Teóricos de Anatomía e Histología

1er teórico de Anatomía: Microscopía

Autólisis: En el momento en que un preparado se extrae (hígado por ejemplo
se extrae de una rata), este órgano comienza a degradarse, a deteriorarse.

Para eso se debe que fijar (detengo proceso de autólisis) y después sigo con
todo el procedimiento.

Si una célula tiene un gran desarrollo del REG  su principal función es la

síntesis proteica.

Si una célula tiene un tipo específico de mitocondria  produce lípidos o

sustancias parecidas (ej: hormonas esteroides).

Microscopios

Microscopio óptico (óptico porque el sistema de visualización está dado por

lentes de cristal) de campo claro (porque el campo que se observa está
iluminado).

Componentes fundamentales de este tipo de microscopios:

● Estructura mecánica
● Estructura óptica
● Tienen una base, metálica
● Estativo
● Distintas lentes con las que se ve el preparado
● Lámpara, la cual se enciende para utilizar el
microscopio; por encima de ella comienzan las primeras lentes
del sistema óptico.
● Platina: lugar donde se apoya el preparado a observar;
tiene un agujero => la luz que sale de la lámpara.
● Las lentes son de dos tipos:

1. Lente Ocular: pegada al ojo. (Ocular o binocular)

1. Lentes Objetivos: varias lentes, cercanas al
preparado (están cerca del objeto)
  Aumentos del M.O

∼ Una de bajo aumento: en general tiene 10X, algunos

tienen de 5X (se le llama lupa porque tiene poco aumento)
∼ Una de aumento intermedio: de 40 o 45X
∼ Una de 100X: el máximo de aumento que se puede
tener con un microscopio óptico.

-Para ver cual es el aumento total observado hay que multiplicar el aumento
del ocular por el del objetivo. Si miro, por ejemplo, un preparado con un objetivo
de 10X tengo un aumento total de 100X; así con todas las lentes objetivo.
S
i
1000X es el máximo aumento que se puede obtener con un microscopio de
t este tipo.
r
a Unidades: Cuando uso un microscopio óptico la más utilizada es el micrón o
z micrómetro => 1 micrón es la milésima parte de un milímetro.
o
-Cuando utilizo un microscopio electrónico: Logra un mayor aumento, puedo
u medir tamaño de un núcleo, de una mitocondria, de un lisosoma. Se utiliza el
n nanómetro (le sigue al micrón), el armstrong y el picómetro (el más pequeño de
todos).
l
í Límite de resolución: Es la distancia mínima que debe existir entre dos puntos
n
para discriminarlos por separado.
e
a Se calcula con una fórmula: d= [0,61 (cte.). λ (longitud de onda de la luz con la
que se ilumina el preparado)]/ AN (apertura numérica).
a
l
Límite de resolución depende de dos cosas: De la longitud de onda de la luz
m
e que está reflejado a lo que veo (mayoría de las veces es la luz visible) y la
d apertura numérica (es una condición del microscopio), distintos microscopios
i tienen distintas aperturas numéricas.
o
La luz que sale de la lámpara atraviesa la lente condensadora, se condensa en
= ese agujero que hay debajo de la platina, atraviesa la platina y el preparado y
> llega al lente objetivo. No todos los rayos de luz que atraviesan el agujero y el
preparado llegan al lente objetivo, eso depende de la distancia a la que estén
α
separadas las cosas.
e
s
e
l
á
n
g
l
o

d
e

e
s Normalmente se utilizan longitudes de onda de
t
la luz visible (λ= 500 nm aprox) pero hay un
a
tipo especial de microscopio (microscopio de
m luz ultravioleta) que no se iluminan con luz
i visible, sino con luz UV (con una λ menos a la
t de la luz visible, 200 nm aprox).
a
d Límite de resolución del ojo humano: Lo que
más puede resolver es 0,2 mm, es decir lo más
chico que se puede ver con el ojo humano.

En el microscopio óptico de campo claro hay un

límite de resolución 1000 veces menor porque
el aumento máximo que se puede lograr es 1000X, máximo límite de resolución
es de 0,2 micrones (máximo a resolver).

Con luz ultravioleta, como tiene una λ de onda menor, el límite de resolución
es de 0,1 micrón.

Microscopio electrónico de barrido y de transmisión: No utilizan luz visible,

utiliza la que “emite un haz de electrones”, es mucho mayor la resolución a
lograr, en MEB: 2,5 nanómetros y en el MET: 1 nanómetro.

Microscopio de fuerza atómica: Es el microscopio que mayor resolución

logra: de 50 picómetro, se puede resolver a nivel atómico, por eso se llama de
fuerza atómica.

Calculando la AN: Cuando el elemento que separa la lente del preparado es

aire: η tiene un índice de refracción = 1. Difiere de cuando interpongo otra
sustancia, como el aceite de inmersión, que puede variar el índice de
refracción.

Tipos de microscopios (ópticos)

Microscopio óptico de campo oscuro: En estos microscopios hay

una modificación: entre la lámpara y la lente condensador se
interpone un disco opaco, el cual tiene un diámetro menor que el de
la lente condensadora, va a hacer que los rayos del medio no
puedan atravesar la lente condensadora y puedan llegar al
preparado, los únicos rayos de luz que van a llegar al preparado
 son los rayos que pasan por el costado de la lente condensadora.
Esto hace que, sobre un fondo oscuro, las células (o lo que se esté
viendo en el momento) se vea como con relieve porque la muestra
que se tiene está iluminada solamente con rayos tangenciales
sobre un fondo oscuro. Estos microscopios son muy útiles para
observar células vivas y cristales que aparecen en sedimentos
urinarios.

Microscopio de contraste de fases:

Tiene también la lámpara, la lente condensadora, el espécimen en la platina, se

interponen (primero entre la lámpara y la lente condensadora, y después entre
la lente objetiva y el ocular) unas
estructuras llamadas anillos ópticos. Estos
anillos tienen un circulo en el medio.
Permite que haya contraste de fases
porque la luz se desfasa y permite ver en
forma más oscura las zonas más gruesas,
y distinguirlas de las más finas en un
preparado. Utiliza las diferencias en el
índice de refracción de los rayos de luz.

*Pueden detectar fácilmente células vivas y

se utilizan mucho para ver movimiento celular.

Son microscopios ópticos, λ es la misma que en un microscopio óptico común,

la resolución también es la misma.

 Microscopio de interferencia: Es un estudio realizado para

ver cuál era la velocidad de desplazamiento de una célula de
un cultivo de tejido.

Tanto en el microscopio de contraste de fases como en el de interferencia no se

ven colores, solo se ven zonas más claras y más oscuras, los núcleos se ven
bien marcados en el centro.
La diferencia fundamental del microscopio de interferencia, con respecto al de
contraste de fase común, es que se pueden hacer cuantificaciones. En general,
se emite una serie de rayos que atraviesan el preparado y, paralelamente, se
emite otro rayo que es como si fuera un rayo patrón, como si fuera el estándar,
se puede medir cuánto se retrasa el rayo que atraviesa el preparado con
respecto al rayo patrón, se puede llegar a calcular la masa de la célula
observada.

☼ Microscopio de luz UV: Se utiliza para el estudio de los

ácidos nucleicos.

No es un microscopio óptico común; en lugar de tener lentes que tiene un

microscopio óptico común, tiene unas lentes hechas con cuarzo, las cuales
emiten luz UV. Esta luz UV posee un λ que oscila entre 200 y 250 nanómetros,
se obtiene una mayor resolución que con un λ de la luz visible.

Sirve solamente para aquellas moléculas que tienen la capacidad de absorber la

luz UV.

No se puede utilizar con observación directa por 2 razones:

1. La luz UV es invisible al ojo humano

2. UV daña el ojo

 Se debe captar lo que se quiere ver con (generalmente) una película

fotográfica o en una computadora, no se puede observar directamente, no tiene
ocular para ver.

Las sustancias que absorben, en general, la

luz UV son ácidos nucleicos porque las bases
púricas y pirimidínicas absorben este tipo de
luz. Además, hay algunos aminoácidos que
tienen un anillo carbónico que también tienen
la capacidad de absorben la luz UV.
 ☼ Microscopio de luz polarizada: sirvió para decidir la estructura
del tejido muscular.

Tiene una estructura como la de todos los microscopios ópticos, pero tiene un
filtro que se interpone entre la luz y la lente condensadora (se llama filtro
polarizador), y después tiene otro filtro que se interpone entre el objetivo y el ojo
humano (se llama filtro analizador).

La luz vibra en diferentes planos, se polariza. Este microscopio permite que

determinados preparados o tejidos que tienen estructura muy simétrica de sus
moléculas (moléculas alineadas de forma muy simétrica) tengan la capacidad
de rotar la luz polarizada; dicha propiedad se denomina birrefringencia. Ej:
Músculo estríado esquelético.

 La zona que rota la luz polarizada (que posee la propiedad de la

birrefringencia) se denomina anisotrópica (se ven más oscuras)  banda
A.

 Y la que no rota la luz polarizada se denomina isotrópica (se ven más

claras)  banda B.

 Se utiliza también para observar células del testículo (de Leydig).

☼ Microscopio de fluorescencia:

Fluorescencia: Fenómeno que ocurre cuando se ilumina algo, con una luz que
tiene una determinada longitud de onda y, la luz que emite ese tejido tiene una
longitud de onda diferente (ilumino con una luz de tal λ y la luz que devuelve el
tejido tiene una λ diferente, lo cual produce la fluorescencia).

Hay sustancias que son fluorescentes por naturaleza, las puedo iluminar,
generalmente con un haz de luz UV, y emiten fluorescencia. Hay otras que no y
hay que agregarles un compuesto fluorescente para estudiar algo
específicamente. Por ejemplo, la vitamina A tiene autofluorescencia.

 Microscopio confocal:

Tiene una base parecida al microscopio de fluorescencia; lo que se detecta es,

generalmente, la fluorescencia. Pero, tiene un sistema en el cual es como si
escaneara distintos niveles de un tejido, normalmente, con un microscopio de
fluorescencia, veo algo en 2D ≠ este tipo de microscopio tiene un sistema,
unido a un software de una computadora, donde se escanean distintos niveles
de ese preparado. Luego, la computadora junta todos esos resultados y se
logra observar una estructura 3D de la célula, es un aparato que siempre está
unido a una computadora.

Fundamento: La fuente luminosa no es luz solar, no es luz visible, sino que es

un láser que ilumina y dos lentes fundamentales (uno objetivo y otra llamada
lente del fototubo). El láser manda rayos que atraviesan la lente del fototubo y
pasan por un orificio (llamado puntiforme).

El camino de los rayos de luz: El rayo de luz atraviesa el orificio puntiforme,

da hacia un espejo (llamado espejo separador de haces), el cual manda rayos al
lente objetivo, los cuales llegan al preparado. Con un plano de foco vuelven los
rayos, siguen por un camino inverso hasta arriba, pasan por el segundo orificio
puntiforme y llegan al detector. Se hace todo un escaneo de varios planos.

Tipos de microscopios (electrónicos): Tienen límite de resolución enorme

porque no utilizan luz solar ni luz UV, sino que, como luminosidad, utilizan un
haz de electrones, el cual tiene una λ de 0,005 nanómetros.

Principio: Transporte de electrones entre el cátodo y el ánodo. Lo que se hace

es utilizar un filamento (minuto 51:10 aprox) como cátodo que libera una
cantidad de electrones que son los que después son atraídos por el ánodo.
Jamás se va a poder observar un preparado vivo con este tipo de microscopios
porque todo este sistema ocurre en el vacío absoluto. Y se ve todo en tonos
grises.

∮ Microscopio electrónico de transmisión:

Con este tipo de microscopio se ve la ultraestructura de una célula: Núcleo,

citoplasma y organelas.

Como tiene una resolución tan grande que no da una visión panorámica. Tiene
mucho aumento.

Las mitocondrias están en el límite de resolución del microscopio óptico; se

pueden apreciar con el verde Jano (colorante) como si fueran pequeños
filamentos.

∮ Microscopio electrónico de barrido

Límite de resolución un poco menor al MET: 1 nanómetro

Diferencia que tiene con el MET: Haces de electrones no atraviesan la célula

(o el preparado), sino que hacen un escaneo, un barrido por su superficie, se
puede observar una imagen 3D (en el MET es en 2D).

En este caso, se pueden ver las células tridimensionalmente, pero no se puede

observar su estructura interna.

*Microscopio de Fuerza Atómica: Último tipo de microscopio desarrollado.

Siempre está acoplado a una computadora. No es un microscopio óptico ya
que no tiene lentes de ningún tipo.

El principio sobre el cual trabaja es que tiene una sonda que pasa por la
superficie del preparado que se está viendo. Esta sonda tiene la capacidad de
detección. Tiene una estructura con un brazo que tiene una punta. Esta punta
“barre” la superficie; hay dos formas en las que puede actuar:
 1. Por barrido: la punta va pasando.
2. En lugar de escanear todo, hace como golpes (más
interrumpido) intermitentes

Ventajas:

-Puede trabajar con tejidos vivos (hasta con soluciones o células en ellas).

-La punta tiene un tamaño parecido al de un átomo, es tan sensible que puede
determinar la forma de moléculas.

Este microscopio tiene la capacidad de detectar moléculas, actúa a nivel

molecular, incluso a nivel atómico, tiene una resolución muchísimo mayor, por
eso se llama de fuerza atómica.

*Microscopia virtual: Permite trabajar a distancia (entre países) y, así, analizar

las muestras incluso si no se está en el lugar físicamente.

Posee equipos especiales llamados escáneres de preparados, los cuales

escanean el preparado y esta imagen escaneada va a parar a una computadora
que refleja la muestra en un monitor.

Técnicas Histológicas para observar células/tejidos/distintas sustancias

en los microscopios

Se pueden observar, en los microscopios, tejidos vivos. Para que esto ocurra,
hay diversas formas:

1) Haciendo un cultivo de tejido: Se saca determinadas células de un

animal, se ponen en recipientes especiales, que poseen sustancias
nutrientes que sirven para que la célula viva, y estas células crecen y se
desarrollan.

2) Se puede utilizar una tinción vital. La inyección del

colorante se hace con el animal todavía vivo.
 3) Tinciones supravitales: Al animal, en lugar de inyectarle
algo in vivo, le saco el hígado (por ejemplo) y le inyecto el
colorante a este, puedo observar algo en el preparado.

*Fijación: Proceso que detiene la autólisis, es decir, evita que el

preparado se vaya deteriorando. Además, tiene función bactericida,
impidiendo que bacterias y/o virus ataquen al órgano. (Se utiliza
formol)

*Deshidratación: ¿Por qué? Porque las moléculas de agua interfieren

en la acerlo, se utilizan concentraciones crecientes de etanol.
*Aclaración: Luego, se lleva a otro compuesto orgánico: xileno o xilol,
para sufrir el proceso de aclaración. Se llama así porque se
permite visualizar mejor lo que tengo.
*Inclusión: Luego, incluyo el preparado, el proceso de endurecimiento
se llama inclusión. Sirve para que no se rompa el preparado. La
inclusión se realiza en parafina,
*Se corta con aparatos especiales: micrótomos (cuando actúan a
temperatura ambiente) y criostatos (cuando se trabaja a 4°). El
micrótomo tiene cuchillas que van cortando en fetas.
Las rodajas que salen, al ser todas finitas, salen arrugadas, entonces
se las ablanda con agua a 37°.
*Coloración: Se utiliza la técnica histológica, en general, la coloración
se hace con dos colorantes: se pone un colorante básico y uno
ácido. Los más comunes: Hematoxilina y Eosina (H-E). Una vez
coloreado el preparado (primero se pone con un colorante, se
deja un tiempo, se enjuaga, después se deja el otro) se
deshidrata nuevamente para que las moléculas de agua no
interfieran en la visión.
 *Una vez coloreado, (ya se tiene sobre un portaobjetos de vidrio) se le
pone arriba un cubreobjetos, el cual protege al preparado.

Ortocromasia  corresponde a lo que hay que colorear. Pero, hay células que
tienen sustancias que modifican la estructura del colorante; hay componentes
celulares (por ejemplo, los proteoglucanos: en matriz del cartílago; mastocitos).
En general, la metacromasia se da en los colorantes básicos que tienen cargas
positivas.

Metacromasia  Cuando un colorante cambia su estructura debido a una

sustancia que está en esa célula o en ese tejido. En general, se da cuando
tengo un colorante en forma monomérica (por ejemplo, azul) y, al polimerizarse,
da otro color.

Metodologías más específicas (técnicas histológicas histoquímicas o

citoquímicas)

Sirven para hacer determinaciones de sustancias específicas.

*Métodos basados en la reacción de Schiff para aldehído: El reactivo de

Schiff es una leucofucsina (blanca) que se une a los grupos aldehídos y
modifica su color, y se convierten en color fucsia. Dos métodos que utilizan este
reactivo (este leucofucsina decolorada):

*Método de PAS.

*Método de Feulgen: También utiliza el reactivo de Schiff, con la diferencia de

que sirve para detectar ácidos nucleicos, específicamente ADN.

*Métodos histoquímicos para lípidos: Se utiliza para determinar lípidos

porque estos, si se hace una técnica histológica común, todos los solventes
orgánicos en los cuales se va sumergiendo el preparado disuelve los lípidos,
desaparecen las vacuolas lipídicas y queda un hueco blanco donde estaban
ubicados los lípidos. Se utilizan los colorantes sudanes.
● Métodos inmunohisto (o cito) químicos: Se utilizan
para determinar proteínas específicas.

a) Directos: Aquellos en los cuales, por ejemplo, quiero

determinar una hormona de la hipófisis, se inyecta
vasopresina de rata en un conejo, el conejo la reconoce como
extraña y forma anticuerpos anti-vasopresina de conejo,
puedo utilizar este anticuerpo para ver en qué célula de la
hipófisis se produce la vasopresina, se tiene que identificar
cuál es la célula específica que produce la hormona y
entonces se aplica el anticuerpo y se tiene la reacción
antígeno-anticuerpo solo en la célula donde se aplica.
b) Indirectos: Es más utilizado. Se usa, en general, un
anti-anticuerpo (se genera un anticuerpo contra el anticuerpo
primario) → inmunohistoquímica secundaria.
*Método histoquímico para enzimas: Si quiero determinar,
por ejemplo, una técnica enzimática, se tiene que utilizar un
sustrato para esa enzima, quiero determina. Aquellas partes
que posean mayor actividad de esta enzima determinada
aparecen coloreadas en color más oscuro, y las de menos
actividad en color más claro.

Inmunofluorescencia directa e indirecta:

a) Directa: Tengo un anticuerpo primario que está unido

a una sustancia fluorescente, y que se une a un antígeno.
b) Indirecta: Tengo un anticuerpo, marco el anticuerpo
secundario, que luego se une a una determinada zona del
anticuerpo primario.
*Radioautografía: Se utiliza para seguir procesos celulares, ósea,
se marcan sustancias con isótopos radiactivos y se puede seguir un
proceso dentro de la célula. Se inyecta una molécula marcada con
un isótopo radiactivo. Esta molécula se une a determinada
macromolécula y, después, se sigue toda una serie utilizando
función fotográfica, no se ve directamente al microscopio.

Hibridación in situ: Metodología, que se utiliza mucho en química,

y sirve para detectar, por ejemplo, la haploidía (número de
cromosomas que tiene una célula). Es una técnica muy utilizada
para el diagnóstico clínico de alteraciones cromosómicas.

Para la microscopia electrónica, el proceso es semejante pero no

es igual a para microscopia óptica:
* La fijación se hace con glutaraldehído y tetróxido de osmio, sirve
para fijar y “colorear” al mismo tiempo
* Se deshidrata, se aclara con xileno; en vez de incluirse en
parafina se incluye en una resina hipoxi (que es más dura) porque
los cortes son todavía más finos que para la MO.
* Luego, en vez de cortarse con un micrótomo común, se corta con
un equipo llamado el ultramicrótomo, el cual tiene cuchillas que son
con filo de cristal o de diamante.
*Las muestras, luego de cortadas con este ultramicrótomo, son tan
finitas que, en vez de ponerse en un portaobjetos de vidrio, se
recogen en una grilla, un entramado de cobre, el cual es el que se
pone en el microscopio para poder observarlo.