Metodología para la identificación de microorganismo de la etapa hidrolítica.

En el laboratorio, los microorganismos como bacterias, hongos y algas se cultivan

en medios de cultivo para caracterizar su crecimiento, identificarlos y determinar sus
actividades metabólicas. Los microorganismos necesitan condiciones
fisicoquímicas adecuadas de temperatura, pH, concentración de sales y de oxígeno,
además de nutrientes como carbono, nitrógeno, fósforo, azufre, minerales y factores
de crecimiento, que deben ser suministrados en el medio de cultivo y dependerán
de los requerimientos propios de la especie que se desea cultivar. Los componentes
indispensables de un medio de cultivo son agua, nutrientes orgánicos (hidratos de
carbono, aminoácidos, etc.), nutrientes inorgánicos (P, N, Mg, S, etc.). Algunos
componentes alternativos pueden ser factores de crecimiento (vitaminas),
isosmotizantes (NaCl), agente gelificante (agaragar), tampones, colorantes,
indicadores de pH, etc. Existen diferentes tipos de medios de cultivo, que pueden
clasificarse según sus componentes químicos, naturaleza física y función. Algunos
medios, por su composición, permiten el crecimiento de una gran diversidad de
microorganismos. Otros en cambio, se utilizan para la selección de determinados
grupos de organismos, o se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas
fisiológicas o bioquímicas. 1
Para la etapa de hidrolisis enzimática, se sugiere utilizar diferentes medios de
cultivos, entre ellos tenemos, para el cultivo de especies de Bacteroides del
rumen, las cuales hacen parte principal de la mencionada etapa.
 Bryant-Robinson Medio.
Tabla 1. Composición del medio BR por cada 1010.0 mL
Reactivo Cantidad
Glucosa, Maltosa o Celulosa 5.0 g
L-metionina 0.08 g
Solución mineral 50.0 mL
Solución de Na2CO3 50.0 mL
Solución de Hemina. 10.0 mL
Solución de L-Cisteína -HCl-Na2S 10.0 mL
Solución de vitaminas 5.0 mL
Solución VFA 4.5 mL
Resazurina 1.0 mL

1
BONILLA SALINAS, Mónica, et al. Manual de prácticas de microbiología básica [en línea]. En: Universidad
Autónoma Metropolitana. Diciembre, 2016, p 31. [consultado 23 de agosto del 2019]. Disponible en internet:
http://www.cua.uam.mx/pdfs/conoce/libroselec/23Manual%20de%20microbiologia_09diciembre2016.pdf
  Preparación de la solución mineral
Tabla 2. Composición de la solución mineral para el medio BR por cada litro.
Reactivo Cantidad
Fosfato mono potásico (KH2PO4) 18.0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 18.0 g
Sulfato de amonio ((NH4)2SO4 8.0 g
Cloruro de calcio hexahidratado (CaCl2)6H2O 0.53 g
Cloruro de magnesio hexahidratado MgCl2 6H2O 0.4 g
Cloruro de Cobalto Hexahidratado CoCl2 6H2O 0.2 g
Cloruro de manganeso Tetrahidratado MnCl2 4H2O 0.2 g
Sulfato de hierro Heptahidratado FeSO4 7H2O 0.08 g

Para la preparación de la solución mineral, en un beaker agregar 500 mL de agua

destilada, posteriormente agregar los reactivos, utilizar agitación magnética para
garantizar la correcta disolución, finalmente trasferir a un matraz aforado de 1000
mL y completar con agua destilada.
 Preparación de la solución de Na2CO3.
Pesar 8 gramos de Na2CO3 y disolverlos en agua desionizada libre de oxigeno
disuelto O2, burbujear por 15 minutos CO2, finalmente estelarizar la solución en una
autoclave por 15 minutos a 121 °C y 15 psi.
 Preparación de la solución de Hemina.
Pesar 0.01 g de Hemina y disolverlos exactamente en 100 mL de NaOH al 0.002%
(2 mg de NaOH por cada 100 mL de agua destilada).
 Preparación de Solución de L-Cisteína -HCl-Na2S
Tabla 3. Composición de la solución de L-Cisteína-HCl-Na2S.
Reactivo Cantidad
L- cisteína HCl 2.5 g
Sulfuro de sodio nonanohidratado Na2S 9 H2O 2.5 g

Agregue L cisteína -HCl al agua destilada/desionizada y lleve el volumen a 80.0 mL.

Mezclar bien. Ajuste el pH a 11 con NaOH. Añada Na 2S-9H2O. Mezclar bien hasta
disolver. Lleve el volumen a 100.0 mL con agua destilada/desionizada. Calentar
suavemente y llevar a ebullición por debajo del 100% de N 2. Enfriar a 25°C por
debajo del 100% de N2. Ingresar a la autoclave durante 15 min a 15 psi de presión
y 121°C.
 Preparación de la solución de vitaminas.
Tabla 4. Composición de la solución de vitaminas.
Reactivo Cantidad
Pantotenato cálcico 0.02 g
Nicotinamida 0.02 g
Piridoxina HCl 0.02 g
Riboflavina 0.02 g
Tiamina HCl 0.02 g
ácido p-aminobenzoico 1.0 mg
Biotina 0.25 mg
Ácido fólico 0.25 mg
Vitamina B12 0.1 mg

Mezclar todos los componentes y disolver en agua destilada hasta completar un

aforo de 100 mL.
 Preparación de solución ácidos grasos volátiles (VFA)
Tabla 5. Composición de la solución VFA para el medio BR por cada litro.
Reactivo Cantidad
Ácido acético 36.0 mL
DL-α-Acido Metilbutírico 2.0 mL
Ácido isovalérico 2.0 mL
n-Ácido valérico 2.0 mL
Ácido isobutírico 1.8 mL

En un matraz aforado de 1000 mL adicione los VFA, adicioné agua destilada y agite
vigorosamente, hasta homogenizar y llevar al aforo.

 Preparación del medio2.

Agregue los componentes, excepto la solución L- cisteína -HCl-Na2S, al agua
destilada o desionizada y lleve el volumen a 1.0 L agitar vigorosamente.
Posteriormente llevar la mezcla a ebullición hasta que la resazurina se vuelva
incolora, esto indica que se ha reducido la mezcla, luego agregue el medio de cultivo

2
ATLAS, Ronald. Handbook of microbiological media. Washington, D.C., EEUU: CRC Press, 2010. 274-275p.
en los recipientes donde se hará el cultivo, y estos deben quedar totalmente
sellados, posteriormente introducir los recipientes en la autoclave por 15 min a 15
psi de presión y 121 °C, Inmediatamente antes de la inoculación, añadir aséptica y
anaeróbicamente 0.1 mL de solución de L-cisteína -HCl-Na2S por cada recipiente
que se vaya a inocular. El pH debe ser monitoreado y debe mantenerse entre 6.5 a
20 °C y con una variación máxima de 0.2 unidades.
Uso general del medio: Para el cultivo de especies de Bacteroides del rumen.
 Pruebas bioquímicas3
 Tinción de Gram.

El principio de la tinción es de acuerdo con la estructura y grosor de la pared

bacteriana, agrupar las bacterias en Gram positas y Gram negativas. Las Gram
positivas poseen una capa gruesa de peptidoglucano y carecen de membrana
externa, por lo que fijan el colorante cristal violeta. Las Gram negativas tienen una
capa más delgada de peptidoglucano y poseen una membrana externa, y no se fija
el colorante.

 Técnica:

1. Extensión de una fina capa de muestra sobre el portaobjetos.

2. Secar de la muestra al aire.
3. Fijación por flameado de la placa
4. Adición del colorante:
i. Cubrir la placa con cristal violeta durante 1 a 2 minutos y lavar.
ii. Cubrir la placa con Lugol durante 1 a 2 minutos y lavar.
iii. Se decolora la muestro con alcohol-cetona durante 20 segundos
iv. Cubrir la placa con safranina durante 1 minuto y lavar.

5. Secar la muestra
6. Se coloca una gota de aceite de inmersión y se observa en el microscopio.

 Resultados:
Según la forma se clasifican en:

o Cocos: esféricos.
o Bacilos: bastones (algunos bacilos pequeños se denominan cocobacilos)
o Espirales: coma, forma S o espiral.

3
 o Pleomórficas: adoptando diferentes formas. (aspecto gelatinoso)

Según el color se clasifican en:

 Gram negativas (-): estarán teñidas de un color rosáceo.
 Gram positivas (+): estarán teñidas de un color violeta.

 Pruebas de la utilización citratos con el medio de Simmons.

Este medio permite determinar la capacidad de los microorganismos para
metabolizar el citrato. Contiene citrato como única fuente de carbono, fosfato de
amonio como única fuente de nitrógeno y azul de bromotimol como indicador de pH.
Únicamente las bacterias capaces de metabolizar el citrato (indica presencia de la
enzima citrato permeasa) podrán multiplicarse en este medio y, al hacerlo, utilizarán
los fosfatos presentes liberando iones amonio.
 Fundamento:
Las bacterias que pueden utilizar citrato como única fuente de carbono también
pueden extraer nitrógeno de la sal de amonio, con producción de amoníaco,
llevando a la alcalinización del medio. El medio lleva un indicador, el azul de
bromotimol, que da una prueba positiva cuando se presenta crecimiento con un
color azul intenso en el pico de flauta tras 24-48 horas de incubación y es prueba
negativa cuando no se observa crecimiento ni cambio de color (el medio permanece
de color verde.). Si se observa crecimiento sin cambio de color, se confirmará la
positividad de la prueba incubando el tubo 24 horas más, durante las que suele
aparecer el color azul.
 Procedimiento:
El medio se reparte en tubos de ensayo y una vez estériles se inclinan en pico de
flauta. Sembrar los microorganismos en los tubos procurando no tocar con el asa el
medio, porque sustancias nutritivas de éste podrían falsear los resultados. Incubar
a 37º C de 24-48 horas.
Tabla 6. Composición Agar Citrato de Simmons.
Reactivo Cantidad
Citrato de sodio 2.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Fosfato dipotásico 1.0 g
Fosfato monoamónico 1.0 g
Sulfato de magnesio 0.2 g
Azul de bromo timol 0.08 g
Agar 15.0 g
  Preparación medio de cultivo. Suspender 24.2 g del medio por litro de agua
destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullición durante
1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante
15 minutos. Enfriar en posición inclinada. El pH debe ser ajustado hasta 6.8.

 Prueba de Rojo de Metilo (RM)

Mediante esta prueba se va a comprobar la capacidad de un microorganismo de
producir y mantener estables los productos terminales ácidos de la fermentación de
la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del sistema. Requiere
microorganismos que produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico), a partir
de la glucosa, por la vía de fermentación ácido-mixta.
 Fundamento:
Fermentación ácido-mixta. Los productos finales son ácidos orgánicos (fórmico,
acético, láctico y succínico) y etanol. Se generará un evidente descenso del pH
que podrá ser detectado añadiendo al medio un indicador de pH como el rojo de
metilo. La prueba será positiva si el medio de cultivo toma color rojo: MR (+) y
caso contrario si el medio permanece amarillo o color amarillo naranja es
negativa (indica que hay productos ácidos débiles): MR (-).
 Procedimiento Rojo de metilo (RM):
En un tubo con 5 ml de caldo MR-VP sembrar la bacteria. Incubar 48 a 72 horas
a 37°C. Añadir a 1 ml. de los tubos incubados cinco gotas de rojo de metilo y
observar el color resultante: En caso de duda incubar 48 horas más.
Tabla 7. Composición Caldo MR-VP.
Reactivo Cantidad
Peptona 7.0 g
Fosfato dipotásico 5.0 g
Dextrosas 5.0 g

 Preparación medio de cultivo: MR-VP. Disolver 17 g en 1 litro de agua

destilada. Distribuir en tubos de ensayo en volúmenes de 5 mL y esterilizar a
121º C durante 15 minutos.
  Prueba Voges-Proskauer (VP).
Esta prueba permite observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía
butanodiólica. Si es así, los productos finales son compuestos neutros como el
butanodiol y el etanol y se forma un producto intermedio acetoína que forma un
complejo de color rojizo con el α-naftol.
 Fundamento:
Fermentación butilénglicólica. El compuesto intermedio acetoína puede ser
detectado añadiendo al medio KOH y alfa-naftol que reaccionará con este
compuesto produciendo una coloración rosa-rojiza en menos de una hora siendo la
prueba positiva: VP (+) y si se presenta un color amarillo en la superficie del medio
la prueba es negativa: VP (-).

 Procedimiento Prueba de Voges-Proskauer:

En un tubo con 5 mL de caldo MR-VP sembrar el microorganismo e incubar 48 horas
a 37 ºC. Posteriormente añadir a 1 mL de los tubos incubados 10 gotas de α -naftol
al 5 % y 10 gotas de KOH (hidróxido de potasio) al 40 % en el orden indicado. Agitar
para mezclar y colocar los tubos en posición de máxima inclinación para exponer el
medio al oxígeno atmosférico y se dé la reacción durante 10-15 minutos.

 Medio de SIM

Es un medio semisólido destinado para verificar la movilidad, producción de indol y

de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. La prueba de Indol se utiliza para
detectar la presencia de la enzima triptofanasa en las bacterias. Esta enzima
degrada el aminoácido triptófano a indol. Las cepas móviles pueden apreciarse en
este medio, por la turbidez que producen alrededor de la punción de siembra,
mientras que aquellas cepas productoras de sulfhídrico se distinguen por la
formación de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre
que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

 Resultados: Movilidad:

 Ensayo positivo: produce turbidez del medio, que se extiende más allá de
la línea de siembra.
 Ensayo negativo: el crecimiento se observa solamente en la línea de
siembra.
  Producción de H2S:

 Ensayo positivo: ennegrecimiento a lo largo de la línea de siembra o en todo

el medio.
 Ensayo negativas: el medio permanece sin cambio de color.

 Producción de Indol:

 Ensayo positivo: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de

Kovacks.
 Ensayo negativo: sin cambio de color.

 Procedimiento:
Con un asa tomar material de una colonia y sembrar por punción. Incubar a 37ºC
por 18 a 24 horas. Para identificación del indol se añaden 5 gotas de reactivo de
Kovacks, dejándolo caer por la pared interior del tubo.