CLONES INFECCIOSOS DE ADNC DE DOS CEPAS DEL VIRUS MAYARO PARA ESTUDIOS SOBRE

PATOGÉNESIS VIRAL Y DESARROLLO DE VACUNAS

RESUMEN

El virus Mayaro (MAYV; familia Togaviridae, género Alphavirus) es una amenaza global emergente
que puede causar manifestaciones clínicas graves similares a los virus Zika, dengue y chikungunya.
Actualmente, hay una falta de herramientas moleculares para permitir una mejor comprensión de
la transmisión y la patogénesis de MAYV. Aquí, detallamos el desarrollo y la caracterización de
clones infecciosos de dos cepas de MAYV que producen virus infecciosos y se replican en células de
mamíferos y mosquitos de manera similar al virus de tipo salvaje. Además, los virus derivados de
clones produjeron tasas de infección y fenotipos idénticos en ratones CD-1 en comparación con las
cepas parentales. Este sistema de clon infeccioso proporcionará un recurso a la comunidad de
investigación para analizar los determinantes genéticos de virulencia de MAYV, determinar la
competencia de vectores y desarrollar vacunas.

1. Introducción

Los virus o arbovirus transmitidos por artrópodos producen una carga significativa de enfermedades
y costos económicos en todo el mundo. Los arbovirus como el dengue (DENV), Zika (ZIKV) y
chikungunya (CHIKV) están ahora establecidos a nivel mundial (Weaver et al., 2018). Dado que las
enfermedades arbovirales afectan principalmente a los países en desarrollo, reciben escasa
atención del mundo desarrollado. Sin el monitoreo y la atención adecuados, estos virus pueden
causar brotes graves, como ocurrió recientemente con CHIKV y ZIKV en las Américas (Weaver et al.,
2018). Por lo tanto, es fundamental estudiar los patógenos emergentes antes de que produzcan un
brote para prevenir o controlar la propagación futura. Una de estas amenazas emergentes es el virus
Mayaro (MAYV; familia Togaviridae, género Alphavirus). MAYV produce una enfermedad que es
clínicamente similar a CHIKV, DENV y ZIKV, que produce fiebre, artralgia y erupción maculopapular.
Ocasionalmente, la infección por MAYV causa poliartritis crónica, complicaciones neurológicas,
hemorragia, miocarditis, e incluso la muerte (Esposito y Fonseca, 2017). Aislado por primera vez en
Trinidad y Tobago en 1954 en el condado de Mayaro, el virus se ha reportado en muchos países de
América Central y del Sur, incluidos Brasil, Bolivia, Ecuador, Venezuela y Haití, con algunos casos
importados en América del Norte y Europa. (Acosta-Ampudia et al., 2018; Levi y Vignuzzi, 2019). En
algunas partes de Brasil, MAYV se considera endémica y los brotes se han producido periódicamente
desde 1955 en muchas regiones diferentes del país (Esposito y Fonseca, 2017). El aumento de la
incidencia de MAYV en áreas fuera de las zonas endémicas, como un caso reciente en Haití (John
Lednicky et al., 2016), ha causado preocupación por la propagación del virus. Además, debido a sus
similitudes clínicas con otros arbovirus, MAYV a menudo se diagnostica erróneamente como CHIKV
o DENV, y puede ocurrir como una coinfección con otros virus (Acosta-Ampudia et al., 2018; John
Lednicky et al., 2016). Dado el potencial de MAYV para producir un brote, es necesario diseñar
estrategias para evitar una mayor propagación. Sin embargo, la falta de un sistema de clon
infeccioso para MAYV impide una comprensión completa de la transmisión, la patogénesis y la
respuesta inmune a MAYV. En consecuencia, desarrollamos y probamos clones infecciosos de dos
cepas de MAYV que estaban fácilmente disponibles a través del Centro de Control y Prevención de
Enfermedades (CDC): TRVL 4675 y TRVL 15537, virus del genotipo D aislados en la década de 1950
de un humano y un grupo de Mansonia venezuelensis mosquitos en Trinidad, respectivamente
(Powers et al., 2006). Inicialmente, producimos ambas cepas como clones infecciosos bajo un
promotor bacteriano SP6. Luego transferimos el genoma de MAYV de los clones que contenían SP6
a un nuevo esqueleto de plásmido bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV) y un
virus infeccioso rescatado para demostrar sus características de crecimiento viral en cultivos
celulares y un modelo de ratón. Las cepas derivadas de clones son similares tanto en la secuencia
de ADN como en la replicación in vitro e in vivo de las cepas parentales. Tales herramientas son
esenciales para avanzar en la investigación de MAYV.

2. Materiales y métodos

Declaración de Ética. Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones
de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de la Salud.
El protocolo de investigación fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales
(IACUC) de Virginia Tech.

Cultivo de células. Las líneas celulares BHK-21, Vero y LLC-MK2 se mantuvieron a 37 ° C en CO2 al
5%. La línea celular de mosquitos C6 / 36 se mantuvo a 28 ° C en CO2 al 5%. Todas las líneas celulares
se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% de suero fetal
bovino (FBS), 1% de aminoácidos no esenciales y 0,1% de gentamicina (en este documento
denominado DMEM 5). Los ensayos de placa se realizaron como se describió anteriormente (Weger
Lucarelli et al., 2017), excepto que las placas se fijaron después de dos días.

Generación de clones infecciosos MAYV. Las cepas MAYV TRVL 4675 y TRVL 15537 fueron un regalo
amable de Brandy Russell en la Colección de Referencia de Arbovirus (ARC) del Centro para el
Control y Prevención de Enfermedades (CDC). Los clones infecciosos MAYV se construyeron
utilizando un esqueleto CHIKV que contiene un promotor SP6 que se ha descrito anteriormente
(Coffey y Vignuzzi, 2011). Para amplificar el genoma de MAYV, extrajimos ARN viral utilizando el kit
Miniprep Plus de ARN Direct-zol (Zymo Research). Luego creamos cDNA con ProtoScript II Reverse
Transcriptase (NEB) usando un cebador de oligo (dT) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
A continuación, utilizamos la mezcla maestra Q5 High-Fidelity 2X (NEB) para amplificar el genoma
en tres fragmentos superpuestos. Los vectores se amplificaron de la misma manera utilizando
cebadores que contienen salientes 5 'que se superponen con los extremos 5' y 3 'del genoma viral.
Luego purificamos en gel los productos de la PCR y ensamblamos el ADN utilizando la Mezcla
Maestra de Ensamblaje de ADN HiBi (NEB) de NEBuilder. A continuación, transformamos la mezcla
de ensamblaje en NEB Turbo o E. coli estable de NEB y seleccionamos las colonias mediante
digestión de restricción después de minipreparaciones de plásmidos con el kit de minipreparación
de plásmidos Zyppy (Zymo Research). Las secuencias de clones se confirmaron mediante
secuenciación de Sanger. Para generar clones infecciosos MAYV bajo el control de un promotor de
citomegalovirus (CMV), utilizamos un esqueleto de plásmido que describimos anteriormente que se
basa en pcDNA3.1 (Weger-Lucarelli et al., 2015). Para construir estos clones, amplificamos todo el
genoma de MAYV a partir de los plásmidos que contenían SP6 previamente descritos junto con el
vector que contiene extremos superpuestos utilizando la mezcla maestra SuperFi 2x (Invitrogen). La
secuencia de estos clones se confirmó utilizando la secuenciación de próxima generación (NGS).

Transfección de plásmidos clon infecciosos. Transfectamos células HEK-293T usando JetPrime

(Polyplus) para la recuperación de virus infecciosos de los clones basados en CMV. El virus se recogió
del sobrenadante de transfección cuando se observó un efecto citopático (CPE) del 50 al 75%.
Cinética de crecimiento viral. Para BHK-21 y C6 / 36, las células se sembraron a 1 x 106 células por
pocillo, mientras que las células LLC-MK2 se sembraron a 2,5 x 105 células por pocillo, en placas de
12 pocillos. Las células en placa se infectaron a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 PFU /
célula (no se realizaron valoraciones posteriores). Las existencias de virus se diluyeron en medio
Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) con HEPES 25 mM y 1% de FBS. Se agregaron 100 μl
de inóculo viral a cada pocillo por triplicado y se incubaron a 37 ° C, o 28 ° C, en 5% de CO2, durante
1 h con balanceo cada 10 min. Después de la infección, las células se lavaron 1-2 veces con solución
salina tamponada con fosfato (PBS) y luego se agregaron 500 μl de DMEM-5 a cada pocillo. Luego
recolectamos el sobrenadante para determinar la cantidad de referencia de virus infeccioso. Los
sobrenadantes de cultivo se recogieron cada 24 h hasta que se observó un 50% a 75% de CPE y se
almacenaron a -80 ° C hasta la valoración por ensayo de placa.

Crecimiento in vivo y patogénesis en ratones. Se obtuvieron ratones CD-1 hembra de 3 semanas

de edad de Charles River (Wilmington, MA). Los grupos de ratones (n = 5 para los grupos
experimentales, n = 3 para el grupo de tratamiento simulado) se infectaron en la pata trasera
izquierda con 50 µl de 1 × 105 PFU de MAYV parental o derivado de clon. Los ratones fueron pesados
y monitoreados diariamente para detectar signos de enfermedad. Los ratones se anestesiaron con
isoflurano y luego se sangraron a través de la vena maxilar cada día durante tres días después de la
infección. Recolectamos sangre durante solo 3 días, ya que en estudios anteriores no observamos
virus infecciosos en ningún momento posterior (no se muestran los datos). Los ratones se
observaron durante hasta dos semanas después de la infección y se sacrificaron cuando se detectó
evidencia de enfermedad grave. Los criterios de eutanasia incluyeron pérdida de peso superior al
15% de su peso corporal y evidencia de enfermedades neurológicas como parálisis de las
extremidades posteriores y temblores. El suero se aisló por centrifugación de muestras de sangre
entera y se tituló utilizando el ensayo de placa de células Vero.

RT-PCR en tiempo real. El conjunto de cebador / sonda que se usó se obtuvo de Integrated DNA
Technologies (IDT, Coralville, Iowa). Las secuencias de los cebadores utilizadas se conservaron al
100% para ambas cepas de MAYV y amplificaron la región de nucleótido (nt) 5028-5127 en nsp3.
Los cebadores son los siguientes: nt5028-Forward - CCTCTGTTAGTCCTGTGCAATAC; nt5127-Reverse
- AAGGTGCTTAGGGAGCTACT; nt5060-sonda CACAG TGAAACTACTGTAAGCTTGAGCTCG. La sonda
tiene un reportero 5 'FAM y un extintor ZQ / Iowa Black FQ 3'. Se preparó un estándar MAYV para
cada cepa diluyendo el ARN generado con el kit mMESSAGEmMACHINE. El ARN viral en muestras
de suero de ratones extraídos se cuantificó utilizando el kit de sonda NEB Luna One-Step RT-qPCR
utilizando un termociclador en tiempo real CFX96 (Bio-Rad). Los valores de Ct se ajustaron a la curva
estándar para generar copias genómicas / ml de suero.

Estadística. Todas las comparaciones estadísticas se realizaron con GraphPad versión 8 (San Diego,
CA). Las comparaciones de los títulos víricos de la curva de crecimiento y los experimentos con
ratones se realizaron utilizando un ANOVA de dos vías con corrección de Tukey para correcciones
múltiples y se realizó un modelo de efectos mixtos que analizó el cambio de peso. Los datos de
supervivencia se compararon mediante la prueba de Mantel-Cox.

3. Resultados

Construcción de clones infecciosos MAYV TRVL 4675 y TRVL 15537. Para la construcción de los dos
clones MAYV (Steel et al., 2011; Weger-Lucarelli et al., 2016) se utilizó un clon infeccioso de CHIKV
con un esqueleto de pcDNA3.1 (Invitrogen). Los virus parentales se obtuvieron de los CDC y se
aislaron originalmente de Trinidad en 1954 (TRVL 4675) y 1957 (TRVL 15537). La secuencia de cada
virus se determinó mediante secuenciación de próxima generación (NGS). Usando la PCR,
amplificamos tres fragmentos virales superpuestos y el vector se ensamblaba utilizando el
Ensamblaje de Gibson. Cada clon posee un promotor de CMV y una ribozima del virus de la hepatitis
delta 3 'para garantizar una región no traducida (UTR) auténtica de 3' (Fig. 1). Se secuenció un clon
de plásmido individual utilizando NGS para cada cepa, y se identificó un cambio en cada clon en
comparación con el virus parental (Tabla 1). Para el clon infeccioso para TRVL 4675, observamos un
cambio sinónimo en la posición 2843, y para el clon infeccioso para TRVL 15537 observamos un solo
cambio no sinónimo en la posición del genoma 4989, lo que resulta en un cambio de lisina a ácido
glutámico en el gen nsp3 .

3.1. Propiedades de crecimiento in vitro de cepas MAYV parentales y derivadas de clon

Para examinar la cinética de la replicación in vitro de las cepas MAYV TRVL 4675 y TRVL 15537, (en
este documento denotadas como 4675 parentales y 15537 parentales, respectivamente) y sus
derivados clónicos (aquí llamados 4675 clonado y 15537 clonado, respectivamente), se infectaron
varias líneas celulares con cada cepa a una MOI de 0,1 y midió los títulos víricos infecciosos mediante
el ensayo de placa (Fig. 2). El perfil de replicación de cada cepa parental y sus respectivos clones fue
virtualmente idéntico. En células de mosquito C6 / 36 (Fig. 2A), no hubo diferencias estadísticas
entre la cepa parental y el virus derivado de clon infeccioso para ninguna de las cepas de MAYV en
ningún momento. En células BHK-21 de mamíferos (Fig. 2B), se observó una ligera diferencia de
replicación entre 4675 parentales y 4675 clonadas el día 1 después de la infección, pero esto se
resolvió en puntos temporales posteriores (p = 0.04 para la comparación del Día 1 entre 4675
parentalandas). Clonado 4675). En las células de mamíferos LLC-MK2 (Fig. 2C), se observó una
diferencia en los títulos infecciosos entre 4675 parentales y 4675 clonados (p = 0,0053) y entre
15537 parentales y 15537 clonados (p = 0,033) solo en el día 3 después de la inoculación, más allá
del punto máximo de replicación.

3.2. Patogenia de cepas MAYV parentales y derivadas de clon en ratones

Infectamos ratones CD-1 a través de la plataforma para evaluar la patogénesis de las 4675 cepas
parentales y 15537 parentales y sus 4675 recombinantes recombinantes y 15537 virus derivados
clonados. Los ratones infectados con las cepas parentales no experimentaron cambios de peso
estadísticamente diferentes en comparación con el virus derivado de clon (Fig. 3A). Además,
observamos una tasa de supervivencia del 100% para los ratones infectados con 4675 parentales o
4675 clonados. Una tasa de supervivencia del 80% para los ratones infectados con 15537 parentales
y una tasa de supervivencia del 40% para los ratones infectados con 15537 clonados (Fig. 3B), todos
los cuales no fueron estadísticamente diferentes. Ratones infectados con 15537 parentales y 15537
síntomas experimentados clonados que consisten en postura encorvada, parálisis de las
extremidades posteriores y pérdida de peso significativa a partir de 4 a 5 días después de la infección
(dpi). Recogimos muestras de suero los días 1, 2 y 3 después de la infección para evaluar la viremia
en los ratones infectados con las dos cepas originales de MAYV y los virus derivados de clones. Los
títulos virales infecciosos de 4675 parentales y 4675 clonados se pudieron medir en dpi 1 y dpi 2,
alcanzando un máximo de 6 log10 PFU / mL pero no fueron detectables a dpi 3 para ninguno de los
virus excepto por 1 ratón infectado con 4675 parental que tenía un título viral de 2 log10 PFU / mL.
Los títulos víricos de 15537 parentales y 15537 clonados se pudieron medir en dpi 1, alcanzando un
máximo de 2–3 log10 PFU / mL, y no fueron detectables en dpi 2 y dpi 3 (Fig. 4A). El ARN viral se
midió en muestras de suero para establecer la infección viral. El ARN viral fue detectable para 4675
parentales y 4675 clonados en todos los días posteriores a la infección. El ARN viral para 15537
parental y 15537 clonado solo fue detectable en los días 1 y 2 después de la infección (Fig. 4B). No
se observaron diferencias estadísticas entre el virus parental y el virus derivado de su clon en ningún
momento para el virus infeccioso o los genomas virales.

4. Discusión

MAYV es una amenaza global emergente con el potencial de causar epidemias similares a lo que ha
ocurrido con CHIKV y ZIKV. Por lo tanto, existe la necesidad de herramientas moleculares para
estudiar la replicación, transmisión y patogénesis del virus para desarrollar estrategias para
controlar la infección o diseñar vacunas. Si bien un informe anterior describe la construcción de un
clon infeccioso MAYV utilizado en la construcción de una vacuna atenuada viva (Weise et al., 2014),
estos autores no presentaron datos que compararan el virus derivado del clon con el virus parental.
Con este fin, generamos clones infecciosos para dos cepas diferentes de MAYV, TRVL 4675 y TRVL
15537, ambas aisladas en Trinidad en la década de 1950 (Anderson et al., 1957), y comparamos su
replicación en varias líneas celulares y ratones. Seleccionamos estas cepas, ya que estaban
disponibles en el CDC y se habían secuenciado previamente. El virus derivado de clon para cada cepa
es idéntico en secuencia al virus parental de tipo salvaje, excepto por una única diferencia de
nucleótidos. Clonado 4675, el virus derivado de clon de la cepa TRVL 4675, contenía un cambio
sinónimo en la posición 2843.15537 clonado, el virus derivado de clon de la cepa TRVL 15537,
contenía un cambio no sinónimo en la posición 4989, lo que resulta en un cambio de lisina a ácido
glutámico . Ninguno de los cambios de nucleótidos produjo una diferencia en la replicación de virus
in vitro o in vivo de los virus derivados de clones en comparación con las cepas parentales, por lo
tanto, los cambios de nucleótidos no cambiaron a la secuencia de tipo salvaje. Ambos virus
derivados de clones produjeron títulos elevados después de la transfección, lo que demuestra que
los plásmidos eran infecciosos.

Observamos que el virus derivado de clones era fenotípicamente similar a sus cepas parentales en
los ensayos de curva de crecimiento en líneas celulares de mamíferos y mosquitos. No observamos
diferencias estadísticas entre el virus derivado de clon y el virus parental durante la fase exponencial
de crecimiento para las células C6 / 36 o LLC-MK2. Sin embargo, se observó una ligera diferencia (p
= 0,0383) en el día 1 posterior a la infección entre el MAYV TRVL 4675 derivado de clon y el parental
en células BHK-21. Dado que no se observaron diferencias en otras líneas celulares o replicación en
ratones, podemos concluir que la replicación de las cepas derivadas del clon y de los padres es lo
suficientemente similar para usar en estudios de patogénesis futuros.

Estos datos sugieren que el virus derivado de un clon refleja con precisión la replicación del virus
parental en líneas celulares tanto de vertebrados como de invertebrados. Para probar la patogénesis
y evaluar la eficacia de la vacuna, es necesaria la infección productiva de ratones. Por lo tanto,
infectamos ratones CD-1 inmunocompetentes y observamos niveles estadísticamente similares de
viremia, pérdida de peso y mortalidad entre las cepas MAYV parentales y derivadas de clon, lo que
demuestra que los virus derivados de clon tienen características similares en ratones. Los ratones
infectados con 15537 parentales o 15537 clonados mostraron mayores tasas de mortalidad debido
a la neurovirulencia percibida, lo que resultó en parálisis de las extremidades posteriores, debilidad
y falta de coordinación. Los síntomas neurológicos de TRVL 15537 se han documentado previamente
como una diferencia en comparación con TRVL 4675, sin embargo, el mecanismo de esta aparición
no está claro (Aitken et al., 1960). Además, se ha demostrado que la neurovirulencia se produce en
alfavirus, específicamente en cepas de laboratorio adaptadas al cultivo celular, debido a que la unión
al sulfato de heparano puede aumentar la neuroinvasividad (Ryman et al., 2007). TRVL 4675 se ha
pasado siete veces en ratones lactantes y una vez en células BHK-21.

El historial de pases de TRVL 15537 no está del todo claro, ya que el CDC enumera 4 pasajes en un
huésped desconocido, uno en ratones lactantes y uno en células Vero. Cómo Aitken et al. informan
que el virus se aisló en ratones lactantes y que se produjeron pases adicionales en ratones lactantes
o en células de riñón de hámster (Aitken et al., 1960). No está claro qué papel tiene el historial de
pases de cada virus en la patogénesis observada en ratones CD-1.

Mientras observamos virus infecciosos en todos los ratones infectados con MAYV en el día 1
posterior a la infección, los títulos de TRVL 15537 parental y derivado de clon fueron muy bajos en
este momento y no fueron detectables posteriormente. Para asegurarnos de que los ratones
estuvieran infectados, confirmamos los niveles de ARN de MAYV en la sangre y encontramos niveles
detectables para todos los grupos infectados con MAYV en los días 1–2 posteriores a la infección.
Estos datos sugirieron que todos los ratones se infectaron productivamente, aunque el nivel de
replicación era específico de la cepa. Dado que no se observaron diferencias entre el virus parental
y el virus derivado del clon en el nivel de virus infeccioso o ARN en el suero en cualquier día posterior
a la infección, los clones infecciosos descritos aquí representan herramientas valiosas para estudiar
la patogénesis de MAYV en estudios futuros.

En resumen, nuestros resultados muestran que las cepas de MAYV probadas aquí se replican
eficientemente en cultivos celulares e infectan productivamente ratones inmunocompetentes.
Encontramos que el virus derivado de los plásmidos de clon infeccioso se replicó de forma similar al
virus parental en una variedad de líneas celulares. También mostramos que cada virus derivado de
un clon se comporta de manera similar a su contraparte paterna después de la infección de ratones
CD-1 genéricos en términos de viremia, niveles séricos de ARN, pérdida de peso y mortalidad. Estos
datos sugieren que el MAYV derivado del clon será útil para mapear los determinantes genéticos de
la patogénesis y puede proporcionar un punto de partida para la generación de una vacuna
recombinante.

Fig. 1. Organización del genoma de los clones infecciosos del virus Mayaro (MAYV).

El genoma de las cepas TWV del genotipo D MAYV, TRVL 4675 y TRVL 15537, se clonaron en un esqueleto de
plásmido pcDNA3.1 que contiene un promotor de citomegalovirus (CMV) y una secuencia de ribozimas del
virus de la hepatitis delta (HDV) 5 'y 3' para el genoma viral , respectivamente.
Fig. 2. Cinética de crecimiento de clones infecciosos del virus Mayaro clonado y parental (MAYV).

La cinética de crecimiento de dos cepas parentales de MAYV TRVL 4675 (4675 parental) y TRVL 15537 (15537
parental), y sus derivados clonados (4675 donados y 15537 clonados) se evaluó en mosquitos (A, C6 / 36),
hámster (B, BHK-21) y células de primates no humanos (C, LLC-MK2) por infección en una MOI de 0,1 PFU /
célula. Las células se infectaron por triplicado y luego se recogió el sobrenadante para analizarlo en un ensayo
de placa diariamente, incluido el día de la infección. Las barras de error representan desviaciones estándar de
la media. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de ANOVA de dos vías con corrección de Tukey
para comparaciones múltiples. En el día 1 para BHK-21, hay una diferencia estadística entre 4675 padres y
4675 pacientes (* P <0.05). En el día 3 para LLC-MK2 hay una diferencia estadística entre 4675 parentales y
4675 clonados (** P <0.01) y 15537 parentales y 15537 clonados (* P <0.05).
Fig. 3. Patogenia de MAYV infeccioso derivado de clon en ratones.

CD-1 hembra de 3 semanas de edad (n = 5, excepto para el simulacro que fue n = 3) se inocularon con 1 × 105
PFU de cualquiera de las dos cepas parentales de MAYV, TRVL 4675 (4675 parental)) o TRVL 15537 ( 15537
parental), o sus derivados clonados (4675 clonados y 15537 clonados) en la pata trasera izquierda y
monitoreados a lo largo del tiempo. (A) Peso de los ratones CD-1 después de la infección, representado como
un porcentaje del peso inicial. El análisis estadístico se realizó a través de un modelo de efectos mixtos y no
hubo diferencias estadísticas entre los pesos en ningún día entre las cepas parentales y sus correspondientes
clones. (B) Mortalidad de ratones CD-1 después de la infección. Hubo una tasa de supervivencia del 100% para
los ratones infectados con 4675 parentales y 4675 clonados, una tasa de supervivencia del 80% para los
ratones infectados con 15537 parentales y una tasa de supervivencia del 40% para los ratones infectados con
15537 clonados. El análisis estadístico se realizó mediante una prueba de Mantel-Cox y no hubo diferencias
estadísticas entre los virus parentales y clonados.

Fig. 4. La cinética de la replicación del MAYV clonado en ratones CD-1 imita al MAYV parental.

CD-1 hembra de 3 semanas de edad (n = 5, excepto para el simulacro que fue n = 3) se inocularon con 1 × 105
PFU de cualquiera de las dos cepas parentales de MAYV, TRVL 4675 (4675 parental) y TRVL 15537 ( 15537
parental), o sus derivados clonados (4675 clonados y 15537 clonados) en la almohadilla del pie trasero
izquierdo. Se realizaron hemorragias diarias en las mejillas durante 3 días después de la infección y se
determinaron los títulos de virus en los sueros recolectados mediante el ensayo de placa en células Vero (A)
y mediante qRT-PCR (B). El análisis estadístico se realizó mediante pruebas ANOVA de dos vías con la
corrección de Tukey para comparaciones múltiples y no se observaron diferencias estadísticas entre las cepas
parentales y los virus clon. L.O.D indica el límite de detección para cada ensayo. El L.O.D para el panel A es
1.69 log10PFU / mL y para el panel B es 1.46 log10Genomes / mL.