sin embargo, en 1997
la organización Mundial de la Salud (oMS) recomendó
prohibir el uso de antibióticos para promover el creci-
miento de los animales.
Si bien es cierto que la utilización de los antibióti-
cos continúa siendo la forma más efectiva para el tra-
tamiento de las diversas enfermedades bacterianas
causadas por microorganismos patógenos, éstos y
particularmente las tetraciclinas, pueden permanecer
como residuos químicos en los animales y los produc-
tos derivados de los mismos, que pueden ser tóxicos
per se o causar reacciones alérgicas en los pacientes
más sensibles; incluso más importante aún, los nive-
les bajos de las dosis de estos antibióticos en los ali-
mentos consumidos por largos períodos de tiempo
pueden conducir a problemas con respecto a la proli-
feración de microorganismos resistentes a dichos fár-
macos (Cinquina y col., 2007). Teniendo en cuenta
que un residuo de cualquier medicamento de uso ve-
terinario, en general, son sustancias farmacológica-
mente activas (ya sean activos, excipientes o bien pro-
ductos de degradación y metabolitos) que permane-
cen en los productos alimenticios obtenidos a partir
de los animales a los que se les ha administrado el
medicamento (Cancho y col., 2000; Codex alimenta-
rius, 2003).
La localización de estos residuos es variable, el
tejido muscular y la grasa son los lugares preferentes,
aunque también se han identificado en los tejidos me-
nos consumidos como lo son el hígado o el riñón. La
toxicidad de estos residuos varía desde la inocuidad
hasta presentar consecuencias clínicas, hematológi-
cas, bioquímicas, anatomopatológicas o incluso la
muerte (Cancho y col., 2000).
El Límite Máximo para residuos de Medicamentos
Veterinarios (LMrMV) o también llamado Límite Máxi-
mo de residuos (LMr) se define como aquella concen-
tración de residuos resultante del uso de un medica-
mento veterinario (expresada en mg/kg o µg/kg sobre
la base del peso fresco) que la Comisión del Codex
alimentarius recomienda que se permita legalmente o
se reconozca como admisible dentro de un alimento o
en la superficie del mismo (Codex alimentarius, 2003).
Cuando se establece un LMr, también se tiene en
cuenta los residuos presentes en los alimentos de ori-
gen vegetal y/o en el medio ambiente. además, el LMr
puede reducirse para ajustarse a las buenas prácticas
 determinación y confirmación de reSiduoS de tetraciclinaS en muSlo e hígado de PolloS, Por cromatografía líquida de alta reSolución (hPlc)
para el uso de los medicamentos veterinarios, y en la
medida en que se disponga de métodos prácticos de
análisis (Codex alimentarius, 2003).
Los LMr se fijan para cada especie animal y para
cada tejido (músculos, hígado, riñones, grasa, leche,
miel y huevos). De este modo, el valor del LMr de toda
sustancia farmacológicamente activa quedará fijado
como una pareja compuesta por un residuo marcador
y el tejido correspondiente para cada especie animal
productora del alimento.
Para garantizar que la concentración residual de
los antibióticos no sea superior a su correspondiente
LMr, es necesario establecer un tiempo de espera. Es-
te tiempo de espera es el lapso de tiempo que debe
transcurrir, y ser respetado, desde el último tratamien-
to farmacológico hasta el sacrificio de los animales
para poder consumir la carne o recoger sus productos
(leche, huevos) para su comercialización. Estos tiem-
pos se determinan en función del perfil cinético de la
eliminación tisular de los fármacos (inalterado y/o me-
tabolitos) en los animales. Cada antibiótico debe ir
acompañado de un prospecto en donde conste el va-
lor del tiempo de espera (Cancho y col., 2000; Cerni-
glia y Kotarski, 2005; quintana y col., 2009).
En Venezuela, se asume como LMr para las tetra-
ciclinas en los pollos, los establecidos por el Comité
Mixto Fao/oMS de Expertos en aditivos alimentarios
(jECFa) y el Comité del Codex sobre residuos de Me-
dicamentos Veterinarios en los alimentos (CCrVDF)
como limites máximos aceptados para residuos de
medicamentos en los alimentos (Codex alimentarius,
2008). En su reunión 45 del año 1995, se estableció
como LMr para las tetraciclinas 600 µg/kg para el
hígado de pollo y 200 µg/kg para el músculo de pollo.
Para la identificación y cuantificación de los resi-
duos de los medicamentos veterinarios en los alimen-
tos, en el caso específico de las tetraciclinas, se han
empleado diversos métodos inmunológicos, microbio-
lógicos y fisicoquímicos. Debido a que los métodos
inmunológicos y microbiológicos no pueden identifi-
car con certeza todas las tetraciclinas, Macneil y col.
(aoaC, 1996) desarrollaron una técnica de análisis
que permite separar, detectar y confirmar la presencia
o la ausencia de las tetraciclinas en las muestras de
origen animal. Dicho método consiste en la extracción
de las tetraciclinas presentes en el tejido animal por el
empleo de un buffer, elución a través de un cartucho
de extracción de fase sólida y el posterior análisis por
cromatografía líquida de alta resolución con detección
ultravioleta. Este método analítico presenta la ventaja
de la separación, detección y cuantificación de varias
tetraciclinas simultáneamente, en diferentes tejidos
animales, siendo al mismo tiempo útil para la detec-
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
ción de residuos de fármacos, pues utiliza una colum-
na de confirmación que permite descartar la presen-
cia de cualquier pico sospechoso.
En el presente trabajo se propone revalidar dicho
método. Una revalidación, se hace necesaria cuando
han sido previamente validados los métodos, pero se
deben volver a evaluar debido a las posibles variacio-
nes que se puedan presentar en aspectos como el ins-
trumental (cambio de equipo o de alguno de sus com-
ponentes, del tipo u origen de la columna), la matriz
que contiene la muestra o de la proporción relativa del
analito (quattrocchi y col., 1992).
Materiales y métodos
a) Cromatógrafo Líquido de alta resolución (HPLC)
marca Waters, compuesto por: inyector rheodyne
con un loop de 100 µL, bomba de distribución de
solventes modelo 510, detector UV modelo 484 y
módulo de datos modelo 745b.
b) Columnas Cromatográficas: (1) Para la determina-
ción de las tetraciclinas, se empleó la columna cro-
matográfica Spherisorb® C8 4,6 x 250 mm y 5 µm.
(2) Para la confirmación de los resultados cuantita-
tivos de las tetraciclinas, se empleó la columna cro-
matográfica Sun FireTM C18 4,6 x 250 mm y 5 µm.
c) Manifold Waters SPE de extracción fase sólida 20
puestos con rack para tubos de ensayo (16 x 100)
mm, con bloque de vacío con 10 -12 puertos, agu-
jas de vacío y reservorios de 75 mL; balanza analíti-
ca Mettler modelo H315, sensibilidad 0,0010g; ba -
ño Ultrasonido Marca Cole-Parmer, modelo 8892;
cartucho de filtración 13 mm id. 0,45 µm con Luer-
lock (para filtrar las muestras); cartuchos SEP-PaK®
Vac 6cc (500 mg) C18; centrífuga PLC Series, mode-
lo PLC-05; electrodo de vidrio de combinación,
Marca Sensorex®; equipo de Filtración Millipore®,
filtros Millipore tipo Ha 0,45 μm; filtro Microfibra de
vidrio grado Gb140 1.0 micras, diámetro 47 mm,
Marca advantec®; homogenizador equipado con
cuchillas de cortar para desintegrar y homogenizar
el tejido animal; Vortex marca Thermolyne modelo
37600 Maxi Mix ii; potenciómetro Marca orion®,
Modelo 420ª.
rEaCTiVoS
acetonitrilo y Metanol grado HPLC marca j. T. ba-
ker. Ácido cítrico monohidratado, Ácido etilendiamino-
tetraacético disódico (EDTa) (iDranaL® iii), Ácido oxá-
lico dihidrato, grado reactivo marca riedel-De Haën
aG; Seelze-Hannover. Dimetil Sulfóxido (DMSo), grado
reactivo, marca Sigma. Fosfato de sodio dibásico anhi-
dro, grado reactivo marca Mallinckrodt ar®. Patrón de
31
 mariSol gómez y agricia quintana de g
cloruro de clortetraciclina, pureza 78% HPLC; cloruro
de oxitetraciclina, mínimo 95% HPLC; cloruro de te-
traciclina, mínimo 95%, marca Sigma-aldrich. Ácido
Clorhídrico 0,1 M. Hidróxido de Sodio 0,1 M.
PrEParaCión DE LaS SoLUCionES
1. buffer Mcilvaine a pH 4,00: Pesar 28,4 g de
na2HPo4 y transferirlo a un cilindro graduado de 1 litro
(L), disolver con agua destilada y completar a volu-
men. Pesar 21,0 g de ácido cítrico monohidrato y
transferirlo a un cilindro graduado de 1L, disolver con
agua destilada y completar a volumen. Combinar 1 L
de la solución de ácido cítrico monohidrato y 625 mL
de la solución de na2HPo4, en una fiola de 2 L. ajustar
a pH 4,00 ± 0,05 con HCl 0,1M o naoH 0,1M. Preparar
semanalmente.
2. Solución buffer Mcilvaine-EDTa: ajustar el buf-
fer Mcilvaine de forma de contener 0,1 M del ácido
etilendiaminotetraacético disódico (EDTa) como sigue:
a 1,625 L del buffer Mcilvaine, añadir 60,5 g de EDTa
y mezclar hasta disolver el sólido. Preparar semanal-
mente.
3. Solución metanólica de ácido oxálico: al 1,26
g/L. Preparar diariamente.
4. Solución acuosa de ácido oxálico: al 1,26 g/L
PrEParaCión DE LaS SoLUCionES PaTronES
1. Solución madre de cada uno de los antibióticos
a una concentración final de 1000 µg/mL en metanol.
almacenar las soluciones a -20ºC. Preparar la solución
cada tres meses.
2. Solución intermedia: mezcla de los patrones, a
una concentración final de 100 µg/mL en metanol.
3. Solución de trabajo mezcla de los patrones a la
concentración final de 25 µg/mL en metanol para ca-
da una de las tetraciclinas. Preparar semanalmente.
ConDiCionES CroMaToGrÁFiCaS
Para la determinación de las tetraciclinas se utilizó
la columna cromatográfica Spherisorb® C8. La fase
móvil consiste de una mezcla de ácido oxálico dihidra-
tado 1,26‰, acetonitrilo y metanol (600:200:200).
Filtrada y desgasificada al vacío. Velocidad de flujo de
1,2 mL/min; a 350 nm y volumen de inyección 100µL.
Para la confirmación de las tetraciclinas se empleó
la columna cromatográfica Sun FireTM C18. La fase mó -
vil consistió de una mezcla de ácido oxálico dihidrata-
do 1,26‰, acetonitrilo y metanol (800:100:100).
Filtrada y desgasificada al vacío. Velocidad de flujo de
1,4 mL/min; a 350 nm y volumen de inyección 100µL.
32
aConDiCionaMiEnTo DE LoS CarTUCHoS SEP-PaK®
Los cartuchos SEP-PaK® deben proporcionar una
recuperación ≥ 80% de cada una de las tetraciclinas
(oTC, TTC y CTC), utilizando las condiciones de elu-
ción especificadas en el método. Cuando el método
se utiliza de rutina es necesario correr muestras de
recuperación para cada corrida (Macneil y col., 1996).
Todos los cartuchos empleados en este trabajo se
acondicionaron justo antes del paso de la muestra a
través de los mismos, colocando un juego de cartu-
chos en el Manifold y con la ayuda del vacío se pasaron
10 mL de metanol seguido de 10 mL de agua desioni-
zada, lentamente, descartando el eluado y evitando de
este modo que el cartucho se seque.
PrEParaCión DE La MUESTra
Se siguió la metodología descrita por Macneil y
col. (1996), con algunas modificaciones. Se analiza-
ron 20 muestras de muslo y 20 de hígado de pollo se-
leccionadas al azar de diferentes puntos de venta del
área de la Gran Caracas (Supermercados, Mercados
populares y abastos del Este de Caracas, del oeste de
Caracas, de Guarenas) y 4 muestras de muslo de pollo
y 2 de hígado de pollo suministradas por la Facultad
de Ciencias Veterinarias Universidad Central de Vene-
zuela, Maracay - Estado aragua, correspondientes a
pollos de 8 semanas de nacido alimentados con ini-
ciador y criados en las instalaciones de la Facultad,
asegurando la no presencia de Tetraciclinas, estas
muestras se tomaron como control o blanco. Las
muestras fueron sometidas a molienda con un homo-
geneizador y permanecieron congeladas hasta el
momento del análisis. El proceso de extracción se
completó en un día (Macneil y col., 1996),
Se pesaron 3,00 ± 0,05 g del tejido a ser analizado,
en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 mL de
capacidad; en otro tubo de centrífuga, fue pesada la
misma cantidad del tejido control al cual se le añadió
cantidades adecuadas de la solución de trabajo mezcla
de los patrones (25 µg/mL), de acuerdo a la concentra-
ción que se desea preparar de oTC, TTC y CTC para su
posterior análisis. a cada tubo le fue añadido 10 mL
del buffer Mcilvaine-solución EDTa, se agitaron en un
vortex por 30 segundos y centrifugaron a 8000 rpm
por 10 min.
Luego se trasvasó el líquido sobrenadante a otros
dos tubos de centrífuga de 15 mL con tapa, cuidando
de no transferir ningún tejido; centrifugando a 8000
rpm por 10 min.
Seguidamente, se procedió a la filtración del líqui-
do sobrenadante de cada tubo a través de un filtro de
vidrio poroso GF/b, previamente humedecido con
 determinación y confirmación de reSiduoS de tetraciclinaS en muSlo e hígado de PolloS, Por cromatografía líquida de alta reSolución (hPlc)
2 mL del buffer Mcilvaine-solución EDTa, aplicando
vacío; esta operación fue realizada lentamente.
El residuo remanente en los tubos, se sometió a
una segunda extracción con 10 mL del buffer Mcilvai-
ne-solución EDTa; se agitaron en un vortex por 30
segundos y centrifugaron a 8000 rpm por 10 min. El lí-
quido sobrenadante fue transferido a otro tubo de
centrífuga y se siguió el procedimiento descrito con
anterioridad.
Este proceso fue realizado dos veces más. Una
vez concluido el proceso de extracción se lavó dos ve-
ces el tubo de centrífuga con 2 mL del buffer Mcilvai-
ne-solución EDTa y posteriormente se procedió a la
filtración.
En dos cartuchos Sep-pak previamente acondicio-
nados, colocados en el Manifold se procedió a transfe-
rir todo el filtrado, lavando muy bien las paredes de la
fiola con el empleo de 10 mL de la solución Mcilvaine
buffer-solución de EDTa en porciones de 5 mL cada
una; y con 20 mL de agua desionizada en porciones
de 5 mL, de manera de garantizar la transferencia
completa de los extractos al cartucho. Esta operación
fue realizada lentamente, evitando que el cartucho se
seque, aplicando vacío de manera constante durante
todo el proceso. Una vez concluida la filtración se
pasó una corriente de aire por espacio de 2 minutos
con la finalidad de secar bien el cartucho. Las tetraci-
clinas fueron eluídas del cartucho con 3 mL de la solu-
ción metanólica de ácido oxálico al 1,26‰ p/v, reci-
biendo el filtrado en viales de 10 mL. Este procedi-
miento se llevó a cabo aplicando vacío de manera
constante a una velocidad de filtración lenta, ya que,
esta solución pasa más rápido que la solución acuosa.
Una vez eluída toda la solución metanólica, se aumen-
tó la velocidad del vacío por un máximo de 10 segun-
dos para eliminar todo el solvente del cartucho. Con-
cluido el proceso, fueron retirados los viales, se adi-
cionaron 2 mL de agua desionizada y agitaron en un
vortex por 30 segundos.
Una alícuota de 100 µL de cada una de estas so -
luciones previamente filtradas por membrana de
0,45µm, se inyectó en el cromatógrafo líquido a las
condiciones cromatográficas mencionadas anterior-
mente de acuerdo a la columna a utilizar.
SoLUCionES ESTÁnDar
Diariamente se prepararon las soluciones de tra -
bajo de mezcla de patrones a las concentraciones
finales de 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 y 1,00 µg/mL a partir
de la solución de 25 µg/mL.
PrECiSión DEL SiSTEMa
Para la determinación de la precisión del sistema,
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
bajo condiciones de repetibilidad, se realizaron seis
inyecciones consecutivas de la concentración 0,25
µg/mL de las soluciones estándar, en la columna
Spherisorb® C8.
ExaCTiTUD
Los porcentajes de recuperación correspondiente
a las 3 tetraciclinas, en el tejido analizado se realizó pa-
ra las concentraciones de 0,166; 0,416 y 0,833 µg/g
de oTC, TTC y CTC respectivamente; estas soluciones
fueron preparadas de la manera siguiente: En 4 tubos
de centrífuga de 15 mL, se pesaron 3,00 ± 0,05 g del
tejido muestra a analizar y del tejido control (muslo o
hígado). a cada uno de los tubos de muestra con ex-
cepción del tubo control se agregaron 20 µL, 50 µL y
100 µL de la solución de trabajo mezcla de los 3 patro-
nes de concentración final 25 µg/mL, (lo que corres-
ponde a 0,166 0,416 y 0,833 µg/g, de cada tetracicli-
na). Cada tubo fue agitado en el vortex durante 30 se -
gundos y posteriormente se procedió según el método
de preparación de la muestra e inyección en el croma-
tógrafo líquido previamente descrito.
El porcentaje de recuperación de oTC, TTC y CTC
se calculó por comparación de estos cromatogramas
con los obtenidos por la inyección de las soluciones es-
tándar preparadas a concentraciones similares, pero
que no fueron sometidas al proceso de extracción.
LÍMiTE DE DETECCión Y LÍMiTE DE CUanTiFiCaCión
Se determinaron de manera matemática emplean-
do las siguientes fórmulas:
límite de detección =
límite de cuantificación =
Dónde,
Ybl= respuesta del blanco
Sbl= Desviación estándar del blanco
b= pendiente de la curva de calibración
n’= número de determinaciones
ConFirMaCión DE LoS rESULTaDoS CUanTiTaTiVoS
Las muestras de muslo e hígado de pollo en las que
se aprecia la presencia de residuos de cualquiera de
33
 mariSol gómez y agricia quintana de g

las tres tetraciclinas estudiadas, deberán ser prepara-

Curva de calibración de Oxitetraciclina
das e inyectadas de nuevo en la columna de confirma-
ción siguiendo la metodología ya descrita, y los resul-
tados se compararán con la solución de trabajo mezcla

Altura
de los patrones a la concentración de 0,25 µg/mL para
asegurarse de que los tiempos de retención de la
muestra son los correspondientes al estándar combi-
nado, y de este modo descartar o confirmar la presen-
cia de dichos residuos en las muestras analizadas.
Concentración (µg/mL)

resultados y discusión
Curva de calibración de Tetraciclina
En la figura 2 puede apreciarse un cromatograma
típico de los estándares de las 3 tetraciclinas, utilizan-
do la columna Spherisorb® C8 y la columna Sun FireTM

Altura
C18 bajo las condiciones de análisis, en el que puede
detallarse que los analitos se separaron completa-
mente en picos simétricos en 15 y 22 min, respec-
tivamente.

Concentración (µg/mL)

Curva de calibración de Clortetraciclina

Respuesta (Absorbancia)

Respuesta (Absorbancia)

Altura

Concentración (ppm)

Figura 3. curva de calibración del estándar de oxitetraciclina,

tetraciclina y clortetraciclina en la columna analítica Spheri-
sorb® c8. rango de concentraciones de 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 y
Tiempo (minutos) Tiempo (minutos)
1,00 µg/ml.
A B

Figura 2. cromatograma correspondiente a la inyección de la

solución de trabajo combinada de los patrones otc, ttc, ctc en el cromatógrafo líquido, de forma aleatoria. Este
a una concentración final de 0,25 µg/ml de cada tetraciclina. procedimiento fue hecho tres veces en días diferen-
A) columna Spherisorb® c8. Fase móvil constituida por una
mezcla de ácido oxálico dihidratado 1,26‰, acetonitrilo y
tes, incluyendo la preparación de las soluciones están-
metanol (600:200:200). velocidad de flujo 1,2 ml/min. vo- dar. Podemos decir que el método analítico tiene li-
lumen de inyección 100 µl. longitud de onda de detección nealidad en el rango de concentraciones estudiado,
350 nm. AuFS: 0,005. B) columna Sun FiretM c18. Fase móvil
constituida por una mezcla de ácido oxálico dihidratado con un coeficiente de regresión lineal (r) > 0,99.
1,26‰, acetonitrilo y metanol (800:100:100). velocidad de
flujo 1,4 ml/min. volumen de inyección 100 µl. longitud de
onda de detección 350 nm. AuFS: 0,005. PrECiSión DEL SiSTEMa

Los resultados correspondientes a la precisión del

LinEaLiDaD DEL MéToDo
Para determinar la linealidad del método se cons-
truyó una curva de calibración para cada tetraciclina
tanto en la columna analítica (C8) como en la columna
de confirmación (C18), en el rango de concentraciones
de 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 y 1,00 µg/mL (Figuras 3 y 4).
Todas las soluciones fueron inyectadas por triplicado
sistema, en condiciones de repetibilidad (precisión in-
tranalítica), se basaron en la variación de las alturas y
el tiempo de retención para cada una de las tres tetraci-
clinas (Tabla i), obteniéndose una desviación estándar
relativa inferior al 2%, por lo que podemos decir que el
método es preciso de acuerdo con lo establecido por la
Farmacopea de los Estados de Unidos (USP 32).

34
 determinación y confirmación de reSiduoS de tetraciclinaS en muSlo e hígado de PolloS, Por cromatografía líquida de alta reSolución (hPlc)

ExaCTiTUD
Curva de calibración de Oxitetraciclina
Los cromatogramas típicos se observan en la fi-
gura 5. De igual manera, la figura 6 representa los cro-
matogramas correspondientes a una muestra de mus-
Altura

lo e hígado de pollo control suministrado por la Facul-

tad de Ciencias Veterinarias de la UCV.

Concentración (µg/mL)

Curva de calibración de Tetraciclina

Altura

Respuesta (Absorbancia)

Respuesta (Absorbancia)
Concentración (µg/mL)

Curva de calibración de Clortetraciclina

Altura

Tiempo (minutos) Tiempo (minutos)

A B
Concentración (µg/mL)
Figura 5. A) cromatograma correspondiente a la inyección de
Figura 4. curva de calibración del estándar de oxitetraciclina, una muestra de hígado de pollo con el añadido de la solución
tetraciclina y clortetraciclina en la columna analítica Sun de trabajo combinada de los patrones a una concentración
FiretM c18. rango de concentraciones de 0,05, 0,10, 0,25, 0,50 final de 0,416 µg/g. B) cromatograma correspondiente a la
y 1,00 µg/ml. inyección de una muestra de muslo de pollo con el añadido de
la solución de trabajo combinada de los patrones a una con-
centración final de 0,416 µg/g.
para estos cromatogramas se empleó la columna Spherisorb®
Tabla i c8. Fase móvil constituida por una mezcla de ácido oxálico
resultados de la precisión del sistema para una dihidratado 1,26‰, acetonitrilo y metanol (600:200:200).
velocidad de flujo 1,2 ml/min. volumen de inyección 100 µl.
solución de trabajo combinada de los patrones otc,
longitud de onda de detección 350 nm. AuFS: 0,005.
ttc, ctc a una concentración final de 0,25 µg/ml.
columna Spherisorb® c8
otc ttc ctc Los porcentajes de recuperación obtenidos co-
inyección trb Altura trb Altura trb Altura rrespondientes a las muestras control de muslo e híga-
1 7,05 522 8,91 551 15,06 174 do de pollo, se detallan en la Tabla ii.
2 7,05 534 8,93 548 14,96 171 Los resultados de los porcentajes de recuperación
3 7,02 536 8,91 558 14,95 175 obtenidos para las tres tetraciclinas estudiadas, tanto
4 7,07 534 8,96 552 14,85 172 en el muslo como en el hígado de pollo, oscilan entre
5 7,08 536 8,95 552 14,88 175 75% y 92% respecto a la cantidad añadida de cada
una de las tetraciclinas, con valores de DEr promedio
6 7,06 534 8,93 555 14,75 172
inferiores al 15% que es el porcentaje máximo permi-
promedio 7,06 532,7 8,93 552,7 14,91 173,2
tido cuando la concentración del analito analizado es
dera 0,268 0,998 0,209 0,623 0,652 0,995 mayor o igual a 100 µg/kg (Codex alimentarius 1993);
a = Desviación estándar relativa puede decirse que el método analítico validado para
b = Tiempo de retención la determinación de los residuos de tetraciclinas en

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 35

 mariSol gómez y agricia quintana de g

asimismo, puede detallarse que existen porcen-

tajes de recuperación menores al 80%, coincidiendo
con los resultados reportados por Macneil y col.,
1996; quintana y col., (2009). Esto pudiera deberse
Respuesta (Absorbancia)

probablemente a los cartuchos utilizados en la ex-

Respuesta (Absorbancia)
tracción, por lo que Macneil y col., recomiendan en
su trabajo que, los cartuchos pueden ser empleados
cuando se obtienen recuperaciones reproducibles en
un rango de 60 – 100% con un DEr ≤ 10% (Macneil y
col., 1996); como es el caso.

LÍMiTE DE DETECCión Y CUanTiFiCaCión

Tiempo (minutos)
A B
Figura 6. A) cromatograma correspondiente a la inyección de
una muestra de muslo de pollo (de 8 semanas de nacido, ali-
mentado con iniciador en la Facultad de ciencias veterinarias,
ucv Maracay, estado Aragua). B) cromatograma correspon-
diente a la inyección de una muestra de hígado de pollo (de 8
semanas de nacido, alimentado con iniciador en la Facultad de
ciencias veterinarias, ucv Maracay, estado Aragua). para es-
tos cromatogramas se empleó la columna Spherisorb® c8. Fa-
se móvil constituida por una mezcla de ácido oxálico dihidra-
tado 1,26‰, acetonitrilo y metanol (600:200:200). velocidad
de flujo 1,2 ml/min. volumen de inyección 100 µl. longitud de
onda de detección
350 nm. AuFS: 0,005.
muslo e hígado de pollo es preciso y exacto, y se pue-
de utilizar en la determinación de concentraciones infe-
riores a los Límites Máximos residuales (LMr) permi-
tidos para cada una de las tetraciclinas estudiadas.
Los límites de detección para las distintas tetraci-
clinas oTC, TTC y CTC en la columna Spherisorb® C8
fueron 0,012; 0,016 y 0,031 µg/mL, y en la columna
Tiempo (minutos)
Sun FireTM C18, 0,017; 0,018 y 0,013 µg/mL, respecti-
vamente. Mientras que en la columna Spherisorb® C8
el límite de cuantificación para las tetraciclinas oTC,
TTC y CTC fue 0,014; 0,018 y 0,047 µg/mL, y en la
columna Sun FireTM C18, fue 0,037; 0,048 y 0,132
µg/mL, respectivamente.
ConFirMaCión DE LoS rESULTaDoS CUanTiTaTiVoS
Del total de las 24 y 22 muestras analizadas de
muslo e hígado de pollo en la columna analítica Sphe-
risorb® C8, sólo 3 de las primeras y 20 de las segundas
presentaron pico sospechoso que, por su tiempo de
retención se presumió fuera una de las tres tetracicli-
nas estudiadas (oTC, TTC, CTC).
En la figura 7 se observan los cromatogramas de
algunas de esas muestras sospechosas a la presencia
de tetraciclinas.

Tabla ii
recuperación Absoluta de las tetraciclinas en el muslo e hígado de pollo. columna Spherisob® c8
Muslo de pollo hígado de pollo
Fármaco, cantidad % promedio % promedio
número añadida (µg/g) de recuperación dera de recuperación dera
de muestras Absoluta (µg/g) Absoluta (µg/g)
otc (n= 5) 0,166 81,23 7,05 81,38 6,83
(n=10) 0,416 80,70 8,01 91,66 4,13
(n= 5) 0,833 82,28 7,94 83,10 7,78

ttc (n= 5) 0,166 80,77 2,58 80,72 2,08

(n= 10) 0,416 80,61 6,22 90,20 3,64
(n= 5) 0,833 83,14 8,01 85,05 7,85

ctc (n= 5) 0,166 75,91 7,30 76,16 6,12

(n= 10) 0,416 82,95 7,73 84,75 4,62
(n= 5) 0,833 77,64 7,08 76,48 8,48

a = Desviación estándar relativa.

36
 determinación y confirmación de reSiduoS de tetraciclinaS en muSlo e hígado de PolloS, Por cromatografía líquida de alta reSolución (hPlc)
Respuesta (Absorbancia)
Respuesta (Absorbancia)
Tiempo (minutos)
A B
Figura 7. A) cromatograma correspondiente a la inyección de
una muestra de muslo de pollo que presenta un pico sospe-
choso a un tiempo de retención de 8,63 minutos; B) cromato-
grama correspondiente a la inyección de una muestra de híga-
do de pollo que presenta un pico sospechoso a un tiempo de
retención de 8,60 minutos. para estos cromatogramas se em-
pleó la columna Spherisorb® c8. Fase móvil constituida por
una mezcla de ácido oxálico dihidratado 1,26‰, acetonitrilo
y metanol (600:200:200). velocidad de flujo 1,2 ml/min. vo-
lumen de inyección 100 µl. longitud de onda de detección
350 nm. AuFS: 0,005.
Para descartar la presencia de cualquiera de las
tres tetraciclinas analizadas en esas muestras sospe-
chosas, se utilizó la columna de confirmación Sun Fi-
re TM C 18. Las muestras se prepararon siguiendo la
metodología descrita en la sección de materiales y
métodos.
Los resultados obtenidos en la columna Sun FireTM
C18 confirman que dichos picos no corresponden a
ninguna de las tetraciclinas estudiadas, puesto que los
tiempos de retención no coinciden con los tiempos de
retención de las tres tetraciclinas, por lo que, puede in-
ferirse que los picos sospechosos corresponden a in-
terferencias co-eluentes presentes en el muslo e híga -
do de pollo, que no afectan el análisis y la detección
de las tetraciclinas (Figura 8).
conclusiones y recomendaciones
De acuerdo con los resultados obtenidos, en la va -
lidación del método de Macneil y col. (1996), se de-
mostró que es un método preciso, exacto, reproduci-
ble, sensible, lineal, ya que permite la determinación
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
Respuesta (Absorbancia)
Respuesta (Absorbancia)
Tiempo (minutos) Tiempo (minutos)
A B
Tiempo (minutos)
Figura 8. A) cromatograma correspondiente a la confirmación
de una muestra de muslo de pollo que presenta un pico a un
tiempo de retención de 14,14 minutos, que no corresponden a
ninguna de las tres tetraciclinas; B) cromatograma correspon-
diente a la confirmación de una muestra de hígado de pollo
que presenta tres picos a los tiempos de retención 4,79, 5,50
y 10,28 minutos, que no corresponden a ninguna de las tres
tetraciclinas. para estos cromatogramas se empleó la colum-
na Sun FiretM c18. Fase móvil constituida por una mezcla de áci-
do oxálico dihidratado 1,26‰, acetonitrilo y metanol (800:
100:100). velocidad de flujo 1,4 ml/min. volumen de inyec-
ción 100 µl. longitud de onda de detección 350 nm. AuFS:
0,005.
de oxitetraciclina, Tetraciclina y Clortetraciclina en el
muslo e hígado de pollo, obteniéndose recuperacio-
nes superiores al 70% con DEr inferiores al 15%, por-
centaje máximo permitido cuando la concentración
del analito analizado es mayor o igual a 100 µg/kg (Co -
dex alimentarius, 1993). asimismo, este método per-
mite detectar la presencia de tetraciclinas a concentra-
ciones inferiores a los Límites Máximos residuales
permitidos para las tetraciclinas en el muslo de pollo
(LMr de 200 µg/kg) y en el hígado de pollo (LMr 600
µg/kg) (jECFa, 1998).
Se recomienda: 1) continuar con los análisis para
la detección de residuos de medicamentos en otros
tejidos de las diferentes especies animales que son
de alto consumo por parte de la población venezola-
na (por ejemplo leche de vaca, camarones, miel de
abeja, etcétera); y 2) instar a las entidades públicas y
privadas en Venezuela a mantener los controles so-
bre el uso de los medicamentos en los animales de
consumo humano regidas principalmente por el Co-
dex alimentarius, para de esa manera, conservar la
inocuidad y calidad de los alimentos, desde la produc-
ción primaria hasta el consumo.
37
 mariSol gómez y agricia quintana de g
Agradecimientos
Los autores agradecen al Consejo de Desarrollo
Científico y Humanístico de la Universidad Central de
Venezuela por el financiamiento de este Proyecto
CDCH nº Pi- 06-7515-2009/1. a la Profesora Sonia al-
varado de la Facultad de Ciencias Veterinarias-UCV
por su colaboración, por las muestras donadas y por el
material bibliográfico para este proyecto. al personal
del laboratorio de análisis instrumental, Facultad de
Farmacia, UCV.
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ponible en línea] Disponible en http://www.uspbpep.
com/search.asp
recibido: 17 de enero de 2012
aceptado: 12 de abril de 2012
 Modelado molecular y docking con la enzima
nqo1 de naftofuroquinonas antitumorales,
presentes en Tabebuia barbata
Molecular modeling and docking with the enzyme nqo1 from
antitumoral naphthoquinones present in tabebuia barbata

MilAgroS AvendAño*, trinA colMAn de SAizArBitoriA**

y MArySABel cordero troconiS

resumen
Tabebuia barbata (familia bignoniaceae), conocida como “Palo de arco” es autóctona del alto orinoco. En algunas es-
pecies de esta familia se han encontrado naftoquinonas con actividad antitumoral. El análisis fitoquímico de esta espe-
cie reveló la presencia de cinco naftofuroquinonas que presentaron potente actividad citotóxica sobre células tumora-
les tales como a-549 (pulmón), MCF-7 (mama) y HT-29 (colon), además de inhibir el transporte electrónico mitocon-
drial. a fin de entender y explicar la función biológica de las estructuras químicas en términos moleculares, se estudia-
ron descriptores lipofílicos y electrónicos tales como las energías del HoMo y LUMo, afinidad electrónica y Log P. Estos
parámetros fueron calculados para una serie de estructuras relacionadas utilizando nivel de teoría semiempírico (PM3)
y fueron comparados con la metodología del funcional de la densidad [funcional b88-LYP GGa y base 6-31G(d)]. Este
último método fue seleccionado para cálculos posteriores. a continuación se llevó a cabo un estudio de docking utili-
zando como blanco la enzima oxidorreductasa nqo1 dependiente de naD(P)H. Las citotoxicidades frente a líneas celu-
lares a-549 y MCF-7, de los compuestos (1-5) mostraron relación con la afinidad electrónica (energía del LUMo) y con
el ΔG de unión a nqo1. Finalmente, con ayuda del programa SYbYL® se postuló un modelo farmacofórico para naf-
tofuroquinonas citotóxicas inhibidoras de la nqo1.

palabras clave: naftofuroquinonas; descriptores electrónicos; actividad antitumoral; oxidorreductasa nqo1.

Abstract
Tabebuia barbata (bignoniaceae), known locally as “Palo de arco” is indigenous to the upper orinoco. Some related
species have given rise to a variety of naphthoquinones with antitumor activity. Phytochemical analyses of this specie
revealed the presence of five naphthofuroquinones that demonstrated potent cytotoxic activity against tumor cell cultu-
res such as a-549 (lung cancer), MCF-7 (breast cancer) and HT-29 (colon cancer); they also inhibit the mitochondrial
electronic transport. aiming to understand and explain the biological functions of chemical structures in molecular
terms, the electronic and lipophilic descriptors are studied, such as HoMo and LUMo’s energies, electronic affinity and
log P. These parameters were calculated for a serial of related structures. Semiempirical (PM3) calculation was compa-
red with the density functional methodology (b88-LYP GGa functional with the 6-31G(d) basis sets). The later was the
selected method for the remaining calculation. next, a docking study was performed using naD(P)H nqo1 oxidorre-
ductase enzyme as the selected target. The compounds (1 – 5) cytotoxic activity on a-549 and MCF-7 cell lines showed
relation with the electron affinity (LUMo’s energy) and also with the binding energy (ΔG) to nqo1. Finally with the aid of
the SYbYL® program a pharmacophore alignment was performed and a pharmacophore model was postulated for these
inhibitors of nqo1 cytotoxic naphthofuroquinones.

Key words: naphthofuroquinones, Electronic descriptors, antitumor activity, nqo1 oxidorreductase.

* milavend@yahoo.es
** trinaco@cantv.net
Laboratorio de Modelado Molecular “josé Luis andrade”, Facultad de Farmacia de la Universidad Central de Venezuela, apartado
Postal 40.109, Caracas 1040-a, Venezuela.

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 39

 milagroS avendaño, trina colman de SaizarBitoria y marySaBel cordero troconiS

introducción Tabla i
estructuras de las naftoquinonas modeladas
El cáncer representa un problema mundial de sa-
lud. El creciente número de casos con diagnóstico de compuesto Fórmula compuesto Fórmula
cáncer coloca una enorme presión en los sistemas de
salud a nivel mundial. En un organismo sano las célu- 1 6
las trabajan guiadas por una programación biológica
que produce un conjunto armonioso. Las células can- 2 7
cerosas interrumpen este estado a causa de que pier-
den su programación natural luego que su aDn sufre
3 8
mutaciones diversas. Los tratamientos tradicionales
conllevan una serie de efectos secundarios que dismi-
nuyen la calidad de vida del paciente. Por ello, existe 4a 9a
interés creciente en los remedios herbarios, los cuales
cuentan con bastante aprecio del público general. 4b 9b
Tabebuia barbata (E. Mey) Sandw. (bignoniaceae),
conocida en Venezuela como “palo de arco”, es autóc- 5 10
tona de la región del alto orinoco y del rio amazonas.
Su corteza ha sido utilizada por la población indígena
local por sus propiedades antibióticas, anti-inflamato-
calculados para los compuestos 1-5 y para las formas
rias y antimaláricas. algunas especies relacionadas de
reducidas de los mismos, hidroquinonas 6 – 10. Las
Tabebuia, han sido utilizadas también en norte y sur
formas reducidas se incluyen porque durante su meta-
américa para los mismos propósitos durante muchos
bolismo, las quinonas pueden sufrir reducción enzi-
años. En un trabajo previo se realizó un fracciona-
mática a las correspondientes hidroquinonas, a través
miento biodirigido del extracto etanólico de la corteza
de varias vías metabólicas, siendo la principal de ellas
de esta planta, con la prueba de letalidad sobre Arte-
la que se encuentra mediada por la enzima naD(P)H-
mia salina. Este fraccionamiento condujo al aisla-
quinona oxidoreductasa (nqo1; DT-Diaforasa). Esta
miento de cinco compuestos 1 – 5 (Colman, 1996)
enzima, conocida con anterioridad como DT-diaforasa
(Tabla i), los cuales demostraron poseer potente acti-
(brunmark, 1987) es una flavoproteina presente tanto
vidad antitumoral sobre cultivos celulares tales como
en el citosol como en el dominio hidrofílico del com-
células a-549 (cáncer de pulmón), células MCF-7 (cán-
plejo i mitocondrial (Sazanov, 2007). La modulación
cer de mama) y células HT-29 (cáncer de colon).
de esta enzima podría ser útil para el desarrollo de fár-
Las naftofuroquinonas han mostrado propiedades macos con actividad antitumoral.
antibacterianas, antiprotozoarias (Wright, 1990; Col-
La biotransformación de las quinonas puede ocu-
man, 1996) y, adicionalmente, los compuestos 1 – 5 re-
rrir a través de varias vías (ver figura 1). En una de ellas,
sultaron ser inhibidores del transporte electrónico en
se forma una hidroquinona relativamente estable, lo
mitocondrias de hígado de rata, usando como referen-
que involucra una reducción de dos electrones del
cia a la rotenona, con valores de iC50 entre 15 a 82,5
sustrato quinona con oxidación estequiométrica del
mM (Colman, 1996). El Lapachol y la 3-alil-b-lapachona
han sido investigadas como antiprotozoarias y mostra- naD(P)H, la cual no se encuentra asociada al consu-
ron que poseen actividad contra varias especies de mo de oxígeno. La reducción de dos electrones de las
protozoarios. Las naftoquinonas también han resulta- quinonas también puede ser catalizada, en el hom-
do ser potentes inhibidores del transporte electrónico bre, por la carbonil reductasa hepática, pero este me-
en protozoarios. La presencia de Lapachol (5) y de va - canismo suele ser menos importante. otra vía meta-
rias naftoquinonas genéticamente relacionadas en es- bólica en la que pueden involucrarse las quinonas es
ta especie explica, al menos en parte, los efectos an- la de la enzima naDPH-citocromo P450 reductasa.
titumorales observados in vivo y estos, a su vez, pue - Esta vía se encuentra asociada con consumo de oxíge-
den relacionarse con las propiedades redox de los no y con estrés oxidativo (Casarett, 2008).
compuestos. Con la finalidad de explicar los efectos La segunda vía metabólica de reducción de las qui-
sobre las funciones biológicas de estas estructuras nonas produce una especie radical semiquinona pro-
químicas en términos moleculares, se estudiaron des- ducto de la reducción por un electrón. Las semiqui -
criptores electrónicos y lipofílicos, tales como las nonas son especies altamente reactivas y autooxida-
energías de los orbitales HoMo y LUMo, las afinida- bles y, en consecuencia, entran en un ciclo redox que
des electrónicas y el Log P. Estos parámetros fueron conduce a oxidación no estequiométrica de naDPH y

40
 modelado molecular y docKing con la enzima nqo1 de naftofuroquinonaS antitumoraleS, PreSenteS en tabebuia barbata
Figura 1: Metabolismo de las quinonas.
al consumo de oxígeno. El estrés oxidativo asociado
con la autooxidación de las semiquinonas radicales li-
bres ocurre con producción de anión superóxido, pe-
róxido de hidrógeno y otras especies reactivas de oxí-
geno (roS) que pueden ser extremadamente citotóxi-
cas. aquellos tejidos que son naturalmente bajos en
contenido de enzima superóxido dismutasa (SoD),
son especialmente susceptibles al estrés oxidativo
proveniente del ciclo redox de las quinonas, lo cual ex-
plica, al menos en parte, los efectos cardiotóxicos de
la adriamicina y de otros agentes anticancerosos rela-
cionados (Minotti, 2004).
Materiales y métodos
Los compuestos estudiados fueron las naftofuro-
quinonas 1 – 5 y sus formas reducidas 6 -10 (Tabla i).
Todos los cálculos fueron realizados mediante el uso
del programa Scigress Explorer® para Windows, versión
7.7 de Fujitsu Limited. Los modelos tridimensionales
se construyeron con el editor del programa y posterior-
mente se minimizó su energía (optimizó su geometría).
Para ello se utilizó Mecánica Molecular (MM) con campo
de fuerza MM3 augmented de allingher (allingher,
1989). Los parámetros de la Mecánica Molecular fue-
ron block diagonal newton raphson y convergencia a
0,001 Kcal/mol. La búsqueda del confórmero más es -
table se realizó mediante la aplicación Conflex del pro -
grama mediante una búsqueda exhaustiva. Las estruc -
turas de mínima energía se utilizaron para determinar
las propiedades electrónicas a tres niveles de teoría:
semiempírico (PM3) y DFT, utilizando el funcional híbri -
do b88-LYP GGa(*) con las bases 6-31G(d) y 6-31G(d,p)
(Cache, 2008; becke, 1988; Lee, 1988).
a) determinación de parámetros Fisicoquímicos
y electrónicos:
Mediante la aplicación Project Leader (Cache,
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
2008), se extrajeron de las muestras los valores co-
rrespondientes a las energías de los orbitales HoMo y
LUMo (relacionadas con el potencial de ionización y la
afinidad electrónica respectivamente); la susceptibili-
dad nucleofílica (Sn), superdeslocalizabilidad nucleo-
fílica (Spn), momento dipolar y el Log P.
Todos los valores fueron tabulados y se compara-
ron los tres diferentes niveles de teoría. a partir de
aquí se seleccionó el nivel DFT, utilizando el funcional
híbrido b88-LYP GGa con la bases 6-31G(d) para to-
dos los cálculos posteriores.
b) potencial electrostático Molecular (peM)
y orbitales de Frontera:
El potencial electrostático molecular sobre la den-
sidad electrónica se generó con una función de onda
DGauss/DFT y utilizando el funcional GGa/b88-LYP y
la base 6-31G(d). El potencial electrostático se tabuló
a una distancia de 0,2 Å. Las condiciones para evaluar
la isosuperficie de los orbitales HoMo y LUMo fueron,
así mismo, grid 51 y distancia 0,3 Å.
c) determinación del Acoplamiento Molecular
en la enzima nqo1 (docking)
La enzima nqo1 humana empleada para el estu-
dio de docking se descargó de la base de datos PDb
de brookhaven donde se encontraba co-cristalizada
con el ligando, sustrato de la enzima, Eo9 (figura 2b)
(código PDb 1GG5) (Faig, 2001). Se simplificó la es-
tructura de cuatro unidades hasta reducirla al mo-
nómero (cadena a) con el cual se trabajó, dado que
los cuatro sitios activos de la enzima son equivalen-
tes. Este monómero es una subunidad completa que
contiene todos los residuos y el cofactor. Se añadie-
ron los hidrógenos faltantes en el monómero y elimi-
naron las moléculas de agua.
a continuación se encontró el conjunto de los res-
tos de aminoácidos que forman parte del sitio activo.
Para ello se empleó el ligando co-cristalizado con la
enzima y se seleccionaron todos los restos que se en-
contraban en una esfera de 5 Å alrededor del mismo.
Esta búsqueda produjo como resultado que el sitio
activo de la nqo1 humana se encuentra formado por
los residuos prolina 68 (Pro 68), alanina 69 (ala 69),
tirosina 126 (Tyr 126), tirosina 128 (Tyr 128), tirosina
132 (Tyr 132), Glicina 174 (Gly 174), isoleucina 175
(ile 175), fenilalanina 178 (Phe 178) y el cofactor FaD
los cuales, en conjunto, forman un bolsillo donde se
producen las reacciones de reducción de las diversas
quinonas (figuras 2 y 3). Se seleccionó como distancia
para la evaluación de la interacción una resolución de
0,3 Å/grid.
41
 milagroS avendaño, trina colman de SaizarBitoria y marySaBel cordero troconiS

Figura 2. (a) vista del sitio activo mostrando el ligando co-
cristalizado (eo9), coloreado de rosado dentro del bolsillo.
(b) ligando eo9 (c) el bolsillo que forma el sitio activo limi-
tado por el cofactor FAd.
Figura 3. Sitio activo de la nqo1 señalando los aminoácidos
y el eo9.
Una vez encontrado el sitio activo se procedió al
acoplamiento utilizando el programa Scigress®, cuya
aplicación realiza un Docking automático y evaluó la
disposición resultante dentro del sitio activo mediante
la función PMF. Los parámetros fijados fueron: un ta-
maño de la caja de 15 Å de lado, ligando flexible y si-
tio activo rígido. Las coordenadas tridimensionales
para la visualización de los ligandos (compuestos 1-5
y el Eo9) fueron asignadas por el mismo programa.
Previo al estudio de acoplamiento de los ligandos se
realizó una prueba de validación para encontrar los
parámetros óptimos para el proceso de docking con el
programa Scigress. La calidad del acoplamiento se
evaluó mediante la comparación de las raíces de las
desviaciones cuadráticas medias (rMDS) de cada una
de las posiciones con respecto a la estructura cristali-
na. El ligando Eo9 se colocó de nuevo dentro del sitio
activo de la nqo1 y se obtuvo un rMSD de 1,3 Å y un
ΔG de interacción de -90,2 Kcal/mol. Todos los ligan-
dos se acoplaron permitiendo flexibilidad al ligando
de forma que se evaluara el tipo de unión y la afinidad.
Los resultados son reportados como ΔG de unión li -
gando-enzima [8]. Cada uno de los compuestos se
evaluó 5 veces y se reportaron los valores promedio.
En todos los casos los valores de ΔG tuvieron una dis-
persión menor o igual a + 2 Kcal/mol.
d) postulación de un Farmacóforo
de naftofuroquinonas inhibidoras
de la enzima nqo1
Con la aplicación Galahad® del programa Sybyl® se
identificaron las características estructurales y quími-
cas relevantes para la actividad de este tipo de com-
puestos, proponiendo un modelo farmacofórico (Ga-
lahad®, 2008). Para ello se creó una base de datos uti-
lizando una serie de compuestos con actividad inhibi-
dora de la enzima nqo1 reportada previamente (Ta-
bla ii) (nolan, 2006). Con la aplicación de GaLaHaD®,
se identificaron las características estructurales y quí-
micas comunes que poseen estas moléculas incluyen-
do aspectos tridimensionales de las mismas. Del aná -
lisis de los modelos resultantes se seleccionó un con-
junto de 3 propuestas, utilizando como criterio los va-
lores bajos de energía, con un mayor número de acier-
tos y que se consideraran las interacciones de puente
de hidrógeno. Por último se procedió a alinear cada
una de las estructuras de las naftofuroquinonas 1 - 5
con los modelos seleccionados mediante la aplicación
PMa (Pharmacophore Model alignment). Del resultado
de esta alineación se seleccionó el modelo farmaco-
fórico propuesto.
Tabla ii
estructuras seleccionadas para el diseño
del farmacóforo (nolan, 2006)
compuesto estructura ic50 (mM)
339583 2,0
354279 2,0
2113 3,5
106547 10,0
224124 12,5
8735 20,0
618201 60,0
resultados y discusión
Los resultados de los cálculos a los tres diferentes
niveles de teoría muestran la misma tendencia, con
variaciones en los valores absolutos (Tablas iii y iV). Si
se comparan los valores al nivel DFT, con las dos dife-

42
 modelado molecular y docKing con la enzima nqo1 de naftofuroquinonaS antitumoraleS, PreSenteS en tabebuia barbata

Tabla iii
propiedades electrónicas calculadas a tres niveles de teoría vs Actividad biológica

Tabla iV
propiedades electrónicas calculadas a tres niveles de teoría vs Actividad biológica (compuestos 6-10)

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 43

 milagroS avendaño, trina colman de SaizarBitoria y marySaBel cordero troconiS

rentes bases, puede verse que son virtualmente los dencia similar a comportarse como aceptores de elec-
mismos, por lo que se seleccionó la base más sencilla, trones y que pueden interaccionar con las mismas
6-31G(d) para los cálculos posteriores. El método de enzimas durante el metabolismo de reducción. Esta
funcional de la densidad (DFT), el cual es considerado condición es necesaria para la actividad inhibitoria de
por algunos autores, equivalente a un método de la enzima, pero no determina la potencia inhibitoria.
cálculo ab initio permite que se puedan realizar des-
cripciones para moléculas con un alto grado de confia- PoTEnCiaL ELECTroSTÁTiCo MoLECULar (PEM)
bilidad. Si se observan las tendencias, puede notarse
que el método semiempírico se comporta bien, es En los gráficos del Potencial Electrostático Molecu-
decir, aunque los valores reales se encuentran subesti- lar (peM), mostrados en la figura 5, se representan en
mados, la tendencia es la misma. De esta forma se color rojo las zonas de potencial electrostático positi-
comprueba que la metodología semiempírica es ade- vo, mientras que en color azul las zonas de potencial
cuada cuando se desea una estimación cualitativa de
las propiedades moleculares.
Puesto que el mecanismo de acción de estas es -
tructuras involucra etapas de reducción (figura 1) se
calcularon las afinidades electrónicas de todos los
compuestos. Esta afinidad electrónica se encuentra
relacionada con la energía del LUMo, tanto para las
estructuras originales como para las estructuras redu-
cidas. al relacionar los valores de la energía del LUMo
con la actividad biológica puede observarse, para el
caso de las células MCF-7 y a-549, que existe una co-
rrelación de la potencia del compuesto con la energía
del LUMo (o afinidad Electrónica). Esta correlación
puede verse con mayor claridad cuando se calcula el
logaritmo de la Dosis Efectiva 50 (ED50) y de la Concen-
tración inhibitoria 50 (iC50) y se grafican contra la afini-
dad electrónica (ver Gráficos 1 y 2). La tendencia casi
lineal que se observa en todos los casos indica que la
actividad biológica que posee este tipo de quinonas
tiene una alta susceptibilidad a pequeñas variaciones
de la afinidad electrónica. Estas variaciones, a su vez
dependen de los grupos sustituyentes sobre el anillo
de quinona, lo cual se encuentra de acuerdo con las
observaciones experimentales reportadas en la litera-
tura. así mismo, esto puede explicar el hecho de que
algunas quinonas pueden ser más activas en las célu- Figura 4: (a) orbitales de frontera hoMo (azul/verde) y luMo
(rojo/amarillo) para los compuestos 1 – 5. (b) orbitales de
las tumorales que poseen la enzima nqo1 sobre- frontera hoMo (azul/verde) y luMo (rojo/amarillo) para los
expresada (Cadenas, 1995), dado que serán redu- compuestos 6-10.
cidas por la misma.

orbitales Moleculares de Frontera:

hoMo y luMo
Las superficies de los orbitales de frontera, HoMo
y LUMo, se detallan en las imágenes de la figura 5.
Las superficies de los orbitales HoMo resultaron muy
similares entre todas las naftofuroquinonas (1-4). De
la misma forma resultan bastante similares en los
análogos reducidos (6-9). En contraste, el Lapachol
(5) muestra una forma y extensión del HoMo muy di -
ferente. Por otro lado las superficies del LUMo son
muy similares, lo cual puede encontrarse relacionado Figura 5: potencial electrostático Molecular para los compues-
con el hecho de que todas estas moléculas tienen ten- tos 1 – 10.

44
 modelado molecular y docKing con la enzima nqo1 de naftofuroquinonaS antitumoraleS, PreSenteS en tabebuia barbata
gráfico 1. Actividad biológica vs Afinidad electrónica sobre
células (a) A549 y (b) McF7.
electrostático negativo. Se puede observar que las zo -
nas de PEM negativo se encuentran asociadas primor-
dialmente a los pares de electrones sin compartir de
los átomos de oxígeno. La presencia de un número
mayor de regiones de potencial negativo en las estruc-
turas 2 y 3 parece encontrarse relacionada con una
mayor actividad. Debe recordarse que las superficies
de PEM son útiles para visualizar de manera cualitati-
va los posibles lugares de interacción de las molécu-
las con sus dianas biológicas. En este caso la presen-
cia de una mayor cantidad de áreas de PEM negativo
parece favorecer una mayor actividad.
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
gráfico 2. Actividad biológica vs Afinidad electrónica sobre
células (a) ht29 y (b) inhibición del transporte electrónico
mitocondrial vs afinidad electrónica.
SUSCEPTibiLiDaD Y SUPErDESLoCaLizabiLiDaD
nUCLEoFÍLiCaS
algunas quinonas resultan más citotóxicas porque
pueden sufrir reacciones de alquilación cuando son
atacadas por el átomo de azufre de GSH o de algún
grupo tiol perteneciente a una proteína que, actuando
como nucleófilo, produce el clásico producto de adi-
ción 1,4 (Cadenas, 1995; Thor, 1982). Esta reacción
de alquilación es interesante porque los productos
conjugados luego del ataque del azufre siguen siendo
sustratos de las reductasas, lo cual quiere decir que
45
 milagroS avendaño, trina colman de SaizarBitoria y marySaBel cordero troconiS

también son potencialmente capaces de aumentar el obtenidos se correlacionaron con cada una de las acti-
stress oxidativo y, en consecuencia, la citotoxicidad. vidades biológicas sobre cada una de las líneas de
Por ello se determinaron descriptores electrónicos que células tumorales y se encuentran reportados en los
pueden relacionarse con la reactividad de las quino- gráficos 4 y 5.
nas como lo son la susceptibilidad y la superdesloca-
lizabilidad nucleofílicas, por átomo de la molécula
(Grafico 3).

grafico 3: relación de la superdeslocalizabilidad nucleofíli-

ca de los compuestos 1 - 5 con respecto al log de la concen-
tración inhibitoria para las células ht-29.

observando los valores de la superdeslocalizabi-

lidad nucleofílica (Spn) con respecto al Log de las ac-
tividades de la línea celular HT-29 (cáncer de colon),
se encontró una buena correlación, lo cual se puede
interpretar como que en esta línea celular predomina
un mecanismo de acción que se inicia con la adición
tipo Michael sobre la quinona para convertirse en sus-
tratos citotóxicos a la célula tumoral.

DESCriPTorES LiPoFÍLiCoS
Como descriptores lipofílicos se calcularon el mo -
mento dipolar y el Log P. En este caso se encontró co -
mo aspecto más relevante que el Lapachol y su pro-
ducto reducido muestran ambos un mayor valor de
Log P que el resto de las naftofuroquinonas y es pre-
cisamente el Lapachol el compuesto que presenta la
citotoxicidad más baja.

aCoPLaMiEnTo MoLECULar (DoCKinG)

Con La EnziMa nqo1

Los resultados del acoplamiento molecular (doc-

king) para las naftofuroquinonas estudiadas y el Lapa- grafico 4: energía libre de unión vs ed50 para (a) células
chol se encuentran en la Tabla V. Estos valores de ΔG McF-7 y (b) células A549.

46
 modelado molecular y docKing con la enzima nqo1 de naftofuroquinonaS antitumoraleS, PreSenteS en tabebuia barbata
grafico 5: energía libre de unión vs ed50 para células ht-29.
(b) energía libre de unión vs ic50 en transporte electrónico
mitocondrial.
En el primer gráfico correspondiente a la línea tu-
moral MCF-7 (cáncer de mama) se observa la existen-
cia de una buena correlación, de manera semejante al
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
Tabla V
estructuras seleccionadas para el diseño
del farmacóforo (nolan, 2006)
compuesto Δg (Kcal/mol)
1 82,838
2 -88,539
3 -85,663
4ª -86,484
4b -87,225
5 -86,502
resultado obtenido cuando se correlacionó el valor de
la afinidad electrónica con la actividad biológica. otros
resultados anteriores obtenidos reportan un aumento
de la producción de roS atribuible a la vía metabóli-
ca de la enzima nqo1 (Fisher, 1993), debido a que la
misma se encuentra sobreexpresada en esta línea
tumoral y esto está en perfecto acuerdo con los resul-
tados de este trabajo. Por otra parte ya se mencionó,
que en células como la MCF-7 hay una buena correla-
ción entre la actividad biológica y las afinidades elec-
trónicas, lo cual confirma los resultados de Fisher y
col. (1993), puesto que aquellos sustratos (2 y 3) que
presentan una mayor afinidad electrónica son los
más activos. Esto permite afirmar que en el caso del
cáncer de mama, el mecanismo de acción citotóxico
de las naftofuroquinonas está mediado por el estrés
oxida tivo causado por un aumento en la concentra-
ción de roS.
En el segundo gráfico se comparan los valores de
ΔG con la actividad sobre la línea a-549 (cáncer de
pulmón) y puede apreciarse una buena correlación tal
como en el caso anterior. así mismo, la correlación de
la actividad biológica con la afinidad electrónica para
esta línea celular resultó buena, como en el caso de la
MCF-7 por lo cual se puede postular que sus mecanis-
mos de acción son bastante similares.
Para las células HT-29, la correlación de las ener-
gías de unión con las actividades antitumorales es mu-
cho menor. Como se explica más arriba, en esta línea
celular es mucho más probable que las quinonas su-
fran una adición previa al proceso de producción de
roS, lo cual puede explicar la baja correlación obser-
vada en este grupo de moléculas.
47
 milagroS avendaño, trina colman de SaizarBitoria
rELaCionES Con EL TranSPorTE ELECTróniCo
MiToConDriaL
La enzima nqo1, presente en el citosol, se en-
cuentra formando parte del complejo i mitocondrial
tanto de las células procariotas como eucariotas (Sa-
zanov, 2007). Es por ello que se incluyeron dentro de
los resultados obtenidos los valores del ensayo de inhi-
bición que estos compuestos ejercen sobre el trans-
porte electrónico mitocondrial (Tablas iii y iV, colum-
na rMb). En el gráfico 2b se observa la existencia de
una muy buena correlación de las actividades biológi-
cas para este grupo de estructuras. Esto apoya la idea
de que este grupo de naftofuroquinonas interaccionan
fuertemente con la enzima nqo1 presente en el Com-
plejo i mitocondrial, por lo que se debe considerar el
mecanismo redox como un mecanismo importante.
Esto estaría de acuerdo con el hecho de que los com-
puestos 2 y 3, que poseen la afinidad electrónica más
elevada, son también potentes inhibidores del trans-
porte electrónico mitocondrial.
ProPUESTa DE Un MoDELo FarMaCoFóriCo
a partir de la lista de modelos propuestos por el
GaLaHaD y las evaluaciones que reporta, para cada
uno de ellos, el programa, se seleccionaron finalmen-
te, luego de un estudio cuidadoso, 4 candidatos. Los
modelos de farmacóforos seleccionados se utilizaron
posteriormente para alinear, de manera individual y so -
bre ellos, los compuestos problema, (1-5) y seleccio-
nando finalmente el mejor de ellos.
Los modelos seleccionados fueron el modelo 006,
el modelo 008, el modelo 014 y el modelo 016 (Tabla
Vi). Estos modelos se escogieron, después de hacer la
Tabla Vi
Modelos seleccionados mediante la aplicación
de gAlAhAd®
48
y marySaBel cordero troconiS
inspección visual de las superposiciones, en base a
los parámetros de número de aciertos elevado, la
energía total y un valor relativamente alto de la contri-
bución de los puentes e hidrógeno. Este último pará-
metro se considera importante porque es una de las
fuerzas de unión que se encuentra durante los estu-
dios de acoplamiento molecular analizados anterior-
mente. Este análisis, unido con los resultados de las
superposiciones con las naftofuroquinonas, conduce
a proponer que dentro del farmacóforo deberán estar
presentes: (a) un mínimo de tres regiones hidrofóbi-
cas, contiguas las cuales pueden relacionarse con el
sistema de anillos aromáticos fusionados y (b) al me-
nos una región que permita la formación de puentes
de hidrógeno bien sea mediante un átomo aceptor o
un átomo donador de puente de hidrógeno. El modelo
que más se ajusta a esta descripción es el modelo
006 (Tabla Vi).
conclusiones
Los efectos fisiológicos y toxicológicos de las qui-
nonas, bien sean de origen sintético o natural y su pa-
pel como agentes quimioterapéuticos puede enten-
derse como una consecuencia de su reactividad quí-
mica. así mismo son importantes las características
estructurales debido a que estas serán las que deter-
minan la facilidad de interacción con los sitios activos
enzimáticos que median el metabolismo de estas es-
tructuras.
En los estudios realizados se encontró buena co-
rrelación entre la citotoxicidad y la afinidad electróni-
ca (energía del LUMo) para líneas celulares de tumo-
res humanos tipo a-547 y MCF-7. También se encon-
tró buena correlación entre los valores de ΔG de unión
con la nqo1 en las líneas a-547 y MCF-7. Para la línea
celular HT-29 se observó buena correlación entre la
superdeslocalizabilidad nucleofílica (Spn) y el Log de
las actividades citotóxica.
Para su interacción con la enzima nqo1 se propo-
ne el siguiente modelo farmacofórico:
Un mínimo de tres regiones hidrofóbicas, contiguas
las cuales pueden relacionarse con el sistema de ani-
llos aromáticos fusionados.
al menos una región que permita la formación de
puentes de hidrógeno bien sea mediante un átomo
aceptor o un átomo donador de puente de hidrógeno.
Agradecimientos: al CDCH por financiamiento
otorgado a través del proyecto institucional Pi 06-00-
6994-2007 y al Laboratorio de Modelado Molecular
“josé Luis andrade” por los equipos utilizado para la
realización de los cálculos.
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recibido: 1º de octubre de 2011
aceptado: 10 de abril de 2012
49
efectos deletereos del Jc25 sobre la bioenergética
celular y la biosíntesis de esteroles
de Leishmania braziliensis
deleterious effects of Jc25 on cellular bioenergetics
and sterol biosynthesis of Leishmania braziliensis

Jorge núñez-durán1, dAzniA BoMpArt1, JAiMe chArriS2, JoSé cAMAcho2,

dAniel rodríguez3, tAniA rodríguez3, gonzAlo viSBAl4, álvAro álvArez4,
yAel gArcíA-MArchAn1 y Xenón SerrAno-MArtín1*

resumen
La Leishmaniasis es considerada por la oMS como una de las seis parasitosis con mayores índices de morbilidad y mortali-
dad a nivel mundial. Las drogas de primera línea utilizadas (Glucantime® y Pentostan®) generan graves efectos secundarios,
así como fenómenos de quimioresistencia. En este sentido, nuestro grupo de investigación se planteó el reto de desarrollar
y sintetizar nuevos compuestos antiparasitarios efectivos. bajo metodologías de síntesis rápidas y económicas, logramos
obtener 14 compuestos derivados de benzimidazoles. Con la finalidad de evaluar el potencial antiparasitario, se realizaron
curvas de crecimiento evaluando diversas concentraciones de los compuestos. Demostramos que uno de los derivados
(jC25), disminuyó la viabilidad de promastigotes de L. braziliensis de manera dependiente de la dosis, con un valor de iC50:
56µM. a través del uso de indicadores fluorescentes, determinamos que este compuesto desestabiliza el potencial electro-
génico mitocondrial y genera alcalinización de los acidocalcisomas en estos parásitos. adicionalmente y a través de estu-
dios de GC/MS, determinamos que el jC25 interfiere con la biosíntesis de esteroles de estos parásitos, afectando la activi-
dad de la enzima escualeno epoxidasa. Estos eventos explicarían en parte, el efecto leishmanicida observado. Finalmente,
el jC25 generó un potente efecto sobre la viabilidad de amastigotes intracelulares de L. braziliensis (iC50: 12,78µM), sin afec-
tar la viabilidad de las células hospederas. Teniendo en cuenta que el amastigote intracelular es el estadio terapéuticamen-
te importante de la Leishmaniasis, el efecto mencionado anteriormente resulta muy interesante y permite realizar estudios
mas avanzados con este compuesto, o algunos otros con estructuras similares.

palabras claves: quimioterapia, Leishmania braziliensis, benzimidazol, bioenergética celular, esteroles.

Abstract
Leishmaniasis is considered by the World Health organization (WHo) as one of the six parasitosis, with higher rates of
morbidity and mortality worldwide. The first-line drugs (Glucantime® and Pentostan®) generate serious side effects in
treated patients, and chemoresistance phenomena. Thus, our research group is committed to develop and synthesize
new safe, economic and effective anti-parasitic compounds. by the use of rapid and economic synthesis methodologies,
we developed 14 benzimidazole-derived compounds. in order to evaluate the anti-parasitic potential, growth curves vs in-
creasing compounds concentrations were done. We demonstrated that one of these compounds (jC25), affect the viabi-
lity of L. braziliensis promastigotes in a dose-dependent manner, with an iC50 value of 56μM. Using fluorescent indica-
tors, we determined that this compound destabilizes the mitochondrial electrogenic potential and generate the alcalini-
zation of the parasites acidocalcisomes. additionally and through GC/MS, we determined that jC25 interferes with the
parasites sterols biosynthesis, affecting the activity of the enzyme squalene epoxidase. These results could explain the
leishmanicide effect observed. Finally, jC25 yielded a potent effect on the viability of L. braziliensis intracellular amasti-
gotes (iC50: 12,78µM), without affecting the viability of the host cells. Given that intracellular amastigote is the therapeuti-
cally target of Leishmaniasis, the promising effect mentioned above pursue us to continue with further studies with this
compound, or some other with similar structures.

key words: Chemotherapy; Leishmania braziliensis, benzimidazole, cellular bioenergetics, sterols.

1 Laboratorio de Señalización Celular y bioquímica de Parásitos. Área de Salud. instituto de Estudios avanzados iDEa. Caracas-Venezuela.
2 Laboratorio de Síntesis orgánica. Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela UCV. Caracas-Venezuela.
3 Laboratorio de Pesquisa Selectiva. Área de Salud. instituto de Estudios avanzados iDEa. Caracas-Venezuela.
4 Laboratorio de Síntesis orgánica y Productos naturales. Centro de química. instituto Venezolano de investigaciones Científicas iViC.
Caracas-Venezuela.
*
Correspondencia: Dr. xenón Serrano-Martín. Laboratorio de Señalización Celular y bioquímica de Parásitos. Área de Salud. instituto de
Estudios avanzados iDEa. Carretera nacional Hoyo de la Puerta. Valle de Sartenejas. baruta. Caracas, república bolivariana de Vene-
zuela. Teléfono: +58 212 9035095; e-mail: xserrano@idea.gob.ve; xenonserrano@gmail.com

50
 efectoS deletereoS del Jc25 SoBre la Bioenergética celular y la BioSínteSiS de eSteroleS de Leishmania braziLiensis
introducción
Los parásitos protozoarios generan serias infeccio-
nes humanas, tales como: Leishmaniasis, Malaria, Tri-
panosomiasis africana y americana, entre otras. Estas
parasitosis, se presentan mayoritariamente en países
tropicales y en vías de desarrollo, impactando a un
estimado del 40% de la población mundial (Monzote y
Siddiq, 2011).
En Venezuela, Garrido y col. (2002) reportaron
que la leishmaniasis es endémica y se encuentra dis-
tribuida en todos los estados del país. Desde 1955 al
2002 se reportaron cerca de 50.000 casos de leishma-
niasis cutánea y más de 2.000 casos de leishmaniasis
visceral. La enfermedad es predominante en alturas
entre 0-1.800 metros sobre el nivel del mar. Los vecto-
res más frecuentes para la leishmaniasis cutánea son
Lutzomyia ovallesi, Lutzomia gomezi y Lutzomia
panamensis mientras que los agentes causales son
Leishmania braziliensis y Leishmania mexicana,
siendo los principales reservorios varias especies de
ratones salvajes. Tanto Leishmania chagasi como
Leishmania infantum han sido identificados como
agentes causales de leishmaniasis visceral, utilizando
como vector Lutzomia longipalpis y Lutzomia evan-
si, y a los perros como principal reservorio.
En el bienio 2008-2009, un total de 4.640 casos
de las diferentes formas clínicas de leishmaniasis cutá-
nea fueron diagnosticados en Venezuela, con una
media de 2.320 casos por año, y una tasa promedio
anual de 8,25 por cada 100.000 habitantes. Predo-
mina el sexo masculino con una razón de masculini-
dad de 1,84 para el período en estudio. Se registraron
casos en todas las edades, con predominio numérico
en el grupo de 5 a 34 años y una edad promedio de
31,09 y 33,91 años para los años 2008 y 2009 respec-
tivamente. En cuanto a la ocupación 22,39% corres-
ponde a personas del sector agropecuario, seguido de
estudiantes con 20,88% de los casos. Se registraron
casos en todas las entidades federales del país, me -
nos en nueva Esparta. En este período los estados
con mayor número de casos fueron Lara con 910
(19,61%), Miranda con 650 (14,01%) y Táchira con
488 (10,52%). En cuanto a las formas clínicas se ob -
servó un predominio franco de la leishmaniasis cutá-
nea localizada con 97,84% de los casos, generada por
Leishmania braziliensis. (De Lima y col., 2011)
El avance en el campo de las vacunas contra la
Leishmaniasis, se torna cada vez más lento y arduo.
Por esta razón, la quimioterapia representa el elemen-
to crucial en cualquier política de control de esta en-
fermedad. En tal sentido, las drogas más utilizadas en
Latino américa para el tratamiento de la leishmaniasis
cutánea son el antimoniato de meglumina (Glucan -
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
time®) y el estibogluconato de sodio (Pentostan®). Sin
embargo, se reportan recidivas en porcentajes eleva-
dos, severos efectos tóxicos a nivel cardíaco, renal y
hepático, así como importantes fenómenos de qui-
mioresistencia. La vía de administración de las sales
antimoniales pentavalentes debe ser parenteral: intra-
muscular o intravenosa, lo cual también complica el
tratamiento, dada la necesidad de dirigirse a un centro
asistencial especializado para su aplicación (bonfante
y barroeta, 2002). El uso indiscriminado de estos fár-
macos para el tratamiento de leishmaniasis visceral,
ha generado importantes fenómenos de resistencia
parasitaria en el Sur de Europa, irán, Sur-américa y no-
reste de india (Fasel y Myler, 2008), limitando su uso
en estas regiones.
basados en estas razones, nuestro grupo de inves-
tigación ha venido estudiando alternativas terapéuti-
cas que sirvan de base para el desarrollo de nuevas te-
rapias seguras, económicas y efectivas contra la Leish-
maniasis.
En este orden de ideas, resulta notable que la ma-
yoría de los compuestos desarrollados por la industria
farmacéutica contengan algún sistema heterocíclico
en su estructura, demostrando su valioso aporte en la
generación de actividad biológica. (Camacho y col.,
2011). Con la finalidad de proporcionarle mayor activi-
dad a este tipo de compuestos, se ha planteado la in-
troducción de un grupo aromático que done y atraiga
electrones en diversas posiciones de la molécula, así
como diferentes sustituyentes con reconocido poten-
cial biológico tales como: cloro, hidroxil, ariloxi y me-
toxi (Camacho y col., 2011).
Se ha demostrado que derivados de benzimidazo-
les tricíclicos presentan actividad antimalárica (bara-
zarte y col., 2008). Este estudio, muestra que la pre-
sencia de un grupo metil sustituyente en el anillo aro-
mático es favorable para la actividad antimalárica. Se
demostró además, que la mayoría de los compuestos
que contenían este grupo generaban una importante
inhibición de la degradación de la hemoglobina, inde-
pendientemente de la naturaleza de la sustitución en
el anillo aromático (barazarte y col., 2008). Estos deta-
lles estructurales, resultan interesantes en términos
de evaluar el efecto de derivados de benzimidazoles,
sobre la viabilidad de otros organismos relacionados,
como por ejemplo, parásitos tripanosomatideos.
Por esta razón, nos interesamos en el proceso de
síntesis de compuestos pertenecientes a esta familia
de benzimidazoles, los cuales se caracterizan por po-
seer un sistema bicíclico con un anillo de benceno fu-
sionado a otro con dos heteroátomos (nitrógeno o
azufre). Las ventajas de orientarnos por este tipo de
síntesis respecto a otras descritas en la literatura, son
51
Jorge núñez-durán, daznia BomPart, Jaime charriS, JoSé camacho, daniel rodríguez, tania rodríguez, gonzalo viSBal, álvaro álvarez, yael garcía-marchan y Xenón Serrano-martín
su simplicidad, los rendimientos elevados y su versatili-
dad, ya que la posición r1 (fig. 1), es sustituible por un
átomo de hidrógeno, un fenil o un naftil y siendo el he-
teroátomo sobre el anillo de cinco miembros un oxíge-
no o un azufre (Camacho y col., 2011).
Figura 1: estructura química general de los Benzimidazoles
(camacho y col., 2011).
Tomando en cuenta todos estos antecedentes,
nuestro grupo de investigación desarrolló y sintetizó
14 derivados de benzimidazoles, los cuales fueron
evaluados como leishmanicidas en cultivos de Leish -
mania braziliensis. resaltante fue el hecho que el
derivado jC25 (fig. 2) afectó la viabilidad de promasti-
gotes y amastigotes intracelulares de L. braziliensis,
de una manera dependiente de la dosis. Del mismo
modo, demostramos que este compuesto afecta la
bioenergética celular (funcionamiento de la mitocon-
dria y acidocalcisomas), así como la biosíntesis de
esteroles libres en esta especie de parásitos.
Figura 2: estructura química del derivado de Benzimidazol
Jc25 (camacho y col., 2011).
Materiales y métodos
rEaCTiVoS, FLUoróForoS Y DEMÁS qUÍMiCoS.
Todas las soluciones se prepararon con reactivos
adquiridos en las casas comerciales SiGMa, Promega,
invitrogen, Gibco b.r.L. y bio-raD. rodamina 123
(Molecular Probes; Eugene, or), naranja de acridina
(Molecular Probes; Eugene, or) FCCP y nigericina
(Sigma; St. Louis, Mo). El derivado jC25 fue sintetiza-
do según procedimiento reportado por (Camacho y
col., 2011).
CULTiVoS CELULarES
Promastigotes de Leishmania (V.) braziliensis
cepa MHoM/Co/87/Ua301 (amablemente cedida por
el Dr. Carlos Muskus. Programa de Estudio y Control
de Enfermedades Tropicales PECET Universidad de
52
antioquia. Colombia), fueron cultivados en medio LiT
(Liver infusion Tryptose: triptosa 15 g/L, extracto de
levadura 5 g/L, extracto de hígado 2 g/L, C 6H 12o 6
4 g/L, naCl 9 g/L, KCl 0,4 g/L y na2HPo4 7,5 g/L), su -
plementado con Hemina (20 mg/L), suero fetal bovi -
no (SFb) inactivado (10%) y antibiótico amikacina
(0,1 mg/mL), manteniéndose a 29ºC, en frascos de
cultivo de 25 mL.
Macrófagos bMDM (bone Marrow derivated macro-
phage) fueron obtenidos de médula ósea de fémur de
ratón balb/C, según lo reportado por Marim y col.,
2010, con modificaciones menores. brevemente, el
contenido de médula ósea extraído mecánicamente,
fue cultivado en medio selectivo bMDM, compuesto
por: DMEM (Dulbecco`s modified eagle`s medium) alto
en glucosa, 20% de SFb y 30% de sobrenadante de
células L-929 (fibroblasto de ratón). Este cultivo per-
maneció durante 7 días, a 37°C y 5% de Co2 para su
diferenciación.
EVaLUaCión DE La aCTiViDaD anTiParaSiTaria
DE DEriVaDoS DE bEnziMiDazoL SobrE
ProMaSTiGoTES DE L. BRAZILIENSIS.
La susceptibilidad de promastigotes de L. brazi-
liensis a 14 derivados de benzimidazol, fue evaluada
mediante la preparación de curvas de crecimiento en
ausencia y presencia de los compuestos, según lo re-
portado por Serrano-Martín y col., 2009a. brevemen-
te, un inóculo inicial de 1x106 promastigotes/mL, fue-
ron colocados en medio LiT-hemina suplementado,
en frascos de cultivo de 25 mL. Transcurridas 24 h, se
agregaron las diversas concentraciones de cada com-
puesto disueltos en Dimetilsulfóxido (DMSo, 0.1% fi-
nal). La proliferación celular se determinó mediante
contaje directo con cámara de neubauer, diariamente,
durante 5 días consecutivos, hasta alcanzar la fase
estacionaria del cultivo. Se incluyó un control del ex-
perimento al cual no se le agregó compuesto alguno,
y otro al cual se le agregó 0.1% de DMSo. Se realiza-
ron 3 experimentos independientes con cada concen-
tración de compuesto, contándose así cada condición
experimental por triplicado. Seguidamente y según lo
reportado por Serrano-Martín y col., 2009a, se elabo-
ró una curva dosis-respuesta graficando el número de
parásitos contra concentraciones de compuesto to-
mando los datos de las 96 h de cultivo. a partir de es-
ta curva, se determinó el valor de iC50 mediante el mé-
todo de interpolación lineal propuesto por Huber y
Koella (1993). brevemente, este método propone to-
mar dos concentraciones (x1 y x2), de manera tal que
la densidad de parásitos (Y1) a la concentración de dro-
ga (x1) (y todas las concentraciones inferiores), sea
mayor que la mitad de la densidad encontrada en el
control (Y0). Del mismo modo, la densidad encontrada
 efectoS deletereoS del Jc25 SoBre la Bioenergética celular y la BioSínteSiS de eSteroleS de Leishmania braziLiensis
para la concentración de droga x2 (y todas las concen-
traciones superiores), sea menor que la mitad de la
densidad (Y0). El iC50 fue determinado por interpola-
ción lineal entre las concentraciones (x1 y x2) median-
te la siguiente fórmula:
{[(Y1)–(Y0/2)]
Log (EC50): Log (x1) + [Log (x2)–Log (x1)]}
Y1–Y2
Finalmente, fue seleccionado el derivado jC25 de-
bido a su alta actividad sobre la viabilidad de promas-
tigotes de L. braziliensis, aunado a sus buenas condi-
ciones de solubilidad y estabilidad en el tiempo.
DETErMinaCión DEL EFECTo DE jC25 SobrE
PoTEnCiaL DE MEMbrana MiToConDriaL
DE L. BRAZILIENSIS
Las estimaciones del potencial de membrana mi-
tocondrial se llevaron a cabo según lo reportado por
Serrano-Martín y col. (2009a), con modificaciones me-
nores. Para la realización de este ensayo, utilizamos el
fluoróforo rodamina 123 el cual presenta un pico má-
ximo del espectro de excitación a 488 nm y un pico
máximo en su espectro de emisión a 530 nm. Este
fluoróforo tiene la capacidad de intercalarse entre las
membranas externa e interna de la mitocondria de los
parásitos, permitiendo monitorear las variaciones en
el potencial electroquímico del organelo debido al
efecto del compuesto evaluado. brevemente, 1 x 108
promastigotes de L. braziliensis fueron cargados con
10 µg/mL de rodamina 123, en buffer de carga (130
mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM KH2Po4, 20 mM Tris-HCl,
pH 7.4) incubándose por 30 min a 29ºC y en agitación
constante. Luego de la incubación, los promastigotes
fueron expuestos a distintos efectores durante 5min y
lavados 2 veces con el buffer anterior. Finalmente, las
distintas condiciones experimentales fueron observa-
das bajo microscopio de fluorescencia zEiSS modelo
observer z1.
ESTUDio DEL EFECTo DE jC25 SobrE
aLCaLinizaCión DE aCiDoCaLCiSoMaS
DE L. BRAZILIENSIS
Para realizar estas mediciones se empleó el fluoró-
foro naranja de acridina (na), el cual tiene la capaci-
dad de acumularse en compartimientos acídicos tales
como acidocalcisomas, de acuerdo con el potencial
de H+ presente en los mismos. inicialmente, promas -
tigotes de L. braziliensis fueron cargados con 2 µM de
naranja de acridina en buffer de carga (130 mM KCl,
1 mM MgCl2, 2 mM KH2Po4, 20 mM Tris-HCl, pH 7.4),
incubándose durante 5 min, a 29ºC y agitación cons -
tante. Posteriormente, los promastigotes cargados se
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
incubaron con los efectores correspondientes por
5min y fueron lavados 2 veces con buffer de carga.
Finalmente, las distintas condiciones experimentales
fueron observadas bajo microscopio de fluorescencia
zEiSS modelo observer z1.
DETErMinaCión DEL EFECTo DE jC25 SobrE La
bioSÍnTESiS DE ESTEroLES LibrES En L. BRAZILIENSIS
El contenido de esteroles libres en promastigotes
tratados y no tratados con jC25, fue determinado me-
diante cromatografía gas-líquido acoplada a espectro-
metría de masas de alta resolución, según lo repor -
tado por Serrano-Martín y col., 2009a. inicialmente,
50 x106 promastigotes de L. braziliensis fueron culti-
vados en presencia de jC25, durante 5 días. Seguida-
mente, los lípidos totales fueron extraídos con una
mezcla coloroformo:metanol (2:1). El extracto fue se-
cado y luego resuspendido en un volumen mínimo de
cloroformo. Esta suspensión fue corrida en una co-
lumna de ácido silícico (1.5 x 4 cm), luego lavada con
5 volúmenes de cloroformo con la finalidad de separar
lípidos neutros (esteroles) de otras fracciones lipídi-
cas. Finalmente, la muestra fue resuspendida en 5 µL
de cloroformo. Para la cuantificación de esteroles li-
bres y establecimiento de correspondencias estructu-
rales, 1 µL de cada muestra fue inyectada en un croma-
tógrafo de gases agilent Technologies 7890a, acopla-
do a un espectrómetro de masas de alta resolución
agilent Technologies 5975C. La condiciones del equi-
po fueron las siguientes: columna de capilaridad de
alta resolución (25 m x 0.20 mm [diámetro interno]; Ul-
tra-2; 5% fenil-metil-siloxane; espesor de la película,
0.33 m), temperatura inicial de inyección 50ºC (1 min),
seguido de un incremento de temperatura hasta 280ºC
(a una tasa de 25ºC/min), y luego hasta 300ºC (a una
tasa de 1ºC/min), utilizándose Helio como gas de flujo
a una tasa constante de 0.6 mL/min.
EVaLUaCión DEL EFECTo DE jC25 SobrE
La ViabiLiDaD DE aMaSTiGoTES inTraCELULarES
DE L. BRAZILIENSIS
Para realizar este ensayo, se preparó una mezcla
de macrófagos bMDM-promastigotes de L. brazilien-
sis, en una proporción 1:10 diluido en medio DMEM.
Seguidamente, 200 μL de la mezcla fueron colocados
en placas de 24 pozos, incubando en cámara húme-
da, por 6 horas a 37ºC y 5% de Co2 con la finalidad de
garantizar la interacción inicial entre promastigotes y
macrófagos. Luego, se agregó a cada condición las
concentraciones correspondientes de jC25 a evaluar,
incubando nuevamente por 96 horas, a 37ºC y 5% de
Co2. Transcurrido este tiempo, cada condición fue fija-
da y teñida con Giemsa. El efecto del jC25 sobre la
53
Jorge núñez-durán, daznia BomPart, Jaime charriS, JoSé camacho, daniel rodríguez, tania rodríguez, gonzalo viSBal, álvaro álvarez, yael garcía-marchan y Xenón Serrano-martín
viabilidad de amastigotes intracelulares de L. brazi-
liensis, se determinó contabilizando: número de
amastigotes por macrófago, número de macrófagos in-
fectados y total de macrófagos. Se realizaron 3 experi-
mentos independientes de cada concentración del
compuesto, contándose cada condición por triplica-
do. realizado lo anterior, se determinó el porcentaje
de células infectadas respecto al control del experi-
mento sin droga (100% de infección) según lo repor-
tado por brito y col. (2006), con modificaciones me-
nores. Con estos datos, se procedió a elaborar una
curva que expresa el porcentaje de infección de los
macrófagos, respecto a las concentraciones crecien-
tes de jC25. Finalmente fue calculado el valor de iC50
correspondiente según lo descrito en secciones ante-
riores y de acuerdo a lo reportado por Serrano-Martín
y col., 2009a.
resultados
EVaLUaCión DE La aCTiViDaD anTiParaSiTaria
DE jC25 SobrE ProMaSTiGoTES DE L. BRAZILIENSIS
Poblaciones de promastigotes de L. braziliensis
fueron expuestas a diversas concentraciones de jC25,
determinando su viabilidad, durante 5 días consecuti-
vos. La figura 3 muestra el efecto inhibitorio depen-
diente de la dosis, del jC25 sobre la viabilidad parasi-
taria. Es posible apreciar un efecto sobre la prolifera-
ción celular, 24 h posteriores a la adición del jC25.
Mediante la realización de una curva dosis-respuesta,
fue posible calcular la concentración de jC25 capaz
de inhibir la viabilidad del 50% de los promastigotes
en cultivo (iC50): 56µM. Este resultado demuestra la ca-
pacidad que tiene el jC25 de afectar moderadamente
la viabilidad de esta especie de parásitos, al menos,
en su estadio extracelular.
Figura 3. efecto de Jc25 sobre la viabilidad de promastigotes
de L. braziliensis. curva de crecimiento de promastigotes de
L. braziliensis expuestos a concentraciones crecientes de
Jc25. cada condición fue contada en cámara de neubauer
diariamente y por triplicado, por motivos estadísticos. ic50:56
(± 3µM).
DETErMinaCión DEL EFECTo DE jC25 SobrE
EL PoTEnCiaL DE MEMbrana MiToConDriaL
DE L. BRAZILIENSIS
Como explicamos anteriormente, la rodamina 123
es un fluoróforo sensor del potencial electrogénico
presente en el mitocondrion de estos parásitos. En es-
54
te sentido la figura 4 (panel izquierdo, correspondien-
te al control), muestra promastigotes cargados con
este fluoróforo observándose una intensa acumula-
ción en compartimientos citoplasmáticos alargados,
correspondientes al mitocondrion (flechas). al evaluar
el efecto del jC25 (panel central), observamos la disi-
pación de la fluorescencia acumulada en estos or-
ganelos, similar a la producida por el desacoplante clá-
sico FCCP (panel derecho). Teniendo en cuenta que el
protonóforo clásico FCCP, es capaz de disipar el po-
tencial electrogénico mitocondrial, podría sugerirse
que el jC25 provoca un efecto similar sobre la mito-
condria de L. braziliensis. Sin embargo, es necesario
realizar estudios cuantitativos para corroborar una
alteración del potencial electrogénico mitocondrial,
inducida por jC25.
Figura 4. efecto de Jc25 sobre el potencial electrogénico
mitocondrial de L. braziliensis. parásitos incubados en pre-
sencia de rodamina 123 por 45 min. control (parásitos car-
gados, sin compuesto), Jc25 (parásitos cargados + Jc25, 56
μM), Fccp (parásitos cargados + Fccp, 2µM).
Estudio del efecto del JC25 sobre la alcaliniza-
ción de acidocalcisomas de L. braziliensis: En la fi -
gura 5 se muestran promastigotes cargados con na -
ranja de acridina, marcador clásico de acidocalciso-
mas para estos parásitos. En el panel izquierdo (co-
rrespondiente al control), se puede observar la acu-
mulación del fluoróforo en compartimientos citoplas-
máticos redondeados, correspondientes a los acido-
calcisomas (flechas). al evaluar el efecto del jC25
(panel central), observamos la disipación de la fluo-
rescencia acumulada en estos organelos, similar a la
producida por el intercambiador clásico nigericina (pa -
nel derecho). El hecho que el jC25 genere un efecto
similar al intercambiador H+-K+ electrón-neutro nigeri-
cina (conocido por su capacidad de alcalinizar com-
pletamente acidocalcisomas), sugiere que este com-
puesto podría estar alterando los niveles de acidez de
estos organelos en L. braziliensis, Sin embargo, es
necesario realizar estudios cuantitativos para corro-
borar una alcalinización de los acidocalcisomas pro-
ducto del jC25.
Determinación del efecto de JC25 sobre la bio-
síntesis de esteroles libres en L. braziliensis: lípi-
 efectoS deletereoS del Jc25 SoBre la Bioenergética celular y la BioSínteSiS de eSteroleS de Leishmania braziLiensis

escualeno. Este paso, resulta esencial para el desa-

Figura 5. efecto de Jc25 sobre la alcalinización de acidocalci-
somas de L. braziliensis. parásitos incubados en presencia de
naranja de Acridina por 5 min. control (parásitos cargados,
sin compuesto), Jc25 (parásitos cargados + Jc25, 56 μM), ni-
gericina (parásitos cargados + nig, 2µM).
rrollo de la ruta biosintética en cuestión, la cual es
fundamental para la sobrevivencia de L. braziliensis.
Evaluación del efecto de JC25 sobre la viabili-
dad de amastigotes intracelulares de L. braziliensis
Macrófagos bMDM fueron infectados con promastigo-
tes de L. braziliensis con la finalidad de evaluar el
efecto del jC25 sobre el porcentaje de infección, y la
viabilidad de amastigotes intracelulares de esta espe-
cie de parásitos. En la figura 6, es posible observar co-
mo disminuye drásticamente el número de macrófa-
gos infectados y el número de amastigotes por macró-
fago, a medida que se incrementa la concentración de

dos neutros de promastigotes de L. braziliensis trata-

dos y no tratados con jC25 fueron extraídos e inyec-
tados en un cromatógrafo de gases acoplado a un
espectrómetro de masas de alta resolución. Se puede
observar en la Tabla i, que los parásitos no tratados
contienen 63,7% de 5-dehidroepisterol y 22,7% del
intermediario escualeno, consecuente con lo reporta-
do en la literatura (rodrigues, 2002). Por otra parte,
parásitos tratados con el iC50 de jC25 (56µM), mues-
tran una drástica disminución en los niveles de 5-de-
hidroepisterol (16,2%), producto de una importante
acumulación del intermediario escualeno (73,2%). La
prueba de “t” en presencia de homogeneidad de las
varianzas, muestra que existen diferencias significati- Figura 6. efecto de Jc25 sobre la viabilidad de amastigotes
vas entre el tratamiento con jC25 y el control para to- intracelulares de L. braziliensis. Macrófagos BMdM infectados
das la variables (p ≤ 0,05). Este resultado sugiere de con amastigotes de L. braziliensis en una proporción 1:10.
porcentaje de macrófagos infectados (n), nº de amastigotes
manera indirecta, que el jC25 es capaz de afectar la
por macrófago (s) y porcentaje total de macrófagos (l) deter-
actividad de la enzima escualeno epoxidasa, encarga- minados a las 96 h post-tratamiento. ic50: 12,78 µM (± 1µM),
da de la inter-conversión de escualeno a epóxido de determinado sobre el nº de amastigotes por macrófago.

Tabla i
evaluación del efecto de Jc25 sobre la biosíntesis de esteroles de L. braziliensis
tiempo
esteroles de retención (min) % de masa luego del tratamiento con: p-valor
control Jc25 (56µM)
Colesterol exógeno 24,2 13,6± 0,38 10,6± 1,01 0,0470

14-methyl
Endógeno 20,5 22,7± 0,69 73,2± 1,05 <0,0001
Escualeno

14-desmethyl
Endógeno
Ergosta-5,7,24(241) 28,9 63,7± 2,00 16,2±0,44 <0,0001
-trien-3ß-ol
(5-dehydroepisterol)

Porcentajes de masa del intermediario escualeno y 5-dehidroepisterol en esta ruta biosintética. Promastigotes control y expuestos a jC25,
56µM. Parámetros determinados mediante cromatografía de gases acoplado a un espectrometría de masas de alta resolución. Se realizó la
prueba “t” para los análisis estadísticos utilizando infoStat versión 2012 (Di rienzo y col., 2012), arrojando diferencias significativas entre el
tratamiento con jC25 y el control (p ≤ 0,05).

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 55

Jorge núñez-durán, daznia BomPart, Jaime charriS, JoSé camacho, daniel rodríguez, tania rodríguez, gonzalo viSBal, álvaro álvarez, yael garcía-marchan y Xenón Serrano-martín
jC25, sin afectar la viabilidad de las células hospede-
ras. Es importante resaltar que este efecto específico
para los amastigotes es dependiente de la dosis, mos-
trando un valor de iC50: 12,78µM, el cual es 4,38 veces
menor al iC50 determinado en este estudio para pro-
mastigotes (56µM).
discusión
a pesar de los esfuerzos realizados durante más
de 60 años en el campo de la quimioterapia contra la
leishmaniasis, actualmente solo ha surgido una droga
alternativa para su tratamiento, la Miltefosina®. Este
alkil-lisofosfolipido activo por vía oral es el mayor avan-
ce en la batalla contra esta parasitosis, sin embargo su
baja ventana terapéutica, teratogenicidad y desarrollo
de resistencia ha limitado ampliamente su uso en re -
giones endémicas (Serrano-Martín, 2010). En este
sentido, nuestros estudios se abocan al desarrollo de
compuestos alternativos, seguros y económicos que
representen una alternativa viable contra la leishma-
niasis. En el presente trabajo evaluamos el efecto de
14 derivados de benzimidazol sobre la viabilidad de
promastigotes y amastigotes intracelulares de L. brazi-
liensis. Estudiamos además, posibles mecanismos de
acción de estos compuestos sobre los parásitos, que
explicaran el efecto antiparasitario observado. Deter-
minamos entonces que el compuesto jC25, generó un
moderado efecto dependiente de la dosis sobre la via-
bilidad de promastigotes de L. braziliensis, mostrando
un valor de iC50 de 56 µM. Teniendo en cuenta, que en
la literatura no existen reportes del efecto de derivados
de benzimidazoles sobre la viabilidad de L. brazilien-
sis, valores similares de actividad parasiticida fueron
reportados por Serrano-Martín y col., (2006) y orué y
col., (2007). ambos demostraron que el fármaco de
uso humano Glibenclamida® afectaba la viabilidad de
promastigotes de L. mexicana con un iC50: 54 µM.
Esta evidencia, valida al jC25 como un compuesto de
acción moderada sobre la viabilidad de promastigotes
de L. braziliensis, sujeto a ser evaluado en siguientes
fases de estudio.
Con la finalidad de determinar los posibles meca-
nismos de acción mediante los cuales el jC25 afecta
la viabilidad de L. braziliensis, exploramos su efecto
sobre la bioenergética celular y la biosíntesis de este-
roles. inicialmente demostramos que el jC25 afectaba
el normal funcionamiento de la mitocondria y los aci-
docalcisomas. En este sentido, el compuesto fue ca-
paz de simular el efecto del protonóforo clásico FCCP,
induciendo la liberación de rodamina 123 desde la
membrana interna de la mitocondria. Este comporta-
miento fue observado anteriormente con compuestos
aromáticos como la aminoquinolina pentamidina, la
56
cual genera una pérdida del potencial mitocondrial en
L. donnvani (Vercesi y Docampo, 1992).
Los resultados muestran una pérdida en la acumu-
lación de la naranja de acrinida en acidocalcisomas de
promastigotes tratados con jC25. Esta disipación de
la fluorescencia, fue similar a la generada por el inter-
cambiador H+/K+ electroneutro nigericina, el cual es
conocido por su capacidad de alcalinizar los acidocal-
cisomas de estos parásitos (Vercesi y col. 2000). La
perturbación del normal funcionamiento de los acido-
calcisomas, ha sido asociada al efecto citotóxico de
algunos compuestos sobre la viabilidad de estos pará-
sitos (Serrano-Martín y col. 2009a,Vercesi y col. 2000)
Tanto la mitocondria como los acidocalcisomas,
son organelos fundamentales en el aporte energético
y fisiológico que sustenta la viabilidad de estos parási-
tos (Docampo, 2001). El efecto del jC25 sobre estos
organelos, pudiese justificar en principio la acción de
este compuesto sobre la viabilidad de L. braziliensis.
Sin embargo, resulta necesario realizar evaluaciones
cuantitativas, para determinar el mecanismo de ac-
ción específico mediante el cual el jC25 afecta el fun-
cionamiento de mitocondrias y acidocalcisomas de L.
braziliensis. Sería interesante evaluar por ejemplo, el
efecto del compuesto sobre los mecanismos de trans-
porte de acidocalcisomas aislados, así como sobre las
enzimas asociadas a la cadena transportadora mito-
condrial.
En términos de seguir sustentando el efecto del
jC25 sobre la viabilidad de L. braziliensis, indagamos
otros posibles mecanismos de acción los cuales en
conjunto, nos permitan explicar la acción leishmanici-
da observada.
En este sentido, estudiamos la ruta de síntesis de
esteroles de promastigotes expuestos a jC25, encon-
trando importantes alteraciones en el perfil de estero-
les determinado. Estas, sugieren un efecto sobre la en-
zima escualeno epoxidasa, esencial en la ruta de sín-
tesis de 5-dehidroepisterol en Leishmania spp (fig. 7).
En la población control los niveles de 5-dehidroepiste-
rol (63,7%), y escualeno (22,7%), fueron similares a
los reportados anteriormente para este género de pa-
rásitos (rodrigues y col., 2002). Sin embargo, los pro-
mastigotes expuestos a jC25 mostraron una significa-
tiva disminución en los niveles de 5-dehidroepisterol
(16,2%), así como una acumulación del intermediario
escualeno (73,2%). Lo anterior constituye una eviden-
cia indirecta de que jC25 afectó la actividad de la enzi-
ma escualeno epoxidasa esencial en la ruta de síntesis
de 5-dehidroepisterol en Leishmania spp (fig. 7). ac-
tualmente en la bibliografía, no existe ningún reporte
referente al efecto de derivados de benzimidazoles so-
bre la ruta de biosíntesis de esteroles en Leishmania
spp. Sin embargo, recientemente se determinó que la
 efectoS deletereoS del Jc25 SoBre la Bioenergética celular y la BioSínteSiS de eSteroleS de Leishmania braziLiensis
Figura 7. Fragmento de la ruta de síntesis de esteroles en
Leishmania spp. (Serrano-Martín y col., 2009a).
afectación de la actividad de esta enzima en L. mexi-
cana, se traduce en un potente efecto sobre la viabi-
lidad de estos tripanosomatideos (Serrano-Martín y
col., 2009a).
Considerando que la enzima escualeno epoxidasa
es esencial en la ruta de biosíntesis de 5-dehidroepis-
terol de Leishmania spp. (Urbina y Docampo, 2003),
la capacidad del jC25 para afectar la actividad de es-
ta enzima podría contribuir a su efecto inhibitorio so-
bre la viabilidad de Leishmania braziliensis. Sin em-
bargo, deben realizarse mediciones de actividad enzi-
mática de la escualeno epoxidasa, para confirmar
este supuesto.
resulta interesante el hecho que el jC25 compro-
metiera notablemente la viabilidad de amastigotes in-
tracelulares de L. braziliensis, el cual es el estadio clí -
nicamente importante de la Leishmaniasis. Los re -
sultados muestran que el jC25 fue 4,38 veces más
potente sobre este estadio (iC50: 12,78µM) que sobre
promastigotes libres (iC50: 56µM), sin afectar además
la viabilidad de su célula hospedera (macrófagos
bMDM).
Este representa el primer reporte referente al efec-
to leishmanicida de un derivado de benzimidazol so -
bre la viabilidad de amastigotes intracelulares de
Leishmania spp, lo cual proyecta la posibilidad de
evaluar este tipo de derivados, a otros niveles de estu-
dio como por ejemplo animales infectados (estudios
in vivo).
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
Agradecimientos
Los autores de este trabajo agradecemos a los
Drs. josé Álvarez, Gustavo benaim y Katherine Figa-
rella por el material y soporte técnico amablemente
prestado. a los Drs. Leandro balzano y jhonny Demey
por su colaboración con los análisis estadísticos.
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índice A
actividad antitumoral................................................................. 39

de B
benzimidazol ............................................................................ 50
deScriptoreS bioenergética celular ................................................................ 50

vol. 75 - nº 2 - 2012 C
Citotoxicidad............................................................................. 2
Clortetraciclina.......................................................................... 29
Croton micans.......................................................................... 2

D
Descriptores electrónicos .......................................................... 39

E
Esteroles................................................................................... 50

F
Farmacéutico ............................................................................ 22
Farmacología ............................................................................ 2
Fitoquímica............................................................................... 2

G
Granulador Sigma...................................................................... 14

L
Leishmania braziliensis .................................................................... 50

M
Metabolitos secundarios ............................................................ 2
Modelo Matemático ................................................................... 14
Muslo e hígado de pollo ............................................................. 29

N
naftofuroquinonas..................................................................... 39

O
optimización ............................................................................ 14
oxidorreductasa nqo1 ............................................................. 39
oxitetraciclina........................................................................... 29

P
Proceso de granulación húmeda................................................. 14
Productos biológicos terapéuticos .............................................. 22

Q
quimioterapia ........................................................................... 50

T
Tendencias regulatorias ............................................................. 22
Tetraciclina ............................................................................... 29

U
Uso racional .............................................................................. 22

Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012 59

 A
índice alcazar Wilmer........................................................................... 2

de Álvarez Álvaro............................................................................ 50
arvelo Francisco ........................................................................ 2

AutoreS avendaño Milagros ..................................................................... 39

B
vol. 75 - nº 2 - 2012 bompart Daznia ......................................................................... 50

c
Camacho josé ........................................................................... 50
Charris jaime ............................................................................ 50
Chavez Katiuska......................................................................... 2
Colman de Saizarbitoria Trina ..................................................... 39
Compagnone reinaldo S ............................................................ 2
Cordero Troconis Marysabel ....................................................... 39

g
García-Marcha Yael ..................................................................... 50
Gómez Marisol ........................................................................... 29

i
israel anita ................................................................................ 2

M
Mateu Elsa .................................................................................

ñ
núñez-Durán jorge..................................................................... 50

o
orsini Giovannina ...................................................................... 2

p
Pedrique de aulacio Magaly......................................................... 22

q
quintana de G agricia................................................................. 29

r
riina ricarda.............................................................................. 2
rodríguez Daniel ........................................................................ 50
rodríguez Tania ......................................................................... 50

S
Salazar de Saavedra Mariela M .................................................... 14
Salazar-bookaman Margarita ....................................................... 2
Saturno arias jenny F ................................................................. 14
Serrano-Martín xenón................................................................. 50
Suárez alírica i........................................................................... 2

t
Tillett Stephen............................................................................ 2

v
Visbal Gonzalo........................................................................... 50

60
 normas de publicación
La Revista de la Facultad de Farmacia fue creada
en 1959 y constituye una publicación periódica, arbitra-
da, de aparición semestral, destinada a promover la
difusión de artículos científicos en el área de las cien-
cias de la salud, así como en áreas básicas y aplicadas
relacionadas con la obtención, ensayos, análisis, usos y
producción de medicamentos, alimentos, cosméticos,
tóxicos y substancias relacionadas.
Está basada en la existencia de un Comité Editorial,
consistente en un editor-director, editores asociados y
una Comisión Editorial. Los manuscritos que publica
pueden ser de autores nacionales o extranjeros, resi-
dentes o no en Venezuela, en español o inglés. Los ma-
nuscritos deben ser trabajos inéditos y su aceptación
por el Comité Editorial implica que no ha sido publica-
do, ni está en proceso de publicación, en otra revista en
forma parcial o total. igualmente podrán ser publicadas
revisiones o cartas al editor. El manuscrito deberá ir
acompañado de una carta de solicitud firmada por el
autor responsable. En caso de ser aceptado, el Comité
Editorial no se hace responsable del contenido expresa-
do en el trabajo publicado. aquellos manuscritos que no
se acojan a las condiciones indicadas o que sean recha-
zados por dos de los árbitros que dictaminen sobre su
calidad y contenido, no serán publicados y serán devuel-
tos a los autores.
Forma y preparación de los manuscritos
Para la publicación de trabajos científicos en la Re -
vista de la Facultad de Farmacia, los mismos estarán
de acuerdo con los requisitos originales para su publica-
ción en revistas biomédicas, según el Comité internacio-
nal de Editores de revistas Médicas (2003). además, los
editores asumen que los autores de los artículos cono-
cen y han aplicado en sus estudios la ética de experi -
men tación (Declaración de Helsinki, y el Có digo de
Bioética y Bioseguridad, 2da. edición, 2002, del Minis -
terio de Ciencia y Tecnología y el Fondo nacional de
Ciencia y Tecnología).
Los manuscritos deben ser enviados en original y
dos copias impresas dentro de un sobre de papel grue-
so, incluyendo copias fotográficas y figuras entre car -
tones para evitar que se doblen, con una versión en dis-
kette o CD-roM. Los manuscritos deberán ser enviados
al Editor-Director a la Dirección de la revista, en el
instituto de investigaciones Far macéuticas de la Fa -
cultad de Farmacia, Universidad Central de Venezuela,
Los Chaguaramos, apartado Postal 40109, nueva Gra-
nada, Caracas, Venezuela.
Revista Facultad de Farmacia • Vol. 75 • Nº 2 • 2012
Los manuscritos deben estar escritos a doble espa-
cio, en papel bond blanco tamaño carta, por una cara,
sin borrones ni tachaduras y con márgenes de 2,5 cm.
Todas las páginas deben ser numeradas correlativamen-
te, empezando por el título. El número de la página de -
berá colocarse en el ángulo superior derecho de cada
página. Su longitud no debe exceder de veinte páginas,
excluyendo el espacio destinado a figuras, tablas y
leyendas.
Cada uno de los componentes del original deberá
comenzar en página aparte, en la secuencia siguiente:
a. Página del título, nombre completo de(l) (los)
autor(es) y su filiación institucional.
b. resumen y palabras clave.
c. Texto (introducción, materiales y métodos, resul-
tados, discusión, conclusiones y recomenda -
ciones).
d. agradecimientos.
e. referencias bibliográficas.
f. Tablas: cada una de las tablas en páginas aparte,
completas, con título y llamadas al pie de la tabla.
g. Figuras: cada una en página aparte con su título.
h. Leyenda de las figuras.
La página del título deberá contener:
1. Título del artículo en español e inglés, conciso e in-
formativo, no mayor de veinte palabras.
Primer nombre e inicial del segundo nombre y apelli-
do(s) de los autores (con una llamada para identificar
al pie de página al autor responsable de la corres-
pondencia, indicando su dirección electrónica). afi-
liación institucional de cada uno de los autores.
2. La segunda página debe contener un resumen en es-
pañol e inglés, con un máximo de 250 palabras. El
texto debe dar una visión general del trabajo, seña-
lar someramente el propósito, los métodos y los ha-
llazgos. no se deben citar referencias.
El resumen debe hacer énfasis en los aspectos nue-
vos e importantes del estudio o de las observaciones.
inmediatamente después del resumen, proporcionar
o identificar como tales: 3-10 palabras clave que ayu-
den a los indexadores en la construcción de índices
cruzados de su artículo y que pueda publicarse con
el resumen; utilice los términos del encabezamiento
temático [Medical Subject Heading (Mesh)] del index
Medicus.
61
 3. En cuanto al texto, debe dividirse en: introducción,
materiales y métodos, resultados y discusión. La in-
troducción debe aparecer después del resumen,
debe contener lo esencial para situar el problema y
la justificación del trabajo utilizando las referencias
más relevantes. Los materiales y métodos deben
contener la descripción breve y clara que permita la
comprensión y la reproducibilidad del trabajo. En
caso de técnicas y métodos clásicos ya publicados,
se debe indicar sólo la referencia. Los resultados
deben ser presentados en forma clara y precisa, con
un mínimo de discusión o interpretación personal.
Todas las figuras y tablas deben ser citadas en el tex-
to. la discusión debe ser restringida a la interpreta-
ción de los resultados y eventualmente a comparar
con los resultados de otros autores. las conclusio-
nes pueden ser incluidas dentro de la discusión; sin
embargo, se puede hacer una sección aparte, indi-
cando de forma clara y concisa los nuevos hallazgos.
Se pueden incluir recomendaciones de aplicación
práctica. los agradecimientos deben hacerse a las
personas o instituciones que han hecho contribucio-
nes al estudio.
4. Las referencias bibliográficas: Las mencionadas
en el texto deben citarse escribiendo entre parénte-
sis el apellido y año. Ejemplo: (Ávila, 1983); (brenes
y rodríguez, 1961); (zimermann y col., 2003).
La lista de referencias bibliográficas llevará por título
«referencias bibliográficas» y su ordenamiento será
según el orden alfabético manteniendo la estructura
siguiente: autor(es): apellido(os), inicial del nombre,
año, título del artículo, revista (abreviatura acep-
tada), Vol. número, páginas (en el caso de artículos
científicos). no se aceptarán trabajos que no se ajus-
ten a las normas presentes.
ejemplos:
Ávila jL. 1983. new national approaches to Chagas
disease chemotherapy. interciencia 8: 405-417.
Ávila jL, Ávila a, Muñoz E. 1981. Effect of allopurinol
on different strains of Trypanosoma crusi. am j Trop
Med Hyg 39: 769-774.
En el caso de que se trate de referencias de libros
debe contener:
62
nombre(es) de autor(es), capítulo del libro. En: títu-
lo de libro, número de la edición (excepto si es la pri-
mera), editorial, lugar de la edición, año de publicación
y páginas.
ejemplo:
Decampo r, Moreno Snj. Free radicals intermediates
in the antiparasitic action of drugs and fugacitic cells.
En: Free radicals in biology. Eds: Wa-Pryors academic
Press, 1984. pp. 243-288.
5. tablas: Las tablas deben presentarse en hojas se-
paradas, a doble espacio, y numeradas correlativa-
mente en números romanos con el título en la parte
superior. no se debe duplicar material del texto o de
las figuras. En caso necesario coloque material expli-
cativo en notas al pie de la tabla y no en el encabe-
zamiento; explique en notas al pie de la tabla las
abreviaturas no estandarizadas o utilizadas; identifi-
que claramente las variables tales como desviación
estándar y error estándar de la media; cite cada tabla
en orden correlativo dentro del texto; cite la fuente
de información al pie de la tabla si ésta no es original.
6. Figuras: Las figuras deben ser de buena calidad, en
papel con fondo blanco. Las fotografías de especí-
menes anatómicos, de lesiones o de personas, de-
berán tener suficiente nitidez como para identificar
claramente los detalles importantes. En caso de tra-
tarse de fotos en colores, los gastos de su impresión
correrán a cargo del autor del trabajo.
Todas las figuras deben ser identificadas en el reverso
de la hoja, indicando número de la figura, apellidos y
nombres de los autores (Ejemplo: Fig. 1; Fig. 2; etc.).
En caso de fotografía de personas evite que el sujeto
sea identificable, o acompañe de la autorización es-
crita de la misma.
Las leyendas de las figuras deberán presentarse a
doble espacio en página aparte y usar el número que
corresponde a cada figura. Cuando se usen símbolos
y fechas, números o letras para identificar partes en
las figuras, identifíquelas y explique cada una en la le-
yenda. Si se trata de fotomicrografía, indique la esca-
la e identifique el método de coloración.
Fórmulas y ecuaciones: éstas deben presentarse
claramente para su reproducción.
 reviStA FAcultAd de FArMAciA nº 75-2
Se imprimió durante el mes de febrero de 2013
por Diseño Gráfico WiLMariS, r.L.
en la ciudad de Caracas

nicolasgc2732@gmail.com