INTRODUCCIÓN

La PCR es una técnica de uso rutinario en los laboratorios de Genética Molecular,

mediante la cual se obtienen millones de copias de un fragmento determinado de ADN
(amplificación) a partir de una muestra de ADN denominado molde. Para realizar la
PCR hacen falta los siguientes reactivos.

Es una técnica de biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo
objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular,
partiendo de un mínimo.
Su utilidad es que tras la amplificación de mucho más fácil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas
(cadáveres) o hacer investigaciones científicas sobre el ADN amplificado.

Con esta metodología se pueden producir en el laboratorio múltiples copias de un

fragmento de ADN específico, incluso en presencia de millones de otras moléculas de
ADN. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa
que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. Sus
únicos requerimientos son que existan nucleótidos en el medio que son la materia base
para fabricar el ADN (los nucleótidos de adenina, timina, citosina y guanina), y una
pequeña cadena de ADN que pueda unirse a la molécula que queremos copiar para que
sirva como cebadora (el cebador, en inglés "primer").
PCR

La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica sirve para amplificar un

fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil
identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de
una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre
el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se
convierta en una técnica muy extendida, sobre todo en el ámbito de la investigación
forense, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevar a cabo dicha
técnica (1).

La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) es una herramienta invaluable para la

investigación en biología molecular. Se usa a diario en laboratorios de todo el mundo en
una amplia gama de aplicaciones como clonación, análisis de expresión génica,
genotipado, secuenciación y mutagénesis. Ofrecemos productos para ayudarlo a lograr
el éxito de PCR para prácticamente cualquier aplicación (2).

Conceptos de la PCR

 Sensibilidad: se refiere a la cantidad mínima de ADN necesaria para que se

produzca la amplificación, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los
falsos negativos, ya que puede que una muestra sea positiva pero sea dada como
negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.

 Especificidad: se refiere a la obtención de un solo producto amplificado. Viene

determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde.
De esta forma, si los oligos tienen más de un sitio al que se pueden unir
aparecerá más de un producto amplificado. Se relaciona con los falsos positivos,
ya que puede que una muestra sea negativa, pero sea dada como positiva porque
se ha amplificado una región de ADN no diana o que no se buscaba amplificar.

 Eficiencia: se refiere a la amplificación máxima que se puede obtener en un

número determinado de ciclos.

 Fidelidad: se refiere a los errores que comete el ADN polimerasa durante la

amplificación. Este concepto es de especial importancia en la secuenciación,
 pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar
falsos positivos y/o negativos (3).

Ciclo de amplificación
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de
temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes
temperaturas. La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura.
Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold")
a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final del proceso para la
extensión de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo
aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros. Estos incluyen la
enzima usada para la síntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y de los
dNTP en la reacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como la longitud
del ADN que se desea amplificar.

Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opción de realizar la reacción de

PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicará
calor a la parte de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los
laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que
no incluían este sistema tenían que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El
objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la
condensación de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran dos fases:líquido y
gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo,
calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso físico,
conservando casi intacto el volumen de la muestra.

Inicio

Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se

está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9
minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por
calor.

Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está
constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento
(94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide
realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga
la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en
la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la
desnaturalización.

Alineamiento o unión del cebador

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su

secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura
a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento.
Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se
forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde.
La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar
ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser
amplificada.

Extensión o elongación de la cadena

Actúa la polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y

partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La
polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde
añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato
de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se
extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para
la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente
72 °C). El tiempo de extensión depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la
longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente
usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un
minuto.
Elongación final

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos
tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple
restante sea totalmente ampliado.

Conservación

Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para
conservar la reacción a corto plazo.

La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en pequeños

tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.

Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean

técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a
su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a
su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos
grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la
PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.4 El/los tamaño/s de los
productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN,
el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto
con los productos de PCR (1).

PCR TRANSCRIPTASA INVERSA

La transcriptasa inversa, transcriptasa reversa o retrotranscriptasa es una enzima de tipo
ADN-polimerasa, que tiene como función sintetizar ADN de doble cadena utilizando
como molde ARN monocatenario, es decir, catalizar la retrotranscripción o
transcripción inversa. Esta enzima se encuentra presente en los retrovirus. Su nombre
obedece a que el proceso normal de la transcripción, la que se puede llamar "directa",
codifica el ARN a partir de la secuencia inicial de ADN, y no al revés. Una forma
sencilla de síntesis de ADN de doble cadena a partir de transcriptasa inversa, también
llamada ADN/ARN-polimerasa dirigida, sería partir de un cebador cola de poli-T que
establecería bases complementarias con la cola de poli-A del ARN transcrito de la hebra
que se va a sintetizar, lo que forma un híbrido ARN/ADN. Dicho híbrido podría
separarse mediante ribonucleasas, y después, con la acción de una ADN-polimerasa y
un nuevo cebador, ser completada la hebra de ADN de doble cadena. En la biología
molecular y la bioquímica, la transcriptasa inversa, también conocida como ADN
polimerasa dependiente de ARN, es una enzima ADN polimerasa que transcribe una
sola cadena de ARN en una sola cadena de ADN. También ayuda en la formación de
una doble hélice de ADN una vez que el ARN ha experimentado una transcripción
inversa en una sola cadena de cDNA. La transcripción inversa implica la síntesis de
ADN a partir del ARN (5).

Es una variante de PCR, una técnica de laboratorio comúnmente usada en biología

molecular para generar una gran cantidad de copias de ADN, proceso llamado
"amplificación". En el RT-PCR, sin embargo, una hebra de ARN es retrotranscripta en
ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa inversa, y el
resultado, se amplifica en un PCR tradicional. PCR en Transcripción Reversa no debe
ser confundido con el PCR en tiempo real, PCR cuantitativa o Q-PCR, el cual a veces
de manera errónea se abrevia como RT-PCR. La amplificación exponencial mediante
PCR en Transcripción Reversa supone una técnica altamente sensible, que puede
detectar un número de copias de ARN muy bajo. Los principales usos de la RT-PCR
están relacionados con el campo del Diagnóstico Molecular y con la investigación
científica. Puede utilizarse como método de detección molecular de genes, para estudiar
el genoma de virus de ARN como los retrovirus (tales como el VIH) o el virus de la
gripe (virus de la influenza. Otro de sus usos se relaciona con la cuantificación de la
expresión génica, mediante la combinación de esta técnica con el análisis de -- Northern
Blot. Una de las características más importantes es que en el proceso de RT-PCR, el
ADNc generado ya no lleva los intrones que sí tendría el el ADN original. De este
modo, al expresar el ADNc producto de la RT-PCR, se generará un ARNm formado
exclusivamente por exones. Esto ha permitido darle a esta técnica uno de sus usos más
importantes: insertar genes eucariotas en organismos procariotas. (6)

Proceso de transcripción inversa

La transcriptasa inversa crea ADN de cadena simple de ARN de una plantilla. Los virus
que carecen de la transcriptasa inversa sintetizan su ADN gracias a la δ polimerasa
codificada del ADN de la célula huésped, que por error confunde el ARN del virus
como un iniciador y sintetiza un ADN de doble cadena por la similitud del mecanismo
de eliminación de imprimación, donde el ADN de nueva síntesis desplaza el ARN de la
plantilla original. El proceso de transcripción inversa es muy propenso a errores y es
durante este paso que las mutaciones pueden ocurrir. Estas mutaciones pueden causar
resistencia a los medicamentos. (5)

PCR EN TIEMPO REAL

La PCR en tiempo real es una técnica que combina la amplificación y la detección en un
mismo paso, al correlacionar el producto de la PCR de cada uno de los ciclos con una
señal de intensidad de fluorescencia. Posee características importantes como alta
especificidad, amplio rango de detección (de 1 a 107 equivalentes genómicos de la
secuencia blanco) (Brechtbuehl et al. 2001) y rapidez en la visualización del producto
ya que no es necesario realizar una electroforesis posterior. Los ensayos de la PCR en
tiempo real son entre 10,000 y 100,000 veces más sensibles que las pruebas de
protección por ARNasa,1 1,000 veces más sensibles que la hibridación por Dot blot2 y
pueden detectar diferencias de una sola copia del ADN (Wong y Medrano 2005).
Además, se ha reportado que para la PCR convencional (punto final), la cantidad final
de producto amplificado puede verse afectada por inhibidores, saturación de la reacción
o bien por falta de una estandarización adecuada. Entonces, los resultados de la PCR
punto final pueden no tener relación entre la cantidad de ácidos nucleicos que había al
inicio de la reacción y la concentración final del producto amplificado. Debido a la
enorme proyección que tienen los ensayos de la PCR en tiempo real como herramienta
útil y extremadamente sensible en investigación clínica, industrial, biológica y
biomédica, en este capítulo se revisan las bases teóricas de esta técnica, sus
aplicaciones, el análisis de resultados y se da un ejemplo específico para realizar un
ensayo de cuantificación.

Equipos para realizar la PCR en tiempo real

Los equipos para llevar a cabo la PCR en tiempo real incluyen un termociclador y una
unidad capaz de detectar señales fluorescentes (fluorómetro) para monitorear el
progreso de la reacción de amplificación, así como un Hardware y un Software para la
captura y el análisis de los datos, respectivamente. El termociclador del equipo debe ser
capaz de mantener una temperatura uniforme para todas las muestras y ser lo
suficientemente rápido en la transición de temperaturas de una etapa a otra
(desnaturalización del ADN molde, alineamiento de los oligonucleótidos y síntesis). El
sistema fluorométrico consiste en una fuente de energía para excitar a los fluoróforos (a
una determinada longitud de onda de excitación) y un sistema de detección, que permita
monitorear la señal emitida (a una longitud de onda de emisión) (Figura 1). La fuente de
energía que proporciona la luz de excitación para los fluoróforos puede provenir de una
lámpara (tungsteno), una resistencia (diodo emisor de luz) o un láser. Las diferentes
longitudes de onda de emisión se detectan con dispositivos que incluyen filtros,
multiplicadores y fotodetectores. Entre los equipos que utilizan una lámpara como
fuente de excitación, se encuentran los equipos ABI Prism 7000 o el modelo 7500 de
Applied Biosystem, los modelos Mx4000 y Mx3000P de Stratagene y el modelo iCycler
iQ de Bio-Rad. Los equipos que utilizan una resistencia son el LightCycler de Roche,
SmartCycler de Cepheid, Rotor-Gene de Corbett y el DNA Engine Opticon de MJ
Research. El modelo 7900HT ABI Prism de Applied Biosystems utiliza láser (Wong y
Medrano 2005). Sistemas de detección usados en la PCR en tiempo real Los fluoróforos
utilizados para seguir la amplificación del ADN durante la PCR en tiempo real pueden
ser de dos tipos: a) fluoróforos con afinidad por el ADN y b) sondas específicas para
fragmentos del ADN, es decir, que sólo emiten fluorescencia cuando se ha amplificado
un fragmento del ADN de interés (blanco). PCR en tiempo real 179 a) Fluoróforos con
afinidad por el ADN Estos fluoróforos emiten fluorescencia cuando se unen al ADN. La
intensidad de la fluorescencia se incrementa proporcionalmente a la concentración del
ADN de doble cadena. Inicialmente, se utilizaba bromuro de etidio, pero su uso no es
recomendable porque no discrimina de manera eficiente entre ADN de cadena doble o
sencilla. Por otro lado, al ser un agente que se intercala en el ADN, se ha reportado que
interfiere con la polimerización. También, existen otros como BEBO, YOYO-1 y
TOTO-1 pero no son usados cotidianamente. El compuesto más utilizado es SYBR
Green, el cual se une al surco menor del ADN de doble cadena. Mientras más ADN de
doble cadena haya en el tubo de reacción, mayores serán la unión y la señal de
fluorescencia del SYBR Green (Figura 2A). Este sistema es muy económico y permite
el empleo de un solo fluoróforo en diferentes ensayos. Sin embargo, presenta varias
desventajas, ya que no es posible hacer reacciones múltiples o multiplex (en donde se
amplifican varios genes en la misma reacción), además de que la señal emitida no es
específica, porque el fluoróforo se une a cualquier amplicón del ADN. Por lo anterior,
para un uso correcto del SYBR Green en la PCR cuantitativa es obligatorio verificar la
especificidad de la señal, analizar la curva de disociación3 y comprobar que la señal de
fluorescencia obtenida se debe sólo a la amplificación del blanco (Figura 2B). La
estandarización para obtener un solo producto de amplificación, en algunos casos,
consume mucho tiempo y reactivos.

Sondas específicas
Los sistemas de detección específicos para una secuencia de interés se pueden dividir en
tres tipos:

a) sondas de hidrólisis

b) sondas de hibridación

c) sondas de horquilla

Todas se basan en el principio FRET (Flourescence Resonance Energy Transfer por sus
siglas en inglés), que consiste en la transferencia de energía entre dos fluoróforos: un
donador (reportero) y un aceptor (apagador o quencher), los cuales emiten fluorescencia
a diferente longitud de onda. Cuando el reportero y el apagador se encuentran próximos,
el apagador absorbe toda la fluorescencia del reportero. Cuando este par de moléculas se
separa, la fluorescencia del reportero no puede ser absorbida por el apagador y en
consecuencia puede ser detectada por el fotodetector.

Sondas de hidrólisis

Entre las más utilizadas se encuentran las sondas TaqMan que se conocen también
como sondas 5’ nucleasas (ya que utilizan la actividad 5’ exonucleasa del ADN
polimerasa). En este sistema se utiliza una sonda, es decir, un oligonucleótido específico
(~20 bases) para la secuencia del gen de interés marcado con dos fluoróforos, un
reportero unido al extremo 5’ y un apagador en el extremo 3’. La longitud de la sonda es
la distancia entre los dos fluoróforos, de manera que la fluorescencia del reportero está
apagada por el fenómeno FRET. La actividad 5’ exonucleasa del ADN polimerasa corta
los nucleótidos de la sonda durante la amplificación, los fluoróforos se separan y se
observa la señal de fluorescencia. Es decir, la hidrólisis de la sonda provoca un
incremento en la señal del reportero y ésta aumenta proporcionalmente al incremento
del amplicón. Algunos ejemplos de fluoróforos reporteros son FAM, VIC y NED, entre
los apagadores se encuentran TAMRA, DABCYL y BHQ.

Sondas de hibridación
En este caso se utilizan dos sondas específicas que hibridan con la secuencia del ADN
de interés. Una de ellas está marcada con un donador y la otra con un aceptor. La señal
del fluoróforo aceptor es monitoreada por el sistema de detección conforme se da la
amplificación del ADN, así la cantidad de oligonucleótidos unidos será mayor por lo
que se incrementará la intensidad de la fluorescencia. Este sistema sigue la señal del
fluoróforo aceptor de forma opuesta a la sonda de hidrólisis, que siguen la señal del
reportero o donador.

Sondas de horquilla

En estas sondas, un oligonucleótido marcado en su extremo 5’ con un reportero y el 3’

con un apagador, se encuentran formando una horquilla, estructura que los mantiene
cercanos para poder llevar a cabo la transferencia de energía y mantener al reportero
apagado. Al unirse a la secuencia de interés, la horquilla se extiende, aumentando la
distancia entre el apagador y el reportero, permitiendo detectar la fluorescencia de este
último. Estas sondas de horquilla son altamente específicas. Existen varias que utilizan
este principio como los molecular beacons, los scorpions, los sunrise primers así como
los LUX primers (7)

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Tamay, D.L., Ibarra, C. y Velasquillo, C., “Fundamentos de la reacción en cadena de
la polimerasa (pcr) y de la pcr en tiempo real”, Investigación en Discapacidad,
Mediagraphic, 2013, 2 (2): 70-78.

2. Conceptos de genética. 1999. W.S. Klug y M.R. Cummings. Prentice Hall.

3. ADN recombinante. Introducción a la ingeniería genética. 1983. J.D. Watson, J.

Tooze y D.T. Kurtz. Labor.

4. Costa, J. (2004). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo

real. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, 22(5), 229-305.

5. Liu W. y D. A. Saint. 2002. A new quantitative method of real time reverse

transcription polymerase chain reaction assay based on simulation of polymerase chain
reaction kinetics. Analytical Biochemistry 302: 52-59.
6. Bustin S. A. 2000. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse
transcription polymerase chain reaction assays. Journal of Molecular Endocrinology
25:169-193.

7. Tamar C. PCR: esencial técnica. Acta Med Colom. 2014;(31):345-400.

8. Rodin. [Internet]. PCR; 2012-2013 [citado 7 Agosto 2018]. Disponible en:

https://books.google.com.pe/books?
id=iDl5AgAAQBAJ&pg=PA1&dq=PCR&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwihhKmRndrcA
hVHpFkKHQpiC94Q6AEIKTAA#v=onepage&q=PCR&f=false

9. Márquez M. Diagnostico molecular PCR. Universidad Nacional de Colombia, Sede

Medellín. Facultad de ciencias. 20014:59-83

10.Rodríguez AR. Manual de prácticas de genética y cuaderno de trabajo. UNAM.

México. 2015; (6):45-67.