PRÁCTICA N°10

CROMATOGRAFÍA LIQUIDA DE ALTA PRESIÓN (HPLC)

1. OBJETIVO:

 Determinar de cafeína en una bebida gaseosa (Inca Kola).

2. FUNDAMENTO TEÓRICO:

La Cromatografía líquida de alta presión (HPLC), es una técnica utilizada

para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos
de interacciones químicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatográfica. En el HPLC, el compuesto pasa por una columna
cromatográfica a través de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro
con pequeñas partículas redondeadas con ciertas características químicas
en su superficie) mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión
a través de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeñas
cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo
de las interacciones químicas o físicas con la fase estacionaria a medida que
adelantan por la columna. El grado de retención de los componentes de la
muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composición de la
fase estacionaria y de la fase móvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser
eluido de la columna se 52 denomina tiempo de retención y se considera
una propiedad identificativa característica de un compuesto en una
determinada fase móvil y estacionaria. La utilización de presión en este tipo
de cromatografías incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro
la columna y reduce así su difusión dentro de la columna mejorando la
resolución de la cromatografía. Los disolventes más utilizados son metanol,
acetonitrilo y agua la cual puede contener tampones, sales, o compuestos
como el ácido trifluoroacético, que ayudan a la separación de los
compuestos.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS:

 MATERIALES:

- Vaso beaker de 250.0 mL con agitador magnético y hot plate

- Jeringa de 3mL

- Plastico graduado de 50 mL.

 - Vial de hplc

 REACTIVOS:

- Bebida gaseosa Inca Kola (muestra)

 EQUIPO:

- Equipo HPLC Agilent serie 1100

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:
4.1. Preparar un estándar de 1000 𝑚𝑔⁄𝐿 a partir de un medicamento (gravergol).
100 𝑚𝑔 𝐶𝑎𝑓𝑒í𝑛𝑎
= 1000 𝑚𝑔⁄𝐿
100 𝑚𝐿

4.2. Preparar las soluciones estándar diluidas:

SOLUCIÓN Ppm VOLUMEN

1 10 0.5 mL

2 20 1.0 mL

3 30 2.0 mL

4 40 3.0 mL

*A cada solución se debe agregar 10 mL de agua ultrapura o Tipo I.

Para obtener el volumen de cada solución a 10, 20, 40 y 60 ppm, se halla en
la siguiente fórmula:

(1000 𝑝𝑝𝑚) × 𝑉 = (𝑝𝑝𝑚 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛) × (50 𝑚𝐿)

4.3. Preparar la muestra:

- 100 mL de bebida gaseosa y agitarla por 10 minutos.
- 25 mL con una pipeta la depositan en el tubo de ensayo de 50 mL y lo
aforan con H2O Tipo I.

4.4. Preparar la muestra para la medición por HPLC:

- Con una jeringa hipodérmica tomar de 3 – 5 mL y luego se filtrará con el
“filtro jeringel” y se depositará en el vial.

4.5. Condiciones para la medición del instrumento de HPLC:

- Columna: C-18
 ∅ = 4.6 𝑚𝑚
 Tamaño del poro = 4.6 mm
 Longitud de la Columna = 15 cm
- Fase Móvil:
 Solución de acetato de sodio 0.01 M de pH = 4.2 (ac. Acético glacial)
luego se filtra con una membrana de poro de 0.45 um (celulosa).
 Disolvente acetonitrilo se filtra con membrana de nylon de poro de
0.45 um.
5. CÁLCULOS Y RESULTADOS:

5.1. Los datos obtenidos del equipo HPLC son:

Ppm ÁREA TIEMPO DE WIDTH(ANCHO)

RETENCIÓN

10 71.96522 4.683 0.1052

20 149.70918 4.626 0.1043

40 296.45947 4.603 0.1036

60 450.18695 4.608 0.1039

MUESTRA 411.10101 4.604 0.1040

5.2. Ahora se realiza una gráfica de Área vs. Ppm para obtener la ecuación de la
recta:

ÁREA vs. Ppm

500

450

400

350

300
AREA

250

200 y = 7.5342x - 2.7826

150

100

50

0
0 10 20 30 40 50 60 70
ppm

Entonces la ecuación de la recta es:

𝑦 = 7.5342𝑥 − 2.7826

𝐴𝑟𝑒𝑎 = 7.5342𝐶𝑚 − 2.7826

5.3. Hallar el 𝐶𝑚 de la muestra, y como el Área de la muestra es 411.10101,
entonces el 𝐶𝑚 es:

411.10101 = 7.5342𝐶𝑚 − 2.7826

54.93 = 𝐶𝑚

5.4. Ahora hallaremos la 𝐶𝑅𝑒𝑎𝑙 de la muestra:

50 𝑚𝐿
𝐶𝑅𝑒𝑎𝑙 = 𝐶𝑚 × ( )
25 𝑚𝐿

50 𝑚𝐿
𝐶𝑅𝑒𝑎𝑙 = 54.93 × ( )
25 𝑚𝐿

𝐶𝑅𝑒𝑎𝑙 = 109.86

5.5. Seguidamente hallaremos el Número de platos para cada solución:

𝑇𝑟 2
𝑁𝑡 = 16 × ( )
𝑊
 Primer plato:

4.683 2
𝑁1 = 16 × ( ) = 31705.7
0.1052

 Segundo plato:

4.626 2
𝑁2 = 16 × ( ) = 31474.8
0.1043

 Tercer plato:

4.603 2
𝑁3 = 16 × ( ) = 31585.1
0.1036

 Cuarto plato:

4.608 2
𝑁4 = 16 × ( ) = 31471.2
0.1039

 Quinto plato (muestra):

4.604 2
𝑁5 = 16 × ( ) = 31356.2
0.1040
 5.6. Finalmente hallaremos el número promedio de platos:

𝑁1 + 𝑁2 + 𝑁3 + 𝑁4 + 𝑁5
×=
5

𝑁1 + 𝑁2 + 𝑁3 + 𝑁4 + 𝑁5
×= = 31518.6
5

6. CONCLUSIONES:

Podemos concluir que en la bebida gasesosa de Incakola tiene un alto contenido de

cafeína, mucho mayor que en la bebida gaseosa de CocaCola.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 D. A. Skoog, F. J. Holler, S. R. Crouch, Principios de análisis instrumental, 6ta

edición, Cengage Learning, México, 2008.
 SKOOG, D.A. James; Holler F. James; PRINCIPIOS DE ANÁLISIS
INSTRUMENTAL, 5° ed.; Ed. McGraw-Hill (1998), págs. 219-239.
 ROCHA Castro E.; PRINCIPIOS BÁSICOS DE ESPECTROSCOPÍA; Editorial UACh,
México (2000), pág 123-203.