See

discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/256980357

Ácido Abscísico: Importante modulador de la

Ruta Fenilpropanoide en bayas de vid cv.
Carménère.

Thesis · February 2010

CITATIONS READS

0 767

1 author:

Luis Villalobos
University of Chile
10 PUBLICATIONS 14 CITATIONS

SEE PROFILE

Some of the authors of this publication are also working on these related projects:

Water deficit effects on stomatal conductance and plant hydraulic traits of grapevine varieties Cabernet
Sauvignon, Carmenere and Syrah grown in the Cachapoal Valley View project

All content following this page was uploaded by Luis Villalobos on 06 June 2014.

The user has requested enhancement of the downloaded file.

 FACULTAD DE CIENCIAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
SECCIÓN BIOQUÍMICA

Ácido Abscísico: Importante modulador de la Ruta

Fenilpropanoide en bayas de vid cv. Carménère.

Tesis presentada a la Pontificia Universidad Católica de Valparaíso como parte de los requisitos
para optar al título de Bioquímico.

Por

LUIS EDUARDO VILLALOBOS GONZÁLEZ

Director de tesis Dr. Claudio Pastenes Villarreal

Comisión de tesis Dr. Jorge Escobar Fica
Dr. Carlos P. Sotomayor López

Marzo, 2011
Agradecimientos

Esta tesis es producto final de un ciclo en vida el cual me satisface, emociona y enorgullece. Sin
embargo, todos estos sentimientos que me llenan jamás hubiesen existido sin el apoyo de todas
aquellas personas que me acompañaron durante este proceso y depositaron su fe en mí.

Quiero agradecer de todo corazón por su amor, cariño y comprensión a mis Padres Luis y
Verónica, quienes me entregaron las herramientas básicas para mi desarrollo personal y a mis
hermanos Pedro y Verito, los cuales admiro por su fuerza, dedicación y apoyo.

A mi querida polola Katherine por su comprensión, paciencia y empuje. Sin ti este proceso
hubiese carecido de lo hermoso de la vida, tu apoyo fue fundamental tanto en situaciones simples
como complejas, entregándome siempre el amor y cariño que me permiten seguir adelante frente
a las adversidades.

Quiero agradecer también a mis abuelas Alicia y Miriam, por su amor, apoyo y cariño, y
dedicarle este éxito a mi Abuelo Eduardo, quien fue un excelente profesional e investigador.

A Claudio Pastenes, un excelente tutor y amigo, quien me integró a su laboratorio, me ayudó a

desarrollar la mayoría de los conocimientos relacionados al estudio de plantas y además me
permitió continuar en el desarrollo de investigaciones en esta área el cual me satisface
completamente.

A Álvaro Peña y Héctor Morales del laboratorio del Laboratorio de Cromatografía y Análisis de
Metabolitos Secundarios y compuestos antioxidantes en Plantas.

A Freddy Ibáñez y Úrsula Arriagada, por su amistad y cooperación en el desarrollo de esta tesis.

A mis amigos del Laboratorio, María José, Sebastián y Diego, con quienes compartí buenos
momentos de amistad y me entregaron grandes conocimientos agronómicos, y por supuesto a mis
nuevas amistades Daniela y Alejandra.
A mis amigos de siempre Christian, Jorge, Ariel, Felipe, Ignacio y Matías, por su amistad,
momentos de camaradería y deporte.

Finalmente quiero agradecer a todos mis profesores de la PUCV que participaron en mi

desarrollo profesional ya que gracias a sus conocimientos entregados permitieron desarrollarme
en cualquier área de investigación.
Glosario de Abreviaturas

AAO AB aldehído oxidasa

ABA ácido Abscísico
ABA-GE ABA glucosa éster
ANR antocianidin reductasa
ANS antocianidin sintasa
bHLH hélice-loop-hélice básico
cDNA DNA complementario
CHI chalcona isomerasa
CHS chalcona sintasa
DAD detector de arreglo de diodos
DDP días después de pinta
DEPC dietilpirocarbonato
DFR dihidroflavonol reductasa
DNA ácido desoxirribonucleico
dNTP desoxinucleotido trifosfato
eq. equivalentes
ES error estándar
EtOH etanol
F3`5`H flavonoide 3`5` hidroxilasa
F3`H flavonoide 3` hidroxilasa
F3H flavanona 3-hidroxilasa
FLS flavonol sintasa
g fuerza centrífuga relativa
g gramos
h hora
HCl ácido clorhídrico
HPLC cromatografía líquida de alta resolución
IIA alcohol iso-amílico
L litro
LAR2 leucoantocianidin reductasa
LiCl cloruro de litio
M molar
MgCl2 cloruro de magnesio
min. minutos
NaHSO3 bisulfito de sodio
NCED 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa
OMT orto metiltransferasa
p/v relación peso-volumen
PAL fenilalanina amonio-liase
qPCR reaccion en cadena de polimerasa cuantitativo
RNA ácido ribonucleico
UFGT UDP glucosa:flavonoide 3-o-glucosiltransferasa
v/v relación volumen-volumen
Índice General

1. Resumen ................................................................................................................................ 1
2. Presentación del Problema .................................................................................................. 2
3. Introducción .......................................................................................................................... 4
3.1. Fisiología de la maduración de la uva ............................................................................... 4
3.2. Ácido Abscísico (ABA) .................................................................................................... 7
3.3. Ruta Fenilpropanoide ...................................................................................................... 10
3.4. Regulación de la Ruta Fenilpropanoide .......................................................................... 13
3.5. Compuestos derivados de la ruta fenilpropanoide .......................................................... 15
4. Hipótesis .............................................................................................................................. 16
5. Objetivo General ................................................................................................................ 17
6. Objetivos Específicos .......................................................................................................... 18
7. Materiales y Métodos ......................................................................................................... 19
7.1. Material Vegetal .............................................................................................................. 19
7.2. Extracción y Determinación de la concentración interna de (S)-cis-ABA en bayas. ..... 20
7.3. Análisis de la expresión de genes de la Ruta Fenilpropanoide. ...................................... 21
7.3.1. Extracción del RNA total de la baya........................................................................ 21
7.3.2. Síntesis del cDNA .................................................................................................... 22
7.3.3. Comparación Cuantitativa de la expresión de genes en bayas. ............................... 22
7.4. Análisis de metabolitos secundarios. .............................................................................. 23
7.4.1. Pretratamiento de la muestra. ................................................................................... 23
7.4.2. Antocianos Totales................................................................................................... 23
7.4.3. Taninos Totales ........................................................................................................ 24
7.4.4. Análisis de Proantocianidinas libres y Flavonoles................................................... 24
7.4.5. Análisis de Antocianos. ........................................................................................... 25
7.5. Análisis Estadístico. ........................................................................................................ 25
8. Resultados ........................................................................................................................... 26
8.1. Efecto sobre la concentración interna de (S)-cis-ABA en bayas tratadas con ABA. ...... 26
8.2. Efecto del ABA sobre peso total y peso de hollejo de bayas. ......................................... 28
8.3. Efecto del ABA sobre el metabolismo primario de bayas. ............................................. 30
 8.4. Efecto del ABA sobre la expresión de genes reguladores y de síntesis de la ruta
fenilpropanoide........................................................................................................................... 32
8.5. Efecto del ABA sobre la composición fenólica de bayas. .............................................. 38
8.5.1. Efecto del ABA sobre el contenido de Antocianos. ................................................ 38
8.5.3. Polifenoles de bajo peso molecular.......................................................................... 47
8.5.4. Proantocianidinas (PAs)........................................................................................... 47
8.5.5. Flavonoles ................................................................................................................ 50
9. Discusión.............................................................................................................................. 52
10. Conclusión ........................................................................................................................... 58
11. Bibliografía.......................................................................................................................... 59
12. Material Suplementario ..................................................................................................... 71
Índice de figuras y tablas

Figura 1. Anatomía baya de vid Vitis vinífera ................................................................................ 5

Figura 2. Desarrollo de la baya ...................................................................................................... 6
Figura 3. Ruta de biosíntesis del ABA............................................................................................. 9
Figura 4. Ruta Fenilpropanoide.................................................................................................... 12
Figura 5. Racimos de vid en pinta................................................................................................. 26
Figura 6. Concentración Interna de ABA ..................................................................................... 27
Figura 7. Análisis Básicos 1 .......................................................................................................... 29
Figura 8. Análisis Básicos 2 .......................................................................................................... 31
Figura 9. Niveles de expresión VvPAL.......................................................................................... 33
Figura 10. Niveles de expresión VvDFR, VvANS y VvUFGT ....................................................... 34
Figura 11. Niveles de expresión VvMYB4A y VvMYBA1 .............................................................. 36
Figura 12. Niveles de expresión VvLAR2...................................................................................... 37
Figura 13. Concentración Total de Antocianos ............................................................................ 39
Figura 14. Cromatograma HPLC Antocianos .............................................................................. 40
Figura 15. Concentración Antocianos Glucósidos, Acetilglucósidos y Cumarilglucósidos......... 42
Figura 16. Concentración Antocianos Trihidroxilados y Dihidroxilados .................................... 44
Figura 17. Concentración Antocianos Glucósidos ....................................................................... 46
Figura 18. Cromatograma HPLC Polifenoles de bajo peso Molecular ....................................... 47
Figura 19. Concentración de Taninos........................................................................................... 49
Figura 20. Concentración de Flavonoles ...................................................................................... 51
Figura 21. Espectros Absorción Flavonoles ................................................................................. 72

Tabla 1. Resúmen fechas aplicación ABA y recolección muestras ............................................... 20

Tabla 2. Resumen Partidores ........................................................................................................ 71
1. Resumen

El inicio de la maduración en el fruto de la vid, es el principal responsable sobre el contenido

final de los flavonoides. Recientemente, la fitohormona ácido abscísico (ABA) ha sido propuesto
como una de las principales señales desencadenantes del inicio de la maduración en frutos no
climatéricos, afectando principalmente al metabolismo secundario en las pieles de las bayas. Con
el fin de comprender mejor el mecanismo por el cual ABA afecta la expresión de genes de la ruta
fenilpropanoide y sus correspondientes metabolitos, se realizaron aplicaciones de ABA en
periodo de pre-pinta sobre bayas del cv. Carménère. Las aplicaciones de ABA incrementaron los
niveles de expresión de VvMybA1, VvMyb4A, VvPAL, VvDFR, VvANS, VvUFGT y VvLAR2, así
como el contenido de flavonoides en las pieles de las bayas desde pinta hasta vendimia.
La coloración de los frutos tratados con ABA se inició antes que los del testigo, acompañado de
un incremento en el contenido de azúcar y una disminución de la acidez. En cuanto a la síntesis
de antocianinas, los transcritos VvPAL, VvDFR, VvANS, VvUFGT y VvMybA1 mostraron un
patrón de acumulación similar al contenido de ABA durante toda la temporada alcanzando sus
más altos niveles en envero, mientras que los antocianos alcanzaron su máxima concentración a
los 35 de DDP, para posteriormente disminuir hasta la cosecha. La aplicación de ABA además
resultó en la acumulación de antocianos de una mayor estabilidad y, por lo tanto, de mejor
calidad. En relación con la biosíntesis de taninos, los niveles de expresión de VvLAR2
disminuyeron desde pinta hasta los 35 DDP para todos los tratamientos, aunque se observó un
incremento en las bayas tratadas con ABA en comparación con el testigo y, a continuación, a
partir de 65 DDP en adelante se observó un nuevo incremento para todos los tratamientos
manteniéndose las diferencias observadas anteriormente entre los tratamientos. Tal patrón fue
paralelo a la concentración de taninos. Finalmente en la presente investigación se explica la fuerte
relación que existe al aplicar ABA en periodo de pinta sobre la calidad final de la baya regulando
la principal ruta de metabolitos secundarios responsables del estilo y calidad de vinos.

1
2. Presentación del Problema

Las hormonas controlan el desarrollo de plantas coordinando cambios en la expresión de

numerosos genes en etapas cruciales del desarrollo en los diferentes tejidos de manera órgano
específica. En la vid están implicadas en el control de varios aspectos del desarrollo del fruto, en
especial, el importante proceso de maduración, el cual es determinante en la composición
química resultante del metabolismo primario y secundario en bayas de vid vinífera. Entre los
metabolitos primarios, destacan la concentración de hexosas y de ácidos orgánicos. Los
metabolitos secundarios, por otra parte, derivan de múltiples rutas metabólicas, no obstante la de
los fenilpropanoides concentra la mayor atención por su impacto en las características
organolépticas del vino final asociadas al color, astringencia, cuerpo y amargor.

El Ácido Abscísico (ABA), es una clásica hormona vegetal de respuesta a diferentes tipos de
estrés. En la vid, ha sido principalmente asociada al estrés hídrico y, además, recientemente ha
sido asociada al proceso de iniciación de la maduración de la baya (Giribaldi et al. 2009; Koyama
et al. 2010; Wheeler et al. 2009). Es por esto que una de las prácticas agronómicas más
ampliamente identificadas con la vitivinicultura de producción de vinos de alta gama es la del
estrés hídrico, puesto que con esto se aumenta la concentración de esta fitohormona en las bayas.
A pesar de que el estrés hídrico promueve la acumulación de ABA en bayas, con un impacto
positivo en el metabolismo asociado a componentes de calidad del vino (Castellarin et al. 2007a;
Castellaerin et al. 2007c), al mismo tiempo resulta en evidentes detrimentos en el rendimiento
(producción primaria) de las vides. El estrés hídrico afecta negativamente la capacidad
fotosintética de las plantas, reduciendo ostensiblemente la carga, y promoviendo la senescencia
de tejidos, lo que acorta la viabilidad de las plantas en la temporada, con una evidente reducción
en la capacidad de las mismas de acumular azúcares que sustenten el crecimiento de la temporada
siguiente. Al mismo tiempo, planteles vitivinícolas desarrollados en zonas de media a alta
pluviometría invernal, con suelos profundos y de texturas finas, no logran implementar manejos
de déficit hídrico al momento de inicios de envero (II fase de crecimiento de las bayas), sino que
mucho más tardíamente. En tales casos, el impacto sobre el rendimiento (producción primaria) es
igualmente bajo, pero con insignificantes mejoras en la calidad. Lo anterior, debido a que la

2
mayor incidencia del ABA sobre el metabolismo secundario se logra a inicios de envero más que
tardíamente (Castellarin et al. 2007c).

No obstante el conocimiento disponible actualmente acerca de la importancia del ABA en el

metabolismo secundario de bayas de interés enológico, aún existen dudas respecto, por ejemplo,
si los efectos de aspersiones de ABA sobre los racimos en periodo de pre-pinta incrementarán el
contenido interno de ABA en su forma activa acelerando la maduración de las bayas. De ser esto
posible, aún no se conoce si dicho aumento (transitorio o permanente), tendrá efecto sobre la
regulación del metabolismo secundario, específicamente sobre la ruta de los fenilpropanoides a lo
largo de toda la temporada en el caso de variedades tintas de cosecha tardía, como es Carménère.
Así mismo, es necesario conocer cuál será el efecto sobre la composición y calidad de antocianos
en las bayas con aplicaciones de ABA a lo largo de la temporada, así como sobre la regulación y
contenido de taninos, especialmente en las pieles.

En atención a las consideraciones anteriores, es de nuestro interés investigar acerca de la forma

en que esta fitohormona afecta el proceso de maduración y regulación del metabolismo
secundario de bayas en vides viníferas (Vitis vinífera L.) del cv. Carménère durante la fase de
maduración de las mismas.

3
3. Introducción

3.1. Fisiología de la maduración de la uva

Vitis vinifera L. es la especie predominantemente utilizada en la producción de vinos en la

mayoría de los viñedos comerciales del mundo. Este es clasificado como un fruto no climatérico,
por lo cual la tasa de respiración del fruto disminuye lentamente durante la maduración (Coombe
and Hale 1973). Aparentemente el fruto no requiere etileno para iniciar o coordinar el proceso de
maduración (Giovannoni 2001), aunque no implica que esta fitohormona no pueda estar envuelta
de alguna forma en la maduración del fruto (Chervin et al. 2004). El fruto de la vid es clasificado
como baya y su estructura (figura 1) está compuesta por una delgada piel rodeando un carnoso
pericarpio que contiene de una a cuatro semillas. El Pericarpio está dividido en exocarpio (piel),
mesocarpio y endocarpio (ambos pulpa). El mesocarpio y el endocarpio están divididos por los
haces vasculares periféricos, ubicándose hacia la cara externa e interna respectivamente. Las
capas epidérmicas y subepidérmicas de la piel contienen antocianos, una alta concentración de
aromas y los sabores característicos de una baya madura. El agua contribuye mayoritariamente al
peso de la pulpa, no obstante un gran número de otros compuestos también son acumulados en la
formación del fruto. Estos compuestos se acumulan principalmente en vacuolas celulares las que
alcanzan volúmenes considerables durante la maduración.

El crecimiento de las bayas de la vid (figura 2) se caracteriza por describir una función doble
sigmoidea, con una primera fase de crecimiento rápido, una segunda fase de crecimiento lento y,
finalmente, una tercera fase de incremento de tamaño.

La primera fase comienza con la antesis y dura alrededor de 45 a 60 días. Este periodo se
caracteriza por tener 2 a 3 semanas de rápida división celular que es seguida por alargamiento
celular. La mayoría de las divisiones celulares toman lugar entre 5 a 10 días luego de la antesis
(Harris et al. 1968). El principal incremento de tamaño de las bayas es causado por la elongación
debido al aumento en el volumen celular, de aproximadamente 300 veces, y por el número de
células, que aumenta cerca de 4 veces (Coombe 1976). Durante la primera etapa las bayas aún

4
poseen altas concentraciones de clorofila y en esta etapa se acumulan los ácidos orgánicos,
fundamentalmente los ácidos málico y tartárico.

1. Zona Central
ácido málico
Pincel azúcares
Pedicelo
Lóculos
Haces Vasculares 2. Zona Intermediaria
Central ácido tartárico
Ovular azúcares
Red periférica
Semilla
Embrión 3. Zona Periférica
Cutícula astringencia
aromas
Endospermo
color
Pulpa acidez
Tabique azúcares
Interior
Haces vasculares periféricos Exterior

Piel

Figura 1. Anatomía baya de vid Vitis vinífera. Se muestran las estructuras que componen el
fruto, describiendo las zonas de acumulación de los principales compuestos de interés enológico.
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Wine_grape_diagram_en.svg#globalusage

La segunda fase es conocida como fase estacionaria. La extensión de este periodo depende de
varios parámetros como el cultivar, tiempo de floración y condiciones ambientales en que se
encuentre la vid (Lavee and Nir 1986). Durante este periodo las bayas no parecen tener un
incremento sustancial en el tamaño pero el embrión se desarrolla rápidamente y alcanza su
máximo tamaño al final de este periodo. Sobre el final de esta fase, las bayas comienzan a
ablandarse y a perder clorofila, siendo estos los principales indicadores de la transición a la
tercera fase de desarrollo.

5
 Cese del flujo
Xilemático Floema

Xilema
Tamaño de la baya

Veraison
Fase lag
Periodo de
acumulación
compuestos
Tartrato Taninos Metoxipirazinas Malato Glucosa Fructosa Antocianos Compuestos Saborizantes
División celular
Pericarpio

Formación
Fruto

Días después de
Floración Floración °Brix

Formación de la baya Maduración de la baya

Figura 2. Desarrollo de la baya. Tamaño relativo y el color de las bayas en intervalos de 10 días,
describiendo tres fases de crecimiento (cajas verdes), con detalle de la funcionalidad de haces
vasculares respecto del tiempo transcurrido luego de floración (variable dependiendo de cada
variedad y condiciones edafoclimáticas de crecimiento), periodos de principal acumulación de
compuestos, así como el aumento en la concentración de azúcares en post-pinta (Modificado de
Coombe, 2001).

El inicio de la tercera fase, marcado por la pinta o “veraison”, palabra francesa que significa
“cambio de color”, continúa con la acumulación de azúcares, ablandamiento, mayor coloración
de la piel en cepas tintas, reducción de los niveles de ácidos orgánicos, expansión celular
(Coombe 1976), acompañados de cambios a nivel transcripcional asociados a un gran aumento en
el metabolismo primario y secundario, síntesis y transporte de fitohormonas, metabolismo de
pared celular asociado a expansión, maduración y ablandamiento (da Silva et al. 2005; Deluc et
al. 2007), entre otros. La tercera fase del crecimiento de las bayas se conoce como maduración, la
pared celular se desensambla por enzimas modificadoras que tienen un rol central en el
ablandamiento del fruto (Barnavon et al. 2000; Nunan et al. 1998), los niveles de azúcares y

6
aminoácidos se incrementan significativamente (Giovannoni 2001) y la mayoría de los azúcares
sintetizados en las hojas se mueven a través del floema hacia las bayas, principalmente en forma
de sacarosa, carbohidrato mayoritario en el transporte de largas distancias en vides (Kanellis and
Roubelakis-Angelakis 1993). Desde el floema, la sacarosa puede ser descargada en el espacio
apoplástico y puede ser escindida por invertasas apoplásticas. Existen evidencias a favor de la
intensa descarga del floema a través de la vía apoplástica consistente con la inducción de varios
transportadores de hexosas en la membrana plasmática en el inicio de la maduración (Davies et
al. 1999; Sarry et al. 2004). La sacarosa, glucosa y fructosa, pueden ser absorbidas por el
mesocarpio y, durante la maduración, glucosa y fructosa son acumulados en cantidades
aproximadamente iguales en la vacuola (Ageorges et al. 2000). Es importante recalcar que la
mayoría de los metabolitos secundarios son sintetizados in situ desde los azúcares y otros
precursores importados por la baya (Gholami et al. 1995).

Las uvas, al igual que la mayoría de los frutos, poseen una limitada capacidad fotosintética y
dependen de la importación de azúcares y otros nutrientes del resto de la planta, y la diversa
gama de compuestos que se acumulan en la baya se sintetizan en el fruto a partir de los azúcares
importados a través del floema. El conjunto de cambios que se producen en el inicio de la
maduración es coordinado individualmente dentro de cada baya, pero el proceso detonante de la
maduración de las uvas pertenecientes a un mismo racimo, pierde sincronía (Robinson and
Davies 2000). Esto da lugar a diferencias importantes entre las bayas, generando implicaciones
comerciales en calidad del fruto en la cosecha.

3.2. Ácido Abscísico (ABA)

La fitohormona Ácido Abscísico (ABA), originalmente llamado “Abscisin II”, debido a que se
pensaba que desempeñaba un papel importante en la abscisión de los frutos, regula una gran
cantidad de eventos durante el crecimiento vegetativo y reproductivo de plantas, así como
también en la adaptación de plantas a su ambiente. Durante el crecimiento vegetativo, el ABA es
la señal central de las plantas para responder a diversas restricciones ambientales tales como el
estrés hídrico, salino y por frío. (Finkelstein and Rock 2002). En cuanto al crecimiento
reproductivo, ABA es responsable de inducir y mantener la latencia de semillas y promover la

7
síntesis de proteínas de almacenamiento, además de la inducción de la tolerancia a diferentes
estímulos de estrés (Finkelstein and Rock 2002).

En relación a la ruta de biosíntesis del ABA, esta fitohormona es formada a partir del corte de
carotenoides en plastidios. Todo es iniciado desde la combinación entre piruvato y gliceraldehido
3-fosfato para formar un derivado de cinco carbonos, isopentenil difosfato, un fitoeno común,
precursor de todos los carotenoides de plantas (Wasilewska et al. 2008). El esqueleto de esta
molécula es formado por la fitoeno sintasa luego de reacciones de condensación, isomerización y
desaturación que convierten a este esqueleto en b,b-caroteno (Fig. 3). Posteriormente la molécula
es sometida a hidroxilaciones y ciclaciones para formar zeaxantina, y una posterior epoxidación
catalizada por la zeaxantina epoxidasa (ZEP) forma el producto trans-violaxantina. La enzima 9-
cis-epoxicarotenoide dioxigenasa (NCED), cataliza el primer paso que compromete la biosíntesis
de ABA, catalizando el corte de cis-xantofila para formar xantoxina, siendo su expresión
exhibida preferencialmente en tejido de pulpa (Wheeler et al. 2009). Hasta aquí todas las
reacciones catalizadas ocurren en plastidios, con los dos últimos pasos realizados en el
citoplasma y catalizados por las enzimas dehidrogenasa/reductasa de cadena corta (ABA2) y la
AB aldehido oxidasa (AAO) generando los productos AB aldehido y ABA respectivamente.

Además de la síntesis de novo, ABA puede ser glicosilado uniendo un éster de glucosa a través
de la enzima glucosiltransferasa específica para ABA, y de esta forma circular a través de la
planta de forma conjugada inactiva. Las propiedades químicas de ABA glucosa éster (ABA-GE)
son propicias para la translocación a larga distancia en el xilema debido a su baja permeabilidad a
biomembranas por este conjugado (Jiang and Hartung 2008). ABA conjugado puede ser liberado
a su forma activa por β-glucosidasas apoplásticas y de retículo endoplasmático. Este mecanismo
para generar ABA activo puede representar un mecanismo de respuesta rápida contra cambios
ambientales, y ha sido observado en mutantes de Arabidopsis deficientes en β-glucosidasas,
cuyas hojas presentan bajos niveles de ABA, y son fenotipos sensibles al estrés (Lee et al. 2006).
Además ABA-GE es almacenado en vacuolas o en el espacio apoplástico (Dietz et al. 2000),
pero es transportado por un mecanismo desconocido al retículo endoplasmático en respuesta a la
deshidratación, donde luego es cortado y liberado como ABA activo (Lee et al. 2006).

8
 Fitoeno, Licopeno
Zeaxantina β,β-Caroteno
Isopentenil difosfato (IPP)
ZEP

Anteraxantina
9-cis-Violaxantina Cloroplasto
ZEP C25 Epoxi Apocarotenal

Violaxantina

trans-Neoxantina NCED

9-cis-Neoxantina

Xantoxina
NCED
ABA2
Citoplasma

C25 Apocarotenal Alenico Aldehído Abscísico

AAO

Ácido Abscísico [cis-(+)-S-ABA]

Figura 3. Ruta de biosíntesis del ABA. Ruta de biosíntesis del ABA es iniciada en los
cloroplastos a partir del corte de carotenoides y es finalizada en el citoplasma. ZEP, zeaxantina
epoxidasa; NCED, 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa; ABA2, alcohol deshidrogenasa de
cadena corta; AAO, ABA aldehído oxidasa.

Estudios bioquímicos que utilizan déficit de agua han observado una rápida polimerización de β-
glucosidasas en microsomas, presumiblemente incluyendo membranas de retículo
endoplásmatico en hojas de Arabidopsis nativa, obteniendo una actividad 4 veces mayor que los
controles que no son sometidos al estrés.

Se ha propuesto que ABA puede inducir la maduración en algunos frutos no climatéricos. En

particular, en el caso de las baya de vid, se cree que ABA juega un rol importante en la
regulación de la maduración, debido a que la concentración interna de ABA en bayas se
incrementa dramáticamente en el inicio de la maduración (Coombe and Hale 1973; Düring et al.
1978). Durante toda la primera etapa los niveles de ABA van disminuyendo desde floración hasta
llegar a un estado basal. Hacia finales del segundo periodo la concentración interna de ABA

9
comienza a tener un fuerte aumento (Wheeler et al. 2009) para luego, en la transición desde la
segunda fase a la tercera fase del desarrollo de la baya, ser acompañada por el proceso de
maduración, empezando a acumular azúcares y antocianos e iniciando la coloración característica
de las uvas tintas (Castellarin et al. 2007c).

La composición de los derivados fenilpropanoides en uvas ha generado una gran expectación en

los últimos años debido a que estos son los principales constituyentes del vino, son responsables
de las propiedades organolépticas como el color y la astringencia y contribuyen
significativamente al estilo y calidad de los vinos. Además se ha visto que aplicaciones exógenas
de ABA aceleran la maduración (Inaba et al. 1976; Koyama et al. 2010), mejoran la coloración en
uvas de mesa y uvas viníferas (Giribaldi et al. 2009; Jeong et al. 2004; Mori et al. 2005; Peppi et
al. 2007; Wheeler et al. 2009; Yakushiji et al. 2001) y además, en uva de mesa, se ha reportado
un incremento en peso de piel (Peppi et al. 2008), lo cual para uvas viníferas es sumamente
esencial ya que en la piel son acumulados los principales flavonoides que son extraídos para la
producción de vinos.

3.3. Ruta Fenilpropanoide

La ruta de los fenilpropanoides (figura 4), comienza con el aminoácido fenilalanina, proveniente
de la vía del ácido shiquímico, el que es desaminado por la fenilalanina amonio liasa (PAL),
enzima clave reguladora de la síntesis de la mayoría de los compuestos fenólicos de la baya,
formando ácido cinámico. El ácido cinámico es hidroxilado y cumaroilado en pasos posteriores
por la cinamato 4-hidroxilasa (C4H) y la 4-coumarato:CoA ligasa (4CL), para formar el producto
4-Coumaroil-CoA y posteriormente la enzima Chalcona sintasa (CHS) transfiere grupos acilos
desde malonil-CoA formando Naringenina chalcona, iniciando la síntesis del subgrupo de la ruta
de los flavonoides. A continuación, por la acción de la chalcona isomerasa (CHI), flavanona 3-
hidroxilasa (F3H), flavonoide 3` hidroxilasa (F3`H) y flavonoide 3`5` hidroxilasa (F3`5`H) (las
dos últimas enzimas claves para la generación de antocianos dihidroxilados o trihidroxilados, que
influyen finalmente en el tipo de coloración de las bayas), generan los intermediarios
Dihidrokaempferol, Dihidromiricetina y Dihidroquercetina, que por acción de la flavonol sintasa
(FLS) producen los flavonoles. En pasos posteriores en esta ruta se encuentra la enzima
10
dihidroflavonol 4-reductasa (DFR) y las enzimas leucoantocianidin-reductasa (LAR) y
antocianidin-reductasa (ANR) que convierten leucoantocianidinas y antocianidinas en catequina
y epicatequina formando las subunidades de las proantocianidinas, también conocidos como
taninos.

Finalmente el paso que compromete la biosíntesis de antocianos es catalizado por la enzima

UDP-glucosa:flavonoide 3-O-glucosiltransferasa (UFGT), que cataliza la glicosilación de
antocianidinas inestables (cianidina y delfinidina) en antocianinas pigmentadas (cianidina 3-
glucosido y delfinidina 3-glucosido) y desde estos antocianos por medio de la acción de la
enzima ortometiltransferasa (OMT) se forman los antocianos principales, las cuales finalmente
son acumuladas en vacuolas produciendo el color característico de uvas tintas (Castellarin et al.
2007c).

11
Figura 4. Ruta Fenilpropanoide. Resumen de la principal ruta de metabolitos secundarios
relacionados a las propiedades y características de vinos. La Ruta Fenipropanoide durante el
desarrollo de baya, con el regulador negativo (MYB4A) y positivo (MYBA1) de la síntesis de
antocianos. En pinta el flujo a través de la vía de los derivados flavonoides cambia desde la
producción de proantocianidinas hasta pre-pinta (verde), a la producción de flavonoles y
antocianos desde postpinta (purpura). Abreviaciones: PAL, fenilalanina amonio liasa; CHS,
chalcona sintasa; CHI, chalcona isomerasa; F3H/F3`H/F3`5`H, flavonoide hidroxilasas; DFR,
dihidroflavonol-4-reductasa; ANS, antocianidina sintasa; UFGT, UDP glucosa: flavonoide-3-O
glucosiltransferasa; FLS, flavonol sintasa; OMT, O-metiltransferasa; N, naringenina; E, eridictol;
Dhq, dihidroquercitina; Dhk, dihidrokaemferol; Dhm, dihidromirecitina (Modificada de
Castellarin et al., 2007).

12
 3.4. Regulación de la Ruta Fenilpropanoide

La expresión de los genes estructurales de la ruta fenilpropanoide ha mostrado ser controlada por
varios genes reguladores (Quattrocchio et al. 1993). Numerosos reportes sobre genes reguladores
asociados a la ruta de síntesis de antocianos han establecido colectivamente que el complejo
transcripcional regulador de la biosíntesis de antocianos es conservado en plantas superiores
(Holton and Cornish 1995; Koes et al. 2005; Ramsay and Glover 2005). Este complejo regulador
incluye dos factores de transcripción que pertenecen a las familias de reguladores MYB y bHLH
(Holton and Cornish 1995; Mol et al. 1998) y la proteína WD40, la cual se ha encontrado
asociada a una amplia gama de funciones, tanto en Arabidopsis (Walker et al. 1999) como en
petunia (de Vetten et al. 1997; Spelt et al. 2002). Las proteínas bHLH y WDR40 poseen un muy
amplio rango y objetivos reguladores para interactuar. Por el contrario, las proteínas MYB son
componentes claves que proveen la especificidad para el subconjunto de genes que regula
(Zimmermann et al. 2004). Entre estas proteínas reguladoras, la familia de proteínas MYB es el
grupo más abundante de factores de transcripción descrito en plantas. Las proteínas MYB regulan
diversos procesos biológicos como el destino de las células epidérmicas incluyendo su
pigmentación (Nesi et al. 2001), desarrollo de semillas (Penfield et al. 2001), respuestas a
deshidratación (Abe et al. 1997) y frío (Agarwal et al. 2006), resistencia a enfermedades causadas
por patógenos (Lee et al. 2001; Mengiste et al. 2003; Vailleau et al. 2002), movimiento
estomático (Cominelli et al. 2005; Liang et al. 2005), respuestas relacionadas a sacarosa (Teng et
al. 2005), síntesis de flavonoles (Czemmel et al. 2009), antocianos (Matus et al. 2008) y
proantocianidinas (Bogs et al. 2007; Terrier et al. 2009), además de muchas otras funciones. Los
reguladores MYB están caracterizados por tener dominios de unión a DNA que poseen entre 100-
160 residuos y han sido clasificadas de acuerdo al número de repeticiones imperfectas (llamadas
R) en la región N-terminal. De las diferentes clases identificadas, la subfamilia R2R3 MYB es la
más abundante en plantas. Cada repetición adopta una estructura hélice-hélice-giro-hélice que
interactúa con elementos regulatorios en los promotores (Jin and Martin 1999; Martin and Paz-
Ares 1997; Rosinski and Atchley 1998). Además de los dominios de unión a DNA, se ha
identificado el dominio C1, más cercano a la región C-terminal, responsable de establecer las
interacciones proteína-proteína con otros componentes de la maquinaria transcripcional

13
eucariótica otorgándole una mayor especificidad a su gen objetivo (Baudry et al. 2004;
Grotewold et al. 2000; Lin-Wang et al. 2010; Matus et al. 2008).

La síntesis de los diferentes flavonoides es sumamente regulada en la ruta de los

fenilpropanoides. Por ejemplo, se ha observado que la síntesis y acumulación de taninos en vides
del cv. Cabernet Sauvignon es iniciada en estadíos tempranos de la baya (tamaño de arveja),
observado por el aumento en los niveles de expresión de VvLAR2 y VvANR, la actividad
enzimática LAR y ANR y por el contenido de taninos que luego disminuyen hasta un estado
basal desde pinta hasta vendimia (Gagne et al. 2009). También la síntesis y acumulación de
antocianos en la piel es iniciada desde el inicio de maduración (Boss et al. 1996). Utilizando el
genoma de la vid, el cual fue recientemente secuenciado, fueron descritos y clasificados 108
miembros de la subfamilia de genes R2R3 MYB en bayas con respecto a su estructura genética
en el genoma y similitud con sus ortólogos putativos en Arabidopsis (Matus et al. 2008). En la
vid, los genes MYB que han sido caracterizados se encuentran relacionados principalmente en el
control de la síntesis de flavonoides: MYB5a y MYB5b para la vía general de flavonoides (Deluc
et al. 2006; Deluc et al. 2008), MYBF1 relacionado a la síntesis de flavonoles (Czemmel et al.
2009), MYBPA1 relacionado a la síntesis de proantocianidinas (Bogs et al. 2007), MYBA1
relacionado a la síntesis de antocianos, regulando positivamente la expresión de UFGT y OMT
(Kobayashi et al. 2002), y almacenamiento de antocianos regulando la expresión de GST y
anthoMATE, proteínas que son requeridas para el transporte vacuolar de flavonoides (Cutanda-
Perez et al. 2009).

Como ya se ha descrito, en la subfamilia de genes R2R3 MYB, específicamente en la región C-

terminal, normalmente es posible encontrar sitios de interacción proteína-proteína, así como
también motivos represores de DNA. Miembros de este grupo poseen un motivo C1, que
participa en interacciones con las proteínas bHLH y un motivo C2 asociado a la represión de
promotores, como el promotor del gen de la enzima Cinamato-4-hidroxilasa (C4H), una de las
primeras enzimas de la ruta Fenilpropanoide para AtMYB4 (Jin et al. 2000). En vides se ha
encontrado VvMYB4 (EF113078, Genebank), un represor ortólogo a AtMYB4, y a pesar de su
gran similitud a AtMYB4, este gen regula negativamente la expresión de UFGT, reprimiendo la
síntesis de antocianos (Matus et al. 2009).

14
 3.5. Compuestos derivados de la ruta fenilpropanoide

La composición de los compuestos fenólicos pertenecientes a las uvas ha generado gran

expectación en los últimos años ya que estos influyen en la calidad del vino final, poseen la
característica de ser fuertes antioxidantes naturales y, además, son de reconocido beneficio para
la salud. Estos compuestos fenólicos derivados del metabolismo secundario de las bayas pueden
ser clasificados en dos grandes grupos: los no flavonoides y los flavonoides. Los compuestos no
flavonoides presentan solo un anillo de 6 carbonos y los más importantes corresponden a los
ácidos benzoicos y a los ácidos cinámicos. El segundo grupo, más importante que el primero, son
los flavonoides compuestos principalmente por 2 anillos de 6 carbonos unidos por un heterociclo
de tres carbonos. La coloración característica de las bayas es efecto de la acumulación vacuolar
de diferentes compuestos flavonoides, resultantes del metabolismo secundario en la ruta de los
Fenilpropanoides. Los principales compuestos flavonoides son: los Flavonoles, los cuales son
protectores contra UV, actúan como secuestradores de radicales libres y se piensa que pueden
contribuir al color de los vinos como copigmento para las antocianinas; los Taninos, que
corresponden a monómeros condensados de flavan 3-oles (catequinas y epicatequinas), los cuales
son determinantes en la calidad de los vinos aportando la astringencia y el amargor, la estabilidad
del color, el cuerpo y la estructura, y los Antocianos, que corresponden a los compuestos
pigmentados y dan la coloración especial a los vinos tintos y uvas.

15
4. Hipótesis

El efecto de aspersiones de ABA en periodo de pre-pinta sobre bayas del cv. Carménère en
condiciones de campo incrementan los niveles de expresión de los factores de transcripción
VvMyba1 y VvMyb4a, y genes de la ruta Fenilpropanoide VvPAL, VvDFR, VvANS, VvUFGT y
VvLAR2, incrementando el contenido de antocianos, proantocianidinas y flavonoles, a lo largo de
toda la temporada.

16
5. Objetivo General

Determinar el efecto de aplicaciones de ABA en pre-pinta sobre la expresión de los factores de

transcripción VvMyba1 y VvMyb4a, genes de ruta fenilpropanoide VvPAL, VvDFR, VvANS,
VvUFGT y VvLAR2 y concentración de Antocianos, Taninos y Flavonoles a lo largo del período
de maduración en bayas de vid del cv. Carménère.

17
6. Objetivos Específicos

 Determinar la concentración interna de s-(cis)-ABA utilizando la técnica ELISA en bayas

del cv. Carménère a lo largo del periodo de maduración luego de ser tratadas con ABA.
 Determinar el efecto de las aspersiones de ABA sobre el metabolismo primario y peso de
las bayas, relacionados a la calidad y estado de maduración.
 Determinar el efecto del ABA sobre el metabolismo secundario en bayas del cv.
Carménère a través del análisis de expresión de genes reguladores y estructurales que
actúan y componen la ruta de los fenilpropanoides: VvMyba1, VvMyb4a, VvPAL, VvDFR,
VvANS, VvUFGT, VvLAR2, a lo largo del periodo de maduración.
 Determinar el efecto del ABA sobre la concentración de Antocianos, Taninos y
Flavonoles desde pinta hasta vendimia en pieles de bayas del cv. Carménère asperjadas
con diferente concentraciones de ABA.

18
7. Materiales y Métodos

7.1. Material Vegetal

El presente estudio fue realizado utilizando plantas de vid (Vitis vinifera L. cv. Carménère) de 9
años de edad, en la temporada de crecimiento 2008-2009, pertenecientes a la viña Haras de
Pirque, ubicada en el valle del Maipo, en la Región Metropolitana, localidad de Pirque (33° 42`S,
70° 35`W). Para los ensayos, se escogieron 15 plantas de similar vigor pertenecientes a una
misma hilera. Se escogió una hilera que fue separada en 5 bloques y en cada bloque fueron
escogidas 3 plantas de similares condiciones de carga y vigor, procurando que las plantas
seleccionadas se encontraran con al menos tres plantas de separación. En cada bloque se
aplicaron tres tratamientos correspondientes a diluciones de ABA y un testigo: (i) 50 mgL-1; (ii)
100 mgL-1 ABA; (iii) testigo con 0,1 % (v/v) de Tween 20. El ABA exógeno cuyo nombre de
producto es VBC 30062 con una concentración de 5000 mgL-1 de ABA, fue proporcionado
gentilmente por Julio Retamales, Valent Biosciences Co. Las plantas seleccionadas fueron
asperjadas con los tratamientos correspondientes, con pulverizadores manuales sobre la zona del
racimo, en dos ocasiones, esto es en las fechas 19 y 22 de enero correspondientes a -10 y -6 DDP
respectivamente. La Pinta se estableció como el momento en que el 50% del racimo se
encontraba coloreado, correspondiente al día 28 de enero. Las bayas recolectadas en las
diferentes fechas de muestreo fueron inmediatamente congeladas con nitrógeno líquido y
almacenadas a -80°C hasta su utilización. Las fechas de aspersión y recolección de las bayas para
los diferentes análisis se encuentran resumidas en la tabla 1. Los análisis básicos relacionados al
estado de maduración de la baya (peso, pH, acidez titulable y °Brix), se realizaron utilizando 50
bayas recolectadas aleatoriamente de todos los racimos de una planta.

19
 Recolección Recolección Recolección
DDP Aspersión análisis ABA y análisis análisis
expresión genes Básicos HPLC

-10 X
-6 X X
0 X X X
35 X X X
65 X X X
105 X X

Tabla 1. Resúmen fechas aplicación ABA y recolección muestras. Muestra detalladamente las
fechas en que se aplicaron los tratamientos de ABA, junto con las fechas de recolección de bayas
dispuestas para los análisis de expresión de genes, contenido de ABA, análisis básicos y análisis
de HPLC.

7.2. Extracción y Determinación de la concentración interna de (S)-cis-ABA

en bayas.

Para la extracción del ABA se utilizó una muestra compuesta de 10 bayas seleccionadas
aleatoriamente de diferentes racimos pertenecientes a cada planta. Las bayas, fueron pulverizadas
hasta polvo fino en un mortero con nitrógeno líquido separando las semillas. Posteriormente se
tomaron 1,5 g del polvo fino resultante, que fue posteriormente resuspendido en agua destilada en
una relación 1:10 p/v durante 16 h a 4 °C en oscuridad. Los extractos fueron centrifugados a 1520
g por 10 min y del sobrenadante fue tomada una alícuota que fue diluida 50 veces y almacenada a
-20°C. La determinación de la concentración interna de (S)-cis-ABA se realizó mediante un
ensayo de ELISA indirecto competitivo con un anticuerpo monoclonal (DBPA 1) contra (S)-cis-
ABA (Vernieri et al. 1989). Cada ensayo fue realizado por triplicado.

20
 7.3. Análisis de la expresión de genes de la Ruta Fenilpropanoide.

7.3.1. Extracción del RNA total de la baya.

El RNA total de las bayas fue extraído mediante el método del Perclorato (Rezaian and Krake
1987), con algunas modificaciones (Davies and Robinson 1996). Se utilizaron 10 bayas
seleccionadas aleatoriamente de diferentes racimos pertenecientes a cada planta. Las bayas,
fueron molidas hasta polvo fino en un mortero con nitrógeno líquido separando las semillas.
Posteriormente se tomaron 3 g del polvo fino resultante, el que fue mezclado y homogenizado en
vortex con 10 mL de buffer de extracción (5 M Perclorato de Sodio, 0,3M Tris-HCl pH 8,3, 1%
v/v SDS, 8,5% p/v PVPP, 2% v/v PEG 20000, 2% v/v 2-mercaptoetanol). Posteriormente el
homogenado fue filtrado y centrifugando por 5 min a 1500 g a 4 °C a través de una columna de
10 mL, previamente lavada con agua DEPC autoclavada, que contenía lana de vidrio. Al filtrado
se añadieron 2 volúmenes equivalentes de EtOH 99,9% frío (Merck) y se dejó precipitar por 30
min a -20 °C. Se centrifugó a 1500 g por 20 min a 4 °C y se eliminó el sobrenadante. El
precipitado seco se resuspendió en 2 mL de agua DEPC, se añadió 1 volumen equivalente de
fenol: cloroformo básico (25:24) y se centrifugó a 18000 g, repitiendo el proceso 2 veces. Luego
se agregó 1 volumen equivalente de cloroformo: Alcohol isoamílico (24:1) y se centrifugó a
18000 g. El RNA se hizo precipitar añadiendo 0,1 volumen equivalente de acetato de sodio 3M
pH 5.2, 2 vol. de EtOH 99,9% frío (Merck), se agregó a la fase acuosa 0,5 mL de cloroformo:IIA
(24:1), se dejó precipitar por 30 min a -20°C, se centrifugó a 7700 g por 15 min a 4°C y se
descartó el sobrenadante. Al pellet se adicionó 1 mL de EtOH 70% frío y centrifugó a 18000 g
por 10 min a 4°C, nuevamente se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en 250 µL de
agua de DEPC inactiva, luego se adicionaron 250 µL de LiCl 10 M, se dejó precipitar por 30
min a -20 °C, se centrifugó a 18.000 g por 30 min a 4 °C y se descartó el sobrenadante. Al
precipitado se añadió 1 mL de etanol 70% frío (en agua DEPC), se centrifugó a 18000 g por 30
minutos a 4 °C, se eliminó el sobrenadante y finalmente la muestra de RNA se resuspendió en 50
µL de agua libre de nucleasas y se almacenó a -80°C hasta su utilización.

La concentración del RNA total extraído fue ensayado por determinaciones espectrofotométricas
a 240, 260 y 280 nm y su pureza se determinó observando las razones entre las siguientes

21
absorbancias: A260:A280 y A260:A240. La integridad del RNA fue evaluada mediante la
visualización de las bandas de rRNA 18Sy 28S en un gel electroforético de agarosa al 1,2%, con
tinción de bromuro de etidio visualizado con una lámpara UV.

7.3.2. Síntesis del cDNA

Para la síntesis del cDNA, el RNA total fue reversamente transcrito con partidores al azar
utilizando la enzima M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, USA) acorde a las instrucciones
del manufacturador. Brevemente, se realizó en una mezcla de reacción que contenía 1 µg de
RNA total y 0,5 µg de oligo dT (Promega, USA). La mezcla (15 µL) fue denaturada a 70°C por 5
min, luego se enfrió en hielo por 5 min y se agregó el buffer mix 5x (Promega, USA), 12,5 µM
dNTP (Promega, USA) y 200 U de la enzima M-MLV (Promega, USA), hasta un volumen final
de 25 µL. Esta reacción se incubó a 42°C durante 90 min y posteriormente se inactivó la enzima
a 70° C por 15 min.

7.3.3. Comparación Cuantitativa de la expresión de genes en bayas.

La comparación relativa de la expresión de cada gen fue determinada por qPCR en Tiempo Real
usando LightCycler 1.5 Instrument (Roche, Basel, Switzerland). Los partidores específicos
usados fueron diseñados usando el programa Primer Premier 5.0 (Biosoft International, Palo
Alto, CA) y estos se encuentran resumidos en la tabla 2 (ver material suplementario). La mezcla
de PCR (20 µL volumen final) contiene 2 µl de templado de cDNA (100 ng) y 18 µL de la
mezcla LightCycler® FastStart DNA Master SYBR Green (Roche), 3 mM MgCl2, 0,5 µM de los
partidores de dirección sentido y antisentido de cada gen. Las condiciones de amplificación
fueron: Pre-incubacion a 95° C por 10 min, 40 ciclos a 95° C por 5 s, 58-62° C por 10 s y 72° C
por 8-20 s. Las reacciones control incluyeron todos los componentes de la mezcla de reacción de
PCR pero sin los templados de cDNA. La pureza de los productos amplificados fue verificada
por las curvas de melting y por electroforesis en gel de agarosa. Todas las reacciones fueron
realizadas por duplicado.

22
Para analizar los cambios en la expresión se generaron curvas estándar para cada uno de los
genes usando sus partidores específicos, siguiendo los siguientes pasos. Primero, el producto de
PCR (amplicón), que forma una sola banda en gel, fue purificado usando Wizard® SV Gel and
PCR Clean-Up System (Promega). La concentración del amplicón fue cuantificada utilizando un
espectrofotómetro (UV-1601, Shimadzu, Japan) a una absorbancia de 260 nm. Posteriormente, el
amplicón de concentración conocida fue previamente diluido en las siguientes concentraciones
100-10-1-0,1-0,01 pgμL-1. Finalmente, la concentración inicial de los mRNA analizados en cada
muestra fue calculada desde la curva estándar, usando el método de la segunda derivada provisto
por el LightCycler Software Version 3.5 (Roche) y fueron normalizados con los valores de
VvActina2.

7.4. Análisis de metabolitos secundarios.

7.4.1. Pretratamiento de la muestra.

Para el análisis de los compuestos fenólicos pertenecientes a la piel de la baya se utilizó el

método descrito por (Venencie et al. 1997), se empleó una muestra compuesta de 50 bayas al azar
pertenecientes a diferentes racimos de cada planta de modo que la muestra fuese representativa.
Luego, se separaron manualmente las pieles, las que fueron pesadas y puestas en una solución de
30 mL de agua destilada, 40 mL de solución hidro-alcohólica (etanol 10% v/v) y 5 g de ácido
tartárico. A continuación, la mezcla fue molida con un homogenizador para, posteriormente,
ajustar el peso final de la solución a 100 g con la solución hidro-alcohólica. El extracto fue
macerado por 2 h a temperatura ambiente con agitación constante y filtrado a través de
membranas milipore (0,45µm) con una bomba de vacío.

7.4.2. Antocianos Totales

Los Antocianos totales en pieles de baya se determinaron por la técnica desarrollada por (García-
Barcelo 1990), consistente en la decoloración por bisulfito. 1 mL del extracto obtenido en el
punto 7.4.1, se adicionó 1 mL de alcohol ácido (HCl 0,1% en EtOH 95%) y 20 mL de HCl 2%.
La muestra se separó en dos alícuotas de 10 mL y se les añadió 4 mL de NaHSO3 y 4 mL de agua

23
destilada respectivamente y, luego de 20 min, se medió la absorbancia a 520 nm. La
concentración de antocianos totales se determinó con una curva de calibrado realizada con patrón
de clorhidrato de malvidina.

7.4.3. Taninos Totales

Los Taninos totales en pieles de baya se determinaron por la técnica desarrollada por (Bate-Smith
1981), consistente en la propiedad característica que poseen las moléculas 3,4-flavanodioles en la
que, por medio de la hidrólisis en medio ácido y presencia de oxígeno, estas moléculas se
transforman en antocianos. En dos tubos se prepararon 4 mL de muestra, agregaron 2 mL de
agua destilada y 6 mL de HCl 35%. Se sometió a baño maría a 90ºC durante 30 min y luego se
dejó enfriar a temperatura ambiente en oscuridad y, finalmente, se midió absorbancia a 550 nm.
La concentración de taninos totales se determinó con una curva de calibrado realizada con patrón
de procianidina.

7.4.4. Análisis de Proantocianidinas libres y Flavonoles.

El análisis de Proantocianidinas libres y Flavonoles, se realizó según fue descrito por (Peña-Neira
et al. 2007). Brevemente, una alícuota de 25 mL del extracto obtenido en el punto 7.4.1, fue
extraída tres veces con 10 mL de dietileter y tres veces con 10 mL de etilacetato. Posteriormente
las fracciones orgánicas fueron combinadas y el extracto fue evaporado hasta sequedad en vacío
en rotavapor. El residuo fue resuspendido en 2 mL de solución metanol/agua 1:1 v/v, filtrado en
una membrana de poliéster de 0,20 µm (Millipore) e inyectado 35 µL de la muestra que
posteriormente fue analizado por HPLC-DAD, (Agilent 1100), equipado con un desgasificador,
bomba, inyector automático, acoplado a un detector de arreglo de fotodiodos y una columna
Nova-PaK (Waters) C-18, 4µm, 3.9x300 mm, termostatizado a 20 °C. Las condiciones
cromatográficas fueron las siguientes, la fase móvil constó de tres solventes: Solvente A: Ácido
Acético 2% en agua; Solvente B: Acetonitrilo: Ácido Acético: Agua (20:2:78); Solvente C:
Metanol. El flujo se ajustó de acuerdo al gradiente: 0 min: flujo 1,0 mLmin-1, 100% A; 55 min,
flujo 1,2 mLmin-1, 20% A y 80% B; 57 min, flujo 1,2 mLmin-1, 10% A y 90% B; 91 min, flujo
1,2 mLmin-1, 100% C; 94 min, flujo 1.0 mLmin-1, 100% A. Para la detección se fijó una longitud

24
de onda de 280 nm y los compuestos fueron identificados mediante la comparación de su
espectro de absorción y tiempo de retención de sus respectivos patrones.

7.4.5. Análisis de Antocianos.

Se analizó el perfil de antocianos según esta descrito por (Peña-Neira et al. 2007). Brevemente,
del extracto obtenido en el punto 4.1, 2 mL fueron filtrados a través de una membrana de
poliéster de 0,20 µm, Millipore, se inyectaron 150 µL y separaron a través de HPLC-DAD
(Merck Hitachi), equipado con Bomba, inyector automático, acoplado a un detector de arreglo de
diodos, que posee una columna LiChrospher RP-18, 5 µm, 250 mm, a temperatura ambiente. Las
condiciones cromatográficas fueron las siguientes: la fase móvil constó de dos solventes,
Solvente A: Ácido Fórmico 2% en agua, Solvente B: Acetonitrilo, el flujo se fijó de acuerdo con
el gradiente como se describe a continuación: 0 min, flujo 1,1 mLmin-1, 96% A y 4% B; 7,9 min,
flujo 1,1 mLmin-1, 85% A y 15% B; 27 min, flujo 1,5 mLmin-1, 80% A y 20% B; 40 min, flujo
1,5 mLmin-1, 70% A y 30% B; 43,1 min, flujo 1.1 mLmin-1, 96% A y 4% B. Para la detección se
fijó una longitud de onda de 520 nm y los compuestos fueron identificados mediante la
comparación de su espectro de absorción y tiempo de retención de sus respectivos patrones.

7.5. Análisis Estadístico.

Para todos los ensayos se utilizaron 5 réplicas bilógicas. Los datos de perfiles de expresión,
composición de antocianos y polifenoles de bajo peso molecular se encuentran expresados como
media ± ES. Las diferencias significativas entre tratamientos para cada fecha de medición se
determinaron por medio de ANOVA. En caso de existir diferencias con p < 0,05, estas se
determinaron mediante análisis de comparación de medias de Tukey. Todos los análisis
estadísticos se realizaron con el programa MINITAB statistical software 13.

25
8. Resultados

8.1. Efecto sobre la concentración interna de (S)-cis-ABA en bayas tratadas

con ABA.

Como se observa en la figura 5, las bayas tratadas con ABA, en comparación con el testigo en el
periodo de pinta, adelantaron la coloración del racimo. Las bayas tratadas con ABA mostraron el
100% de los racimos con coloración total mientras que las plantas testigo solo habían coloreado
50% del racimo el día 28 de enero (0 DDP), esto es, 6 días después de la segunda aplicación de
esta fitohormona sobre los racimos.

A B C

Figura 5. Racimos de vid en pinta. Racimos de vides del cv. Carménère ubicadas en la viña
Haras de Pirque en periodo de pinta (0 DDP). Es posible observar que el testigo posee el 50% de
las bayas del racimo con coloración, en comparación con las bayas que fueron tratadas con ABA
que muestran la coloración total del racimo. A. testigo; B. Tratamiento 50 mgL-1 ABA, C.
Tratamiento 100 mgL-1 ABA.

Para asegurarse de remover cualquier rastro de ABA remanente en las pieles producto de las
aspersiones, éstas fueron previamente lavadas con etanol 70% y una solución detergente antes de
proceder a las determinaciones de ABA. Las bayas asperjadas con soluciones de ABA en las

26
fechas equivalentes a -10 DDP y -6 DDP con concentraciones de 50 mgL-1 y 100 mgL-1,
resultaron en una concentración interna de (S)-cis-ABA con promedios superiores al testigo
(figura 6) y proporcionales a la dosis aplicadas durante todo el proceso de maduración. Tales
diferencias resultaron ser significativas en las bayas asperjadas con la mayor dosis de ABA en
relación al testigo desde los -6 DDP hasta los 65 DDP, es decir, toda la temporada de maduración
de las bayas. En cuanto a las bayas tratadas con 50 mgL-1 de ABA, estas resultaron en un
contenido significativamente superior al testigo sólo a los 0 DDP (fig. 6). El contenido interno de
ABA, pocos días después de la primera aplicación de la fitohormona (-6 DDP), alcanzó 1,5 y 2
veces el nivel del testigo en las bayas tratadas con 50 mgL-1 y 100 mgL-1, respectivamente. Luego
de 6 días desde la segunda aplicación, se observó el máximo incremento en la concentración
interna de ABA, alcanzando 1,5 y 3,5 veces la concentración del testigo en las bayas tratadas con
50 mgL-1 y 100 mgL-1, respectivamente. A los 35 DDP y 65 DDP se observó que la
concentración de la forma activa de esta fitohormona, en el tratamiento testigo, disminuyó
alcanzando un estado basal con una concentración aproximada de 1 µg g-1 de peso fresco, sin
embargo, la concentración de ABA en las bayas tratadas con 100 mg L-1 de esta fitohormona
resultó en un contenido 2 y 1,5 veces superior a la observada en el testigo a los 35 y 65 DDP
respectivamente.
10
Testigo
ABA 50 mg L-1
8 c
ABA (ug g-1 peso fresco)

ABA 100 mg L-1

4 b
b
ab
a
2 a b
b
a ab
a a

0
-20 0 20 40 60 80
DDP
Figura 6. Concentración Interna de ABA. Concentración interna de (S)-cis-ABA por medio de
ELISA, en bayas sin semilla (piel y pulpa) del cv. Carménère de cada tratamiento expuesto a
aplicaciones de ABA, tomadas desde -6 hasta 65 DDP. Testigo (círculos abiertos); 50 mgL-1
(triángulos invertidos); 100 mgL-1 (cuadrado). Barras verticales indican E.S. de 5 réplicas
biológicas. Letras distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos para cada
fecha (p<0.05).

27
Estos resultados sugieren que el ABA es incorporado al interior de las bayas, al menos
inicialmente, para luego mantenerse por un extenso período de tiempo, o bien, como es sugerido
por Wheeler et al. (2009), se trataría de un efecto autocatalítico del ABA al interior de las bayas.

8.2. Efecto del ABA sobre peso total y peso de hollejo de bayas.

En relación a los parámetros físicos, el peso total de bayas tratadas con 100 mgL-1 de ABA
(figura 7a), alcanzó niveles significativamente superiores al control en periodo de pinta, aunque
tales diferencias no volvieron a manifestarse nuevamente a lo largo del período de maduración de
las bayas, alcanzando un peso máximo de 90 g por 50 bayas en promedio para todos los
tratamientos. El peso de las pieles (figura 7b), por su parte, resultó sin diferencias significativas
entre tratamientos a lo largo de la maduración de las bayas, excepto a los 65 DDP en que las
bayas tratadas con 100 mgL-1 de ABA alcanzaron un peso de piel significativamente superior al
testigo y al tratamiento de menor dosis asperjada de ABA. En cuanto a la relación entre el peso
de las pieles respecto del peso total de bayas, para cada una de las repeticiones (figura 7c), fue
posible observar que el tratamiento de 100 mgL-1 de ABA alcanzó una relación de peso piel/peso
total de baya superior al testigo, desde los 65 DDP hasta los 105 DDP.

28
 120
A
100

80

peso (g)
60 b
ab
a

40

30
B
25 b
a
a
peso (g)

20

15

10

C b
0,30 ab
peso piel / peso total

a
b
0,25
a
a

0,20

0,15 Testigo
ABA 50 mgL-1
ABA 100 mgL-1
0,00
-20 0 20 40 60 80 100 120
DDP
Figura 7. Análisis Básicos 1. Análisis del peso de muestras de 50 bayas del cv. Carménère de
cada tratamiento expuesto a aplicaciones de ABA, tomadas desde 0-105 DDP. A. peso de baya;
B. peso de piel; C. relación peso piel/peso baya. Testigo (círculos abiertos); 50 mgL-1 (triángulos
invertidos); 100 mgL-1 (cuadrado). Barras verticales indican E.S. de 5 réplicas biológicas. Letras
distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos para cada fecha (p<0.05).

29
 8.3. Efecto del ABA sobre el metabolismo primario de bayas.

En cuanto a los sólidos solubles, como se muestra en la figura 8a, las bayas tratadas con 100
mgL-1 de ABA, durante pinta, resultaron en un mayor nivel de ºBrix comparados con el testigo.
Esta diferencia se manifestó solo en pinta (0 DDP), con un promedio de 9,3 ºBrix para el testigo
y de 11,6 ºBrix para las bayas tratadas con la máxima concentración de ABA, indicando un
adelantamiento transitorio de la maduración sobre bayas con respecto del testigo. De manera
similar, el pH de las bayas tratadas fue significativamente superior al testigo a los 0 DDP y los 35
DDP (figura 8b), coincidiendo, al menos en la primera fecha señalada, con una menor acidez en
ambos tratamientos de aspersión comparados con el testigo (figura 8c). En las fechas posteriores
no se observaron diferencias significativas de pH ni acidez titulable entre las bayas tratadas con
ABA y el testigo.

30
 30
A
25

Sólidos Solubles (º Brix)

20

15

b
10 ab
a

B
4,0
b
b
a
3,5
pH

b
b
3,0
a

2,5

16 C b
Testigo
ABA 50 mgL-1
14 a ABA 100 mgL-1
acidez titulable (g L-1)

12 a

10

0
-20 0 20 40 60 80 100 120
DDP
Figura 8. Análisis Básicos 2. Análisis del metabolismo primario de 50 bayas del cv. Carménère
de cada tratamiento expuesto a aplicaciones de ABA, tomadas desde 0-105 DDP. A. °Brix; B.
pH; C. acidez titulable. Testigo (círculos abiertos); 50 mgL-1 (triángulos invertidos); 100 mgL-1
(cuadrado). Barras verticales indican E.S. de 5 réplicas biológicas. Letras distintas indican
diferencias significativas entre los tratamientos para cada fecha (p<0.05).

31
 8.4. Efecto del ABA sobre la expresión de genes reguladores y de síntesis de
la ruta fenilpropanoide.

La expresión cuantitativa de 5 genes estructurales de la ruta fenilpropanoide: VvPAL, VvDFR,

VvLAR2, VvANS, VvUFGT y 2 factores de transcripción: VvMYBA1 y VvMYB4A asociados a la
regulación de la síntesis de antocianos, fueron investigados en bayas sin semilla a lo largo de la
maduración.

La expresión VvPAL (figura 9) mostró un fuerte incremento en sus niveles de expresión

inmediatamente 4 días luego de la primera aplicación (-6 DDP) en las bayas asperjadas con 100
mgL-1 de ABA. Este incremento alcanzó aproximadamente 7 veces los niveles de expresión
observados en el testigo. Posteriormente, desde los 0 DDP hasta 35 DDP, la expresión de VvPAL
en las bayas tratadas con 100 mgL-1 fue 4 veces superior al testigo. Incluso, cuando la
concentración interna de ABA en las bayas disminuyó a los 35 DDP (fig. 6), los niveles de
expresión de VvPAL aún mantenían un nivel significativamente superior en las bayas tratadas con
la mayor dosis de la fitohormona comparado con el tratamiento testigo (fig. 9). En el caso de las
bayas tratadas con 50 mgL-1, nunca se observaron diferencias siginificativas en la expresión de
este gen, en comparación con el testigo. Luego, a los 65 DDP, los niveles de expresión de VvPAL
en las bayas tratadas con la mayor concentración de ABA disminuyeron y se mantuvieron con
niveles de expresión similares a los observados en el testigo y aquellas tratadas con 50 mgL-1 de
la fitohormona.

Río abajo en la ruta fenilpropanoide fueron analizados los niveles de expresión de los genes
relacionados al esqueleto de la ruta de síntesis de flavonoides, VvDFR (Fig. 10a) y VvANS (Fig.
10b). Los niveles de expresión de ambos genes fueron proporcionales a la concentración de ABA
de los respectivos tratamientos, a lo largo del desarrollo de la baya. Inmediatamente luego de la
segunda aplicación de ABA, en periodo de pinta (0 DDP), se observa un aumento en la expresión
de VvDFR y VvANS, aunque en el primer caso no se registran diferencias significativas. En
cuanto a VvANS, este gen alcanza niveles de expresión proporcionales a las dosis de la
fitohormona aplicada, alcanzando un incremento de 2 y 3 veces para los tratamientos de 50 mgL-1
y 100 mgL-1 de ABA, respectivamente, en comparación con el testigo. Eso sí, para ambos genes,

32
los niveles de expresión en las bayas tratadas se mantuvieron significativamente superiores al
testigo hasta los 35 DDP, alcanzando un incremento en sus niveles de expresión de 2 veces la
alcanzada en el testigo. Finalmente, los niveles de expresión de VvDFR y VvANS disminuyen a
un nivel mínimo similar al testigo a los 65 DDP (figuras 10a y 10b).

3,0
Testigo
ABA 50 mgL-1
2,5
ABA 100 mgL-1
Expresión relativa

2,0 b

1,5 b

b
1,0

a a a
0,5
a
a
a
0,0
-20 0 20 40 60 80
DDP

Figura 9. Niveles de expresión VvPAL. Efecto sobre los cambios en la expresión del gen
iniciador de la ruta fenilpropanoide VvPAL, bajo diferentes aplicaciones de ABA durante el
proceso de maduración de la baya desde -6 DDP hasta 65 DDP. Testigo (círculos abiertos); 50
mgL-1 (triángulos invertidos); 100 mgL-1 (cuadrado). Los niveles de expresión están
normalizados al gen VvActin2. Barras verticales indican E.S. de 5 réplicas biológicas. Letras
distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos para cada fecha (p<0.05).

En cuanto a los niveles de expresión de VvUFGT (Fig. 10c), que codifica a la enzima relacionada
directamente con la síntesis de antocianos, estos fueron fuertemente incrementados luego de las
aplicaciones exógenas de ABA, encontrándose las mayores diferencias en periodo de pinta,
especialmente en las bayas tratadas con la mayor concentración de la fitohormona. El tratamiento
de 100 mgL-1 muestra diferencias significativas a partir de los -6 DDP, esto es 4 días luego de la
primera aplicación, incrementando sus niveles de expresión hasta 2 veces en comparación con el
testigo y en periodo de pinta este tratamiento alcanzó 3 veces los niveles de expresión del testigo.
Luego, a los 35 DDP, los niveles de expresión de VvUFGT de bayas tratadas disminuyen hasta
niveles similares a los observados en las bayas testigo.

33
 0,7

0,6
A
0,5

Expresión relativa
0,4

0,3
b
0,2 b
a
0,1

0,7
B
0,6 c
Expresión relativa

0,5

0,4 b

0,3
a b
0,2 b
a
0,1

3,5e-4
C Testigo
ABA 50 mgL-1
b
ABA 100 mgL-1
3,0e-4
Expresión relativa

2,5e-4

2,0e-4
a

1,5e-4
b a
1,0e-4
a
a
5,0e-5

0,0
-20 0 20 40 60 80
DDP
Figura 10. Niveles de expresión VvDFR, VvANS y VvUFGT. Efecto sobre los cambios en la
expresión de los genes estructurales de la síntesis de flavonoides, sometidos a aplicaciones de
ABA, durante el proceso de maduración de la baya desde -6 DDP hasta 65 DDP. A. VvDFR; B.
VvANS; C. VvUFGT. Testigo (círculos abiertos); 50 mgL-1 (triángulos invertidos); 100 mgL-1
(cuadrado). Los niveles de expresión están normalizados al gen VvActin2. Barras verticales
indican E.S. de 5 réplicas biológicas. Letras distintas indican diferencias significativas entre los
tratamientos para cada fecha (p<0.05).

34
En relación a los factores de transcripción reguladores de la ruta fenilpropanoide, el factor de
transcripción Myb4a, descrito como un represor homólogo de atMYB4, que en Vitis vinífera se
sabe regula negativamente la expresión de VvUFGT (Matus et al., 2009), se observó que los
niveles de expresión de VvMyb4a (figura 11a) disminuyen desde pinta hasta 35 DDP, contrario a
lo observado con la expresión de VvUFGT (figura 10c) y de manera opuesta al patrón de
concentración de ABA en los distintos tratamientos (figura 6) a lo largo de la maduración de los
frutos. Eso sí, los niveles de expresión de VvMyb4a (fig. 11a) en las bayas tratadas con la mayor
dosis de ABA, fueron significativamente superiores en pinta (0 DDP) y a los 35 DDP en
comparación al testigo. Posteriormente, se observó que los niveles de expresión de este gen
fueron incrementados a los 65 DDP, sin embargo, no se observaron diferencias significativas
entre los tratamientos y el testigo.

Los niveles de expresión de VvMYBA1 (figura 11b) describe una cinética a lo largo del período
de maduración de las bayas similar a lo observado en el contenido de ABA y de la expresión de
los genes VvANS (figura 10a), VvDFR (figura 10b) y VvUFGT (figura 10c), con un fuerte
aumento desde previo a pinta hasta la pinta propiamente tal, con niveles significativamente
superiores en el caso de las bayas tratadas con 100 mgL-1 de ABA a los -6 DDP. En pinta se
observa que los niveles de expresión de VvMYBA1 (figura 11b) fueron incrementados en
respuesta a la dosis aplicada de la fitohormona, alcanzando los tratamientos de 50 mgL-1 y 100
mgL-1 2,6 y 4 veces los niveles de expresión relativa del testigo, respectivamente.
Posteriormente, a los 35 DDP se aprecia una disminución en los niveles de expresión de
VvMYBA1, pero manteniendo las diferencias significativas para las bayas tratadas con la menor
dosis de ABA respecto del testigo y, finalmente, en niveles mínimos de expresión a los 65 DDP,
sin diferencias entre tratamientos (figura 11b).

35
 0,04
A b
ab
0,03
a

Expresión relativa
0,02
b

ab b
0,01 a b
a

B c
Testigo
ABA 50 mgL-1
0,05
ABA 100 mgL-1
Expresión relativa

0,04
b
0,03

0,02 b
ab
a
b
0,01 ab
a
a
0,00
-20 0 20 40 60 80
DDP

Figura 11. Niveles de expresión VvMYB4A y VvMYBA1. Efecto sobre los cambios en la
expresión de los genes reguladores de la síntesis de antocianos, sometidos a aplicaciones de
ABA, durante el proceso de maduración de la baya desde -6 DDP hasta 65 DDP. A. VvMYB4A;
B. VvMYBA1. Testigo (círculos abiertos); 50 mgL-1 (triángulos invertidos); 100 mgL-1
(cuadrado). Los niveles de expresión están normalizados al gen VvActin2. Barras verticales
indican E.S. de 5 réplicas biológicas. Letras distintas indican diferencias significativas entre los
tratamientos para cada fecha (p<0.05).

En cuanto a la síntesis de taninos, la expresión de VvLAR2 (figura 12), isogen que codifica a LAR
específicamente en las pieles de las bayas, se observó que sus niveles de expresión disminuyen
desde pocos días antes de pinta hasta los 35 DDP, aunque, en las bayas tratadas con ABA
disminuyeron más atenuadamente que los del testigo de forma muy similar a lo observado con la
expresión de VvMyb4a (figura 11a). La expresión de VvLAR2 (figura 12), en el periodo de pinta
(0 DDP), alcanza niveles de expresión de 2 y 2,5 veces superiores al testigo para los tratamientos
de 50 mgL-1 y 100 mgL-1, respectivamente. Luego a los 35 DDP, la expresión de VvLAR2 alcanza

36
su nivel más bajo durante la maduración, aunque el tratamiento con la mayor concentración de
ABA, alcanza niveles significativamente superiores al testigo. Posteriormente, a los 65 DDP los
niveles de expresión de VvLAR2 aumentan en promedio hasta los niveles de expresión
observados en plena pinta, nuevamente con promedios superiores al testigo para ambos
tratamientos y en una abundancia significativamente superior en las bayas tratadas con 50 mgL-1
de ABA en comparación con el testigo.

0,04
Testigo
ABA 50 mgL-1
ABA 100 mgL-1
0,03
Expresion relativa

0,02 b
c ab
a
b
0,01
a
b
ab
a
0,00
-20 0 20 40 60 80
DDP

Figura 12. Niveles de expresión VvLAR2. Efecto sobre los cambios en la expresión de VvLAR2,
enzima encargada de la síntesis de flavanoles, sometidos a aplicaciones de ABA, durante el
proceso de maduración de la baya desde -6 DDP hasta 65 DDP. A. VvMYB4A; B. VvMYBA1.
Testigo (círculos abiertos); 50 mgL-1 (triángulos invertidos); 100 mgL-1 (cuadrado). Los niveles
de expresión están normalizados al gen VvActin2. Barras verticales indican E.S. de 5 réplicas
biológicas. Letras distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos para cada
fecha (p<0.05).

37
 8.5. Efecto del ABA sobre la composición fenólica de bayas.

8.5.1. Efecto del ABA sobre el contenido de Antocianos.

El contenido total de antocianos (figura 13), en pieles de bayas sometidas a aplicaciones de 100
mgL-1 de ABA incrementaron significativamente la concentración total de este flavonoide en
todas las fechas analizadas a lo largo de la maduración, así como también para el tratamiento de
50 mgL-1 de ABA, pero en este caso sólo en pinta (0 DDP). Por lo mismo, en el caso de las bayas
tratadas se observó una mayor coloración inmediatamente luego de 10 días desde la primera
aplicación de ABA en comparación con el control, como se observa en las imágenes de la figura
5. Como era esperable, se observó que la acumulación de antocianos aumentó fuertemente desde
pinta, alcanzando su máxima concentración a los 35 DDP. En esta fecha las bayas tratadas con
100 mgL-1 de ABA alcanzaron una concentración de 4900 mgKg-1 equivalentes de malvidina en
comparación al testigo, que alcanzó una concentración de 4000 mgKg-1 equivalentes de
malvidina. Posteriormente, se observa que el contenido de antocianos comenzó a disminuir, hasta
alcanzar los 2900 mgKg-1 equivalentes de malvidina en promedio para todos los tratamientos a
los 105 DDP.

38
 6000

eq. de malvidina (mg Kg-1 peso fresco piel)

5000 b

4000 a
a b
a
a b
3000 ab
a

2000
Testigo
b
b ABA 50 mgL-1
1000
ABA 100 mgL-1
a
0
-20 0 20 40 60 80 100 120
DDP
Figura 13. Concentración Total de Antocianos. Concentración total de antocianos en pieles de
bayas sometidas a diferentes concentraciones de ABA en periodo de pre-pinta, medidas desde 0
DDP hasta 105 DDP. Testigo (círculos abiertos); 50 mgL-1 (triángulos invertidos); 100 mgL-1
(cuadrado). La concentración de antocianos fue medida en equivalentes de malvidina. Barras
verticales indican E.S. de 5 réplicas biológicas. Letras distintas indican diferencias significativas
entre los tratamientos para cada fecha (p<0.05).

39
 8.5.2. Efecto del ABA sobre el Perfil de Antocianos

Al realizar el análisis pormenorizado de los antocianos, fue posible separar e identificar 11

compuestos pertenecientes a este grupo en las pieles de las bayas, como se muestra en la figura
14.

Figura 14. Cromatograma HPLC Antocianos. Perfil cromatográfico del análisis pormenorizado
de antocianos realizado por cromatografía líquida de alta resolución acoplada a un detector de
arreglo de diodos (HPLC-DAD) en pieles de baya de Vitis vinifera cv Carménère sometidas a
tratamientos de aspersión de ABA. Los picos corresponden a (1) delfinidina-3-O-glucosido; (2)
cianidina-3-O-glucosido; (3) petunidina-3-O-glucosido; (4) peonidina-3-O-glucosido; (5)
malvidina-3-O-glucosido; (6) peonidina-3-acetilglucosido; (7) malvidina-3-acetilglucosido; (8)
delfinidina-3-p-cumaroilglucosido; (9) cianidina-3-p-cumaroilglucosido; (10) peonidina-3-p-
cumaroilglucosido; (11) malvidina-3-p-cumaroilglucosido. En el recuadro superior se muestra el
espectro de absorción de la malvidina-3-O-glucosido.

Al separar cada tipo de antociano, fue posible clasificar en 3 grupos estos compuestos según el
motivo que poseen unidos al carbono 3: los antocianos 3-O-glucósido, antocianos 3-O-(6-O-
acetil)-glucósido y antocianos 3-O-(6-O-cumaroil)-glucósido. El grupo de los antocianos 3-O-
glucósido (figura 15a), fue el más abundante, alcanzando una concentración de 2100 mgKg-1 de
peso fresco de piel en promedio, en comparación con los antocianos acetilglucósidos (figura 15b)
y p-cumaroilglucósidos (figura 15c), que solo alcanzaron los 500 mgKg-1 y 150 mgKg-1 en
promedio, respectivamente. En pleno periodo de pinta (0 DDP) fue posible observar que la

40
concentración de antocianos de cada grupo fue significativamente superior en las bayas que
fueron asperjadas con ABA. A los 35 DDP, fecha en que se alcanza la máxima concentración de
antocianos, no se encontraron diferencias significativas entre los tratamientos en el grupo de
antocianos 3 O-glucósidos (figura 15a), pero sí en los acetilglucósidos (figura 15b) y
cumaroilglucósidos (figura 15c) que alcanzaron una concentración de 1,1 y 1,3 veces el
contenido del tratamiento control, en las bayas tratadas con 50 mgL-1 y 100 mgL-1 de ABA
respectivamente. Posteriormente, a los 65 DDP la concentración de antocianos 3 O-glucósidos
comienza a disminuir, aunque las bayas asperjadas con ABA mantienen una concentración
significativamente superior al testigo. En cuanto a los antocianos acetilglucósidos, también a los
65 DDP, solo el tratamiento con la menor dosis de ABA mantuvo una concentración superior al
testigo. En el caso de los antocianos cumaroilglucósidos no se observaron diferencias
significativas entre los tratamientos. Finalmente en la fecha de vendimia (105 DDP) la
concentración de antocianos glucósidos (figura 15a) y acetilglucósidos (figura 15b) en las bayas
tratadas con 100 mgL-1 de ABA alcanzaron una concentración de 1,05 y 1,06 veces superior a la
del testigo respectivamente, mientras los antocianos cumaroilglucósidos (figura 15c) en ambos
tratamientos de ABA alcanzaron una concentración 1,3 veces superior a la observada en el
testigo.

41
 2500
A

eq malvidina (mg Kg-1 peso fresco piel)

b
b
2000
a
b
1500 ab
a

1000

500 b
b
a

B
eq malvidina (mg Kg-1 peso fresco piel)

b
ab b
500
a a

a
400 b
ab
a
300

200

b
100 b

C
eq malvidina (mg Kg-1 peso fresco piel)

b
200 b
b
b
a
150
a

100

Testigo
50 ABA 50 mgL-1
b ABA 100 mgL-1
b
a
0
-20 0 20 40 60 80 100 120
DDP

Figura 15. Concentración Antocianos Glucósidos, Acetilglucósidos y Cumarilglucósidos.

Concentración de antocianos A. Glucósidos, B. Acetilglucósidos y C. Cumaroilglucósidos en
pieles de bayas sometidas a diferentes tratamientos de ABA en periodo de pre-pinta, medidas
desde 0 DDP hasta 105 DDP. Testigo (círculo); 50 mgL-1 (triángulos); 100 mgL-1 (cuadrados). La
concentración de antocianos fue medida en equivalentes de malvidina. Barras verticales indican
E.S. de 5 réplicas biológicas. Letras distintas indican diferencias significativas entre los
tratamientos para cada fecha (p<0.05).

42
Los antocianos en las uvas están basados en los derivados dihidroxilados: cianidina y peonidina,
y los derivados trihidroxilados: delfinidina, petunidina y malvidina, siendo estos tres últimos los
más abundantes en cultivares de bayas viníferas tintas (Hebrero et al. 1988; Roggero et al. 1984).
Los antocianos dihidroxilados se caracterizan por dar coloraciones más rojizas, y los antocianos
trihiroxilados se caracterizan por dar coloraciones violáceas (Castellarin and Di Gaspero 2007;
Nakatsuka et al. 2008). Las aplicaciones de ABA aceleraron la acumulación de ambos tipos de
antocianos, aunque mas fuertemente sobre el contenido de antocianos trihidroxilados. En plena
pinta, las bayas tratadas con 100 mgL-1 de ABA alcanzaron una concentración de 780 mgKg-1 eq.
de malvidina para los antocianos trihidroxilados (figura 16a) y 230 mgKg-1 eq. malvidina para los
dihidroxilados (figura 16b), equivalente a 1,7 y 1,8 veces el contenido del testigo,
respectivamente. A los 35 DDP se observa el máximo contenido de antocianos tanto
trihidroxilados (figura 16a) como dihidroxilados (figura 16b), alcanzando concentraciones de
3500 mgKg-1 y 320 mgKg-1 respectivamente, sin embargo no se observaron diferencias
significativas entre los tratamientos y el testigo. Luego, a los 65 DDP, cuando el contenido de
antocianos comienza a disminuir (figura 13), las pieles de bayas asperjadas con ABA muestran
un incremento significativamente superior al testigo sobre el contenido de antocianos
trihidroxilados (figura 16a) y dihidroxilados (figura 16b), alcanzando 1,07 y 1,4 veces el
contenido del testigo respectivamente. Finalmente, a los 105 DDP los antocianos trihidroxilados
alcanzan una concentración de 2500 mgKg-1 eq. malvidina, sin mostrar diferencias significativas
con el testigo, mientras que los antocianos dihidroxilados en las pieles de bayas con la aplicación
más concentrada de la fitohormona mantuvieron una concentración significativamente superior
alcanzando los 210 mgKg-1 eq. malvidina, equivalente a 1,3 veces la concentración del testigo. Al
observar la relación de antocianos trihidroxilados/dihidroxilados (figura 16c) desde los 0 DDP
hasta los 35 DDP, no se observan diferencias entre las bayas asperjadas y las testigo. Sin
embargo, a partir de los 65 DDP hasta los 105 DDP esta relación es significativamente mayor en
las bayas testigo respecto de las tratadas.

43
 A

eq malvidina (mg Kg-1 peso fresco piel)

b
b
3000
a

2000

1000 b
b
a

B
eq malvidina (mg Kg-1 peso fresco piel)

300 c

b b
b a b
200
a
a
a
100
Relación antocianos 3´4´5´-OH / 3´4´-OH

C b
b
15 b
b
a a

10

5 b Testigo
ab ABA 50 mgL-1
a ABA 100 mgL-1

0
-20 0 20 40 60 80 100 120
DDP

Figura 16. Concentración Antocianos Trihidroxilados y Dihidroxilados. Concentración de

antocianos A. TriOH y B. DiOH, y C. relación TriOH/DiOH en pieles de bayas sometidas a
diferentes tratamientos de ABA en periodo de pre-pinta, medidas desde 0 DDP hasta 105 DDP.
Testigo (círculo); 50 mgL-1 (triángulos); 100 mgL-1 (cuadrados). La concentración de antocianos
fue medida en equivalentes de malvidina. Barras verticales indican E.S. de 5 réplicas biológicas.
Letras distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos para cada fecha (p<0.05).

44
En la figura 17 se observa la acumulación de cada antociano perteneciente al grupo de los 3-O-
glucósidos en pieles de las bayas a lo largo de la temporada. En plena pinta (0 DDP) los
antocianos trihidroxilados, delfinidina 3-O-glucósido (figura 17a) y petunidina 3-O-glucósido
(figura 17b), muestran un incremento significativo sólo en el tratamiento de 50 mgL-1 de ABA
con respecto al testigo, en cambio el contenido de malvidina 3-O-glucósido (figura 17c) en
ambos tratamientos de ABA se aprecia un incremento significativo. Por otra parte, los antocianos
dihidroxilados, el contenido de cianidina 3-O-glucósido (figura 17d) fue similar al testigo,
mientras que la concentración de peonidina 3-O-glucósido (figura 17e) el tratamiento de 100
mgL-1 alcanzó una concentración superior al testigo. Posteriormente, a los 35 DDP se observa que
los tratamientos de ABA disminuyeron significativamente sólo el contenido de cianidina 3-O-
glucósido (figura 17d) en comparación con el testigo. A los 65 DDP, en las bayas tratadas con
ABA, el contenido de antocianos precursores: delfinidina 3-O-glucósido (figura 17a) y cianidina
3-O-glucósido (figura 18d), fueron similares a los observados en las bayas testigo. Por otra parte,
los antocianos derivados: malvidina 3-O-glucósido (figura 18c) y peonidina 3-O-glucósido
(figura 18e), alcanzaron concentraciones significativamente superiores en ambos tratamientos de
ABA con respecto al testigo. Finalmente a los 105 DDP, los antocianos precursores y petunidina
3 O-glucósido (figura 18b) alcanzaron una concentración significativamente menor en las bayas
tratadas con ABA. Para esta misma fecha malvidina 3-O-glucósido (figura 16c) presentó una
concentración superior únicamente en las bayas tratadas con 100 mgL-1 de ABA con respecto al
testigo, mientras que el contenido de peonidina 3-O-glucósido (figura 18e), fue incrementado
proporcionalmente según las dosis aplicadas de ABA, alcanzando 96 mgKg-1 eq. malvidina, 117
mgKg-1 eq. malvidina y 154 mgKg-1 eq. malvidina para los tratamientos testigo, 50 mgL-1 ABA
y 100 mgL-1 de ABA respectivamente.

45
 A 60 D b
b
400 a
a ab
45
300 a

b 30 b
200 b ab ab
a a
ab
100 a 15
eq malvidina (mg Kg-1 peso fresco piel)

B b
E
400 200
c
b
300 150 b c
b
a ab
a b
a b
200 100 a
a
a
b
100 a 50
a

C b b
-20 0 20 40 60
DDP
80 100 120

2000
a b
ab
1500 a

1000

Testigo
500 b -1
ABA 50 mgL
b -1
ABA 100 mgL
a
0
-20 0 20 40 60 80 100 120
DDP

Figura 17. Concentración Antocianos Glucósidos. Concentración de cada antociano

correspondiente al grupo de los 3-O-glucósidos. En el panel izquierdo se observan los antocianos
derivados de delfinidina A. Delfinidina 3-O-glucósido, B. Petunidina 3-O-glucósido, C.
Malvidina 3-O-glucósido, y en el panel derecho se observan los antocianos derivados de
cianidina D. Cianidina 3-O-glucósido y E. Peonidina 3-O-glucósido en pieles de bayas sometidas
a diferentes tratamientos de ABA en periodo de pre-pinta, medidas desde 0 DDP hasta 105 DDP.
Testigo (círculo); 50 mgL-1 (triángulos); 100 mgL-1 (cuadrados). La concentración de antocianos
fue medida en equivalentes de malvidina. Barras verticales indican E.S. de 5 réplicas biológicas.
Letras distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos para cada fecha (p<0.05).

46
 8.5.3. Polifenoles de bajo peso molecular

En la figura 19 se muestra el cromatograma correspondiente al perfil de polifenoles de bajo peso

molecular en las pieles de las bayas. Fue posible separar e identificar dos tipos flavonoides: las
proantocianidinas, catequina y epicatequina, y los flavonoles, principalmente miricetina-3-O-
glucósido, quercitina-3-O-glucósido y kaempferol-3-O-glucósido.

Figura 18. Cromatograma HPLC Polifenoles de bajo peso Molecular. Perfil cromatográfico del
análisis pormenorizado de los polifenoles de bajo peso molecular realizado por cromatografía
líquida de alta resolución acoplada a un detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD) en pieles de
baya de Vitis vinifera cv Carménère sometidas a tratamientos de aspersión de ABA. Los picos
corresponden a (1) catequina; (2) epicatequina; (3) flavonol 1; (4) miricetina-3-O-glucósido; (5)
flavonol 2; (6) quercitina-3-O-glucósido; (7) flavonol 3; (8) flavonol 4; (9) Kaempferol-3-O-
glucósido.

8.5.4. Proantocianidinas (PAs)

Las proantocianidinas condensadas, también llamadas taninos, son antioxidantes fuertes y poseen
efectos benéficos para la salud humana incluyendo la protección contra el daño causado por
radicales libres y enfermedades cardiovasculares (Bagchi et al. 2000; Cos et al. 2004; Lin et al.
2002). Al realizar un análisis pormenorizado de polifenoles de bajo peso molecular fue posible
identificar y cuantificar catequina y epicatequina. La concentración de los monómeros de
catequina (figura 20a) y epicatequina (figura 20b), fue significativamente superior en las bayas

47
con la aplicación de mayor concentración de ABA en comparación con el testigo en periodo de
pinta (0 DDP). La concentración de estos monómeros disminuyó para todos los tratamientos a los
35 DDP alcanzando sus niveles más bajos en la temporada, con un promedio de 0,4 mgKg-1 y
0,15 mgKg-1 para los monómeros de catequina y epicatequina respectivamente, sin diferencias
significativas entre los tratamientos (figuras 20a y 20b). A los 65 DDP se observa un nuevo
incremento en la concentración de estos monómeros en general, sin embargo, los monómeros de
catequina (figura 20a) registran una menor concentración en las bayas con aplicación de ABA en
comparación con el testigo. Los monómeros de epicatequina (figura 20b), en esta misma fecha,
en las bayas asperjadas con la mayor concentración de ABA fueron significativamente superior
en concentración en comparación al testigo, alcanzando un promedio de 0,9 mgKg-1 en
comparación con los 0,4 mgKg-1 observados en el testigo. Finalmente, a los 105 DDP la
concentración de catequina disminuye nuevamente y las bayas con la mayor concentración de
ABA se mantienen con un contenido significativamente menor a los restantes tratamientos.
También a los 105 DDP, la concentración de epicatequina resultó ser significativamente superior
al testigo, alcanzando un promedio en ambos tratamientos de 0,8 mgKg-1 en comparación con el
testigo que sólo alcanzó los 0,4 mgKg-1.

La concentración de taninos totales (figura 20c) en periodo de pinta (0 DDP) no mostró

diferencias significativas entre los tratamientos y el testigo, promediando los 6 mg g-1 para todos
los tratamientos. A los 35 DDP la concentración de taninos disminuyó en todos los tratamientos,
aunque menos fuertemente en las bayas a las que se les aplicó la mayor concentración de ABA,
siendo significativamente superior a la del testigo. En la fecha posterior, esto es a los 65 DDP, la
concentración de taninos aumenta alcanzando una concentración de 10 mgg-1 para el tratamiento
al cual se le aplicó la mayor concentración de ABA y 8,5 mgg-1 en el testigo. Finalmente, la
concentración de taninos totales (figura 20c), a los 105 DDP, alcanzó una concentración
significativamente superior en las bayas con aplicación de ABA, en comparación con el testigo.

48
 2,0
A

Catequina (mg Kg-1 peso fresco piel)

c

1,6
b

1,2

a b
0,8 ab
b
a
a
a
0,4

B
epicatequina (mg Kg-1 peso fresco piel)

1,0
b b
0,8 b

0,6
a
a
0,4 a
b

0,2 a
a

C
Procianidina (mg g-1 peso fresco piel)

b
10
a
b
8 a b
a

b
4
a
a
2 Testigo
ABA 50 mgL-1
ABA 100 mgL-1
0
-20 0 20 40 60 80 100 120
DDP

Figura 19. Concentración de Taninos. Concentración de monómeros de proantocianidinas: A.

Catequina, B. Epicatequina y C. taninos totales en pieles de bayas sometidas a diferentes
tratamientos de ABA en periodo de pre-pinta, medidas desde 0 DDP hasta 105 DDP. Testigo
(círculo); 50 mgL-1 (triángulos); 100 mgL-1 (cuadrados). La concentración de taninos totales fue
medida en equivalentes de procianidina. Barras verticales indican E.S. de 5 réplicas biológicas.
Letras distintas indican diferencias significativas entre los tratamientos para cada fecha (p<0.05).

49
 8.5.5. Flavonoles

El tercer grupo de flavonoides analizados en las pieles de las bayas fueron los flavonoles, los
cuales se encuentran en una menor concentración en comparación con los antocianos y las
proantocianidinas. Los importancia de los flavonoles radica en su gran capacidad antioxidante y
su capacidad de formar complejos de copigmentación con antocianos, aumentando su
extractibilidad durante la vinificación (Schwarz et al. 2005). Además, se los ha asociado con la
astrigencia tipo terciopelo de los vinos tintos (Hufnagel and Hofmann 2008). Los principales
flavonoles encontrados en las uvas son Miricetina 3-O-glucósido (figura 21a), Kaempferol 3-O-
glucósido (figura 21b) y Quercetina 3-O-glucósido (figura 21c), siendo el tercero el de mayor
abundancia. Inicialmente, la concentración de flavonoles (figura 21d) fue promovida por las
aplicaciones de ABA alcanzando un máximo a los 35 DDP, significativamente superior al testigo.
A los 65 DDP, las bayas tratadas tendieron a disminuir la concentración de estos metabolitos,
mientras que en las bayas testigo incrementaron su concentración alcanzando su máximo
contenido durante la temporado (figura 21d). Finalmente, a los 105 DDP se observa una
tendencia a la disminución en la concentración de flavonoles (figura 21d) como se observó a los
65 DDP en las bayas tratadas, sin embargo, se mantuvo un incremento significativo en el
contenido de flavonoles del testigo frente a las bayas tratadas.

50
 10 30
A 25
C
8 b
b b
20 b
equivalentes quercitina (mgKg -1 peso fresco piel) c ab c
6
a
a 15 b b
a
4 b
a a
10 ab
a
a
2
5

B b

b 50
D b
b
ab
b
8 b
b a
b a
40
b a
6 a
b
a a
30
4 a
20
c
Testigo
2 b ABA 50 mgL-1
10 a ABA 100 mgL-1

0 0
-20 0 20 40 60 80 100 120 -20 0 20 40 60 80 100 120
DDP DDP

Figura 20. Concentración de Flavonoles. Concentración de A. Miricetina 3-O-glucósido, B.

Kaempferol 3-O-glucósido, C. Quercetina 3-O-glucósido, D. Flavonoles totales en pieles de
bayas sometidas a diferentes tratamientos de ABA en periodo de pre-pinta, medidas desde 0 DDP
hasta 105 DDP. Testigo (círculo); 50 mgL-1 (triángulos); 100 mgL-1 (cuadrados). La
concentración de taninos totales fue medida en equivalentes de quercetina. Barras verticales
indican E.S. de 5 réplicas biológicas. Letras distintas indican diferencias significativas entre los
tratamientos para cada fecha (p<0.05).

51
9. Discusión

En años recientes se han realizado diversos estudios en relación a los efectos del ABA sobre las
bayas de vides viníferas en pinta, ya sea por medio de manejos de riego deficitario (Castellarin et
al. 2007a; Castellarin et al. 2007c; Deluc et al. 2009), o directamente realizando aplicaciones
exógenas de esta fitohormona (Giribaldi et al. 2010; Koyama et al. 2010; Wheeler et al. 2009).
Lo anterior, con el propósito de comprender los mecanismos que subyacen a la compleja red de
señalización mediada por esta hormona y la forma en que afecta el proceso de maduración y
desarrollo. En el presente estudio, fue posible observar que luego de las aspersiones de soluciones
de 50 mgL-1 y 100 mgL-1 de ABA en pre-pinta, aumenta el contenido de (S)-cis-ABA en pinta
(figura 6), momento en cual esta fitohormona alcanza su máxima acumulación, hasta 2 meses
luego de pinta. El fuerte incremento en la concentración de ABA acelera tanto la acumulación de
azúcares (figura 8a) y antocianos (figura 13), como la disminución de la acidez de la baya
(figuras 8b y 8c), indicando un adelantamiento de la maduración, tal como ya ha sido informado
en estudios de maduración incorporando análisis de transcriptómica (Koyama et al. 2010) y
proteómica (Giribaldi et al. 2010). Además, similar a resultados informados en uva de mesa
(Peppi et al. 2008), se observó un aumento en el peso de piel en comparación con el peso total de
las bayas (figura 7c), característica muy deseable en una baya vinífera tinta, ya que es en este
tejido donde se encuentran los principales compuestos fenólicos que confieren atributos
organolépticos al vino final.

Es sabido que los antocianos se sintetizan principalmente en pinta y que la expresión del gen
VvUFGT se incrementa fuertemente en esta etapa del desarrollo, y que ambos eventos están
estrechamente relacionados a los niveles de ABA (Koyama et al. 2010; Wheeler et al. 2009). Los
cambios en la expresión de VvMYBA1 (figura 11b), VvUFGT (figura 10c) y la concentración
interna de (s)-cis-ABA (figura 6), producto de la aplicación de la fitohormona, siguen un patrón
muy similar a lo largo del desarrollo de la baya, en donde los máximos incrementos de expresión
de los genes y acumulación de la hormona, ocurrieron en pinta, disminuyendo luego a los 35
DDP. Estos cambios se tradujeron en un incremento en la concentración de antocianos (figura 13)
desde pinta hasta los 35 DDP, fecha en la cual se encontró la máxima concentración de este
flavonoide. Posteriormente, estos pigmentos comenzaron a disminuir a lo largo del resto de la

52
temporada (figura 13), aunque las bayas tratadas con ABA siempre mantuvieron una mayor
concentración de antocianos en comparación con el testigo.

Los antocianos son sintetizados en la cara citosólica del retículo endoplasmático y acumulados en
la vacuola en donde son inmediatamente ionizados en el catión flavilium, otorgándoles la
pigmentación a estos compuestos, los que posteriormente son concentrados en estructuras
conocidas como inclusiones vacuolares antociánicas (AVIs) (Markham et al. 2000). Sin embargo,
la estabilidad del color de los antocianos puede ser afectada por cambios de pH (Brouillard and
Delaporte 1977; Brouillard and Dubois 1977; Marco and Scarminio 2007; Ribéreau-Gayon
1998). Se ha reportado que en soluciones ácidas existen cuatro transformaciones de la molécula
de antocianinas que coexisten en equilibrio: el catión flavilium (color rojizo), la pseudobase
carbinol (incoloro), la base quinoidal (color violáceo) y la forma chalcona (color amarillo)
(Brouillard and Dubois 1977). Las vacuolas de las bayas mantienen un pH ácido, desde pH 2,5 en
estado de tamaño de arveja, a pH 4 aproximadamente durante la maduración, siendo el
mantenimiento del gradiente iónico vacuolar y el pH, esencial para la homeostasis de ácidos y
azúcares en la baya. A un pH menor a 3 predominan las estructuras de catión flavilium, pero a
medida que el pH se incrementa, la competencia cinética y termodinámica produce la reacción de
hidratación del catión flavilium, formando la pseudobase incolora (Brouillard and Dubois 1977).
Una forma de evitar el decoloramiento de los antocianos es que en la composición total de
antocianos exista una proporción mayor de antocianos de menor polaridad y de esta forma
proteger al catión flavilium del ataque nucleofílico del agua. Las bayas tratadas con ABA
resultaron tener un menor contenido de antocianos precursores como delfinidina (figura 18a) y
cianidina (figura 18d), y un incremento en el contenido de sus derivados malvidina (figura 18c) y
peonidina (figura 18e), los cuales son menos polares que sus precursores y, por lo tanto más
estables. Además, debido a las diferentes modificaciones causadas en el motivo 3-O-glucósido
de los antocianos, las acilaciones (figuras 15b y 15c) los vuelven menos sensibles a los cambios
de pH, permitiendo una mayor estabilidad del catión flavilium, manteniendo así su pigmentación
y aumentando su estabilidad contra glucosidasas (Springob et al. 2003). Este aumento en la
concentración de estructuras de antocianos más estables permitiría en forma práctica producir una
mejor calidad de antocianos, lo cual se traduciría en una mayor estabilidad del color permitiendo
el envejecimiento de vinos.

53
El patrón de hidroxilación del anillo B de los antocianos es el mayor determinante del color de
estos pigmentos. La hidroxilación puede ocurrir en 2 posiciones, que son controladas por enzimas
del tipo citocromo P450, como lo es la F3`H, que guían hacia la formación de antocianos
derivados de cianidina los que presentan tonos más rojizos, y la F3`5`H, que es requerida para la
formación de antocianos derivados de delfinidina que poseen coloración violáceas. El efecto
sobre el patrón de expresión de estas enzimas y el perfil antocianico ha sido observado tanto en
petunia (Nakatsuka et al. 2008; Winkel-Shirley 2001) como en diferentes cultivares de vid
(Castellarin et al. 2006; Castellarin and Di Gaspero 2007) demostrando como afectan los distintos
tipos de antocianos la coloración final de flores y frutos. Por otra parte, se ha observado que la
expresión en bayas de vid de VvF3`H es incrementada desde etapas anteriores a la pinta,
específicamente desde el estado de tamaño de arveja, en comparación con la expresión de
VvF3`5`H en la que solo se observa un incremento desde pinta en adelante (Castellarin et al.
2006). Además, se han realizado diversos estudios en relación a la acumulación de antocianos
inducida por estrés hídrico en vides en el periodo anterior a pinta, observando que existe un fuerte
incremento en la síntesis de antocianos trihidroxilados, hasta un mes luego de pinta (Castellarin et
al. 2007b; Deluc et al. 2009). Los frutos de la vid del cv. Carménère poseen tonalidades
violáceas, observándose que los derivados trihidroxilados representan cerca del 90% de la
totalidad de los antocianos a lo largo de la temporada. En el presente estudio, no todos los
antocianos responden en la misma magnitud al aplicar ABA en pre-pinta (figuras 16 y 17).
Inmediatamente luego de la aplicación, el ABA induce un fuerte aumento en el contenido de
antocianos trihidroxilados (figura 16a), pero más tarde en la temporada, próximo a la fecha de
vendimia, desde los 65 DDP hasta los 105 DDP, las bayas asperjadas con ABA presentan un
mayor contenido de antocianos dihidroxilados (figura 16b). Más aún, se observa una
disminución en la proporción entre antocianos trihidroxilados/dihidroxilados (figura 16c) en las
pieles de las bayas tratadas con ABA.

La diversidad de los flavonoles también depende del patrón de hidroxilación del anillo B. Similar
a lo observado en bayas de vitis vinífera cv. Cabernet Sauvignon (Jeong et al. 2006), el flavonol
de mayor abundancia es Quercetina 3-O-Glucósido (figura 20c), sintetizado río abajo de la
enzima F3`H. La síntesis de flavonoles es dependiente de la expresión de VvFLS1, y estudios
realizados en pieles de bayas del cv. Syrah han demostrado que en condiciones normales existe

54
una fuerte expresión de este gen luego de 50 DDP, el cual es acompañado con un incremento en
el contenido de flavonoles (Downey et al. 2003). Por otra parte, se ha observado que aplicaciones
de ABA en periodo de pinta sobre bayas de vid de dos diferentes cepas: Cabernet Sauvignon y
Merlot, aumenta la expresión de VvFLS4 y VvFLS5, así como el contenido de flavonoles un mes
después de la aplicación (Fujita et al. 2006). Es posible apreciar que las aplicaciones de ABA
sobre racimos de cv. Carménère en el periodo previo a pinta, incrementan el contenido de
flavonoles desde pinta hasta 35 DDP (figuras 20a, 20c y 20d), pero a partir de los 65 DDP hasta
la vendimia el contenido de este flavonoide disminuye respecto del testigo. Tal disminución
puede ser efecto del incremento en la expresión de VvDFR (figura 10a), cuyo producto de gen
compite directamente con FLS por el mismo sustrato (dihidroflavonoles).

Debido a que flavonoles, proantocianidinas y antocianos, comparten sustratos de la ruta

Fenilpropanoide, existen diversos genes reguladores (factores de transcripción) que controlan la
expresión de genes involucrados en su ruta de síntesis. Lo anterior evita la competencia por los
sustratos que comparten durante su síntesis (Hichri et al. 2011).

Algunos factores de transcripción MYB poseen actividad represora, inhibiendo la síntesis de

compuestos fenólicos (Aharoni et al. 2001; Jin et al. 2000). FaMYB1, por ejemplo, es un represor
de la síntesis de antocianos en frutilla. Debido a que los flavonoides son sinetizados en la cara
citosólica del retículo endoplasmático, transportados y acumulados en la vacuola, se ha sugerido
que la función de FaMYB1 es la de regular el exceso de los niveles de flavonoides cuando estos
compuestos no son transportados eficientemente a dicho organelo, acumulándose en el
citoplasma y causando un efecto citotóxico (Aharoni et al. 2001). En uvas, el factor de
transcripción represor de la síntesis de antocianos VvMYB4a (figura 11a), aumenta sus niveles de
expresión en bayas tratadas en comparación con el testigo a los 0 DDP (pinta) y 35 DDP, luego
del fuerte incremento en la síntesis de antocianos (figura 13), ocurrida por las aplicaciones
exógenas de ABA. Al reprimirse la síntesis de antocianos, el flujo de intermediarios derivados de
la ruta fenilpropanoide puede ser utilizado en la síntesis de otros flavonoides que comparten la
ruta de síntesis como los taninos. Más aún, del análisis del patrón de expresión de VvMYB4a
(figura 11a) a lo largo de la temporada, se sugiere que existe una relación entre la reducción en la
síntesis de antocianos (figura 13) y el aumento en la síntesis de taninos (figura 19), ya que al

55
disminuir los niveles de expresión de VvMYBA1 (figura 11b) disminuye VvUFGT (figura 10c),
aumenta VvMYB4a (figura 11a) y aumenta VvLAR2 (figura 12). Por otra parte, se ha observado
que la síntesis de proantocianidinas ocurre principalmente en los estadíos tempranos del
desarrollo de la baya (Bogs et al. 2005; Bogs et al. 2007; Terrier et al. 2009; Verries et al. 2008) y
se propone que su síntesis es finalizada en periodo de envero. En la presente investigación
desarrollada en vides del cv. Carménère, por primera vez fue posible observar que existe un
segundo periodo de síntesis de proantocianidinas a partir de los 65 DDP, en la que se observa un
incremento en la expresión de VvLAR2 (figura 12) y en la concentración de taninos (figura 19c),
la que resulta más fuertemente incrementada por las aplicaciones de ABA. Además, fue posible
observar que la expresión de los genes estructurales de la ruta fenilpropanoide: VvPAL (figura 9),
VvDFR (figura 10a) y VvANS (figura 10b) mostraron un incremento en su expresión
principalmente a partir de envero, promoviendo la síntesis de antocianos. Sin embargo, fue
posible observar, así mismo, que a los 35 DDP, la expresión de VvUFGT disminuyó hasta un
estado basal mientras que los genes señalados, aún a los 35 DDP, muestran mayores niveles de
expresión en comparación con el testigo, permitiendo generar intermediarios para la síntesis de
taninos (figura 19c). Por otra parte, los niveles de expresión de VvLAR2 (figura 12) presenta un
patrón de expresión muy similar al de VvMYB4a en la temporada, corroborando la existencia de
una relación inversa entre el contenido de antocianos y de taninos.

En varias especies vegetales, el complejo transcripcional MYB/bHLH/WDR ha sido identificado

como necesario en la regulación de la síntesis de taninos y antocianos, productos finales de la ruta
de los fenilpropanoide. En años recientes, se aisló el primer factor bHLH en vides, MYCA1
(Matus et al. 2010), y se observó que su perfil de expresión posee dos fuertes incrementos, el
primero cuando la baya se encuentra en tamaño de arveja, equivalentes al tiempo en que se activa
la expresión de VvANR involucrado en la síntesis de taninos, y el segundo en pinta, cuando se
incrementa la expresión de VvUFGT involucrado en la síntesis de antocianos. Además, MYBPA1
ha sido caracterizado como un factor de transcripción capaz de regular, específicamente, la
síntesis de taninos (Bogs et al. 2007; Czemmel et al. 2009). Se ha sugerido que en el periodo de
pinta, cuando MYBA1 se vuelve más abundante en las pieles de las bayas, podría competir con
MYBPA1 por la interacción con MYCA1 y, de esta forma, cambiar el producto final que es
sintetizado desde tanino a antociano (Deluc et al. 2008). El aumento en la expresión del factor

56
represor VvMYB4a, al aplicar ABA (figura 11a) podría implicar un aumento en la interacción
MYBPA1 con MYCA1, o bien, una disminución de la interacción MYBA1 con MYCA1, lo que
podría ser la causa del efecto observado en el incremento en la expresión de VvLAR2 (figura 12)
y en el contenido de taninos (figura 19c) hacia el final de la temporada. Por otra parte, estudios de
activación de promotores han demostrado que MYBPA1 activa el promotor de VvDFR entre
otros (Bogs et al. 2007; Czemmel et al. 2009). Como se mencionó anteriormente la expresión de
VvDFR (figura 10a) fue incrementada aún después de que la expresión de VvUFGT (figura 10c)
disminuyera hasta un estado basal, y debido que DFR compite por FLS, el incremento en la
expresión de VvMYB4a no sólo cambiaría el producto final sintetizado de antociano a tanino, sino
que también a través de VvMYBPA1 evitaría la segregación de los sustratos río arriba, necesarios
para la síntesis de proantocianidinas disminuyendo la concentración de flavonoles.

57
10. Conclusión

En el presente estudio, se observó el impacto del incremento del contenido de ABA en periodo
de pre-pinta, sobre la maduración de la baya y acumulación de metabolitos secundarios.

Este trabajo ha demostrado que un aumento en los niveles de ABA activo se correlacionan con el
inicio de la maduración y que ABA promueve la maduración cuando se aplica a las bayas durante
el período pre-pinta incrementando el contenido de azúcares y antocianos, y disminuyendo la
acidez de las bayas. Estos resultados confirman que el ABA está involucrado en el inicio de la
maduración de bayas.

Por otra parte, la mejor comprensión de la red de regulación de la ruta fenilpropanoide,

principalmente la rama de los flavonoides, nos permitió analizar los efectos causados por las
aplicaciones de ABA, sobre el producto final sintetizado de esta a ruta a lo largo de la
maduración de la baya. Este apunta principalmente hacia la síntesis de antocianos y flavonoles en
el periodo desde pinta hasta los 35 DDP, y finalmente disminuye y cambia hacia la síntesis de
taninos, desmitificando que la síntesis de taninos finaliza en envero. Además de encontrar un
segundo periodo de síntesis de taninos, está es incrementada por ABA luego de 70 días de
realizar la última aplicación, aunque disminuye el contenido de flavonoles. Por otra parte, fue
posible observar que las aplicaciones de ABA no solo incrementaron el contenido de antocianos,
sino que fue posible incrementar la calidad de este flavonoide.

58
11. Bibliografía

Agarwal M, Hao Y, Kapoor A, Dong CH, Fujii H, Zheng X, Zhu JK (2006) A R2R3 type MYB
transcription factor is involved in the cold regulation of CBF genes and in acquired freezing
tolerance. J Biol Chem 281: 37636-37645

Ageorges A, Issaly N, Picaud S, Delrot S, Romieu C (2000) Identification and functional

expression in yeast of a grape berry sucrose carrier. Plant Physiology and Biochemistry 38: 177-
185

Aharoni A, De Vos CH, Wein M, Sun Z, Greco R, Kroon A, Mol JN, O'Connell AP (2001) The
strawberry FaMYB1 transcription factor suppresses anthocyanin and flavonol accumulation in
transgenic tobacco. Plant J 28: 319-332

Bagchi D, Bagchi M, Stohs SJ, Das DK, Ray SD, Kuszynski CA, Joshi SS, Pruess HG (2000)
Free radicals and grape seed proanthocyanidin extract: importance in human health and disease
prevention. Toxicology 148: 187-197

Barnavon L, Doco T, Terrier N, Ageorges A, Romieu C, Pellerin P (2000) Analysis of cell wall
neutral sugar composition, [beta]-galactosidase activity and a related cDNA clone throughout the
development of Vitis vinifera grape berries. Plant Physiology and Biochemistry 38: 289-300

Bate-Smith EC (1981) Astringent tannins of the leaves of Geranium species. Phytochemistry 20:
211-216

Baudry A, Heim MA, Dubreucq B, Caboche M, Weisshaar B, Lepiniec L (2004) TT2, TT8, and
TTG1 synergistically specify the expression of BANYULS and proanthocyanidin biosynthesis in
Arabidopsis thaliana. The Plant Journal 39: 366-380

Bogs J, Downey MO, Harvey JS, Ashton AR, Tanner GJ, Robinson SP (2005) Proanthocyanidin
synthesis and expression of genes encoding leucoanthocyanidin reductase and anthocyanidin
reductase in developing grape berries and grapevine leaves. Plant Physiol 139: 652-663

59
Bogs J, Jaffe FW, Takos AM, Walker AR, Robinson SP (2007) The grapevine transcription
factor VvMYBPA1 regulates proanthocyanidin synthesis during fruit development. Plant Physiol
143: 1347-1361

Boss PK, Davies C, Robinson SP (1996) Analysis of the Expression of Anthocyanin Pathway
Genes in Developing Vitis vinifera L. cv Shiraz Grape Berries and the Implications for Pathway
Regulation. Plant Physiol 111: 1059-1066

Brouillard R, Delaporte B (1977) Chemistry of anthocyanin pigments. 2. Kinetic and

thermodynamic study of proton transfer, hydration, and tautomeric reactions of malvidin 3-
glucoside. Journal of the American Chemical Society 99: 8461-8468

Brouillard R, Dubois J-E (1977) Mechanism of the structural transformations of anthocyanins in

acidic media. Journal of the American Chemical Society 99: 1359-1364

Castellarin S, Di Gaspero G, Marconi R, Nonis A, Peterlunger E, Paillard S, Adam-Blondon A-F,

Testolin R (2006) Colour variation in red grapevines (Vitis vinifera L.): genomic organisation,
expression of flavonoid 3'-hydroxylase, flavonoid 3',5'-hydroxylase genes and related metabolite
profiling of red cyanidin-/blue delphinidin-based anthocyanins in berry skin. BMC Genomics 7:
12

Castellarin S, Matthews M, Di Gaspero G, Gambetta G (2007a) Water deficits accelerate

ripening and induce changes in gene expression regulating flavonoid biosynthesis in grape
berries. Planta 227: 101-112

Castellarin S, Pfeiffer A, Sivilotti P, Degan M, Peterlunger E, DIG G (2007b) Transcriptional

regulation of anthocyanin biosynthesis in ripening fruits of grapevine under seasonal water
deficit. Plant Cell Environ 30: 1381 - 1399

Castellarin SD, Di Gaspero G (2007) Transcriptional control of anthocyanin biosynthetic genes in

extreme phenotypes for berry pigmentation of naturally occurring grapevines. BMC Plant Biol 7:
46

60
Castellarin SD, Pfeiffer A, Sivilotti P, Degan M, Peterlunger E, Di Gaspero G (2007c)
Transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis in ripening fruits of grapevine under
seasonal water deficit. Plant, Cell & Environment 30: 1381-1399

Cominelli E, Galbiati M, Vavasseur A, Conti L, Sala T, Vuylsteke M, Leonhardt N, Dellaporta

SL, Tonelli C (2005) A guard-cell-specific MYB transcription factor regulates stomatal
movements and plant drought tolerance. Curr Biol 15: 1196-1200

Coombe B (1976) Development of fleshy fruits. Annual Review of Plant Physiology and Plant
Molecular Biology 27: 207-228

Coombe BG, Hale CR (1973) The hormone content of ripening grape berries and the effects of
growth substance treatments. Plant Physiol 51: 629-634

Cos P, De Bruyne T, Hermans N, Apers S, Berghe DV, Vlietinck AJ (2004) Proanthocyanidins in

health care: current and new trends. Curr Med Chem 11: 1345-1359

Cutanda-Perez MC, Ageorges A, Gomez C, Vialet S, Terrier N, Romieu C, Torregrosa L (2009)

Ectopic expression of VlmybA1 in grapevine activates a narrow set of genes involved in
anthocyanin synthesis and transport. Plant Mol Biol 69: 633-648

Czemmel S, Stracke R, Weisshaar B, Cordon N, Harris NN, Walker AR, Robinson SP, Bogs J
(2009) The grapevine R2R3-MYB transcription factor VvMYBF1 regulates flavonol synthesis in
developing grape berries. Plant Physiol 151: 1513-1530

Chervin C, El-Kereamy A, Roustan J-P, Latché A, Lamon J, Bouzayen M (2004) Ethylene seems
required for the berry development and ripening in grape, a non-climacteric fruit. Plant Science
167: 1301-1305

da Silva FG, Iandolino A, Al-Kayal F, Bohlmann MC, Cushman MA, Lim H, Ergul A, Figueroa
R, Kabuloglu EK, Osborne C, Rowe J, Tattersall E, Leslie A, Xu J, Baek J, Cramer GR,
Cushman JC, Cook DR (2005) Characterizing the grape transcriptome. Analysis of expressed
sequence tags from multiple Vitis species and development of a compendium of gene expression
during berry development. Plant Physiol 139: 574-597

61
Davies C, Robinson SP (1996) Sugar accumulation in grape berries. Cloning of two putative
vacuolar invertase cDNAs and their expression in grapevine tissues. Plant Physiol 111: 275-283

Davies C, Wolf T, Robinson SP (1999) Three putative sucrose transporters are differentially
expressed in grapevine tissues. Plant Science 147: 93-100

de Vetten N, Quattrocchio F, Mol J, Koes R (1997) The an11 locus controlling flower
pigmentation in petunia encodes a novel WD-repeat protein conserved in yeast, plants, and
animals. Genes Dev 11: 1422-1434

Deluc L, Barrieu F, Marchive C, Lauvergeat V, Decendit A, Richard T, Carde JP, Merillon JM,
Hamdi S (2006) Characterization of a grapevine R2R3-MYB transcription factor that regulates
the phenylpropanoid pathway. Plant Physiol 140: 499-511

Deluc L, Bogs J, Walker AR, Ferrier T, Decendit A, Merillon JM, Robinson SP, Barrieu F (2008)
The transcription factor VvMYB5b contributes to the regulation of anthocyanin and
proanthocyanidin biosynthesis in developing grape berries. Plant Physiol 147: 2041-2053

Deluc L, Quilici D, Decendit A, Grimplet J, Wheatley M, Schlauch K, Merillon J-M, Cushman J,

Cramer G (2009) Water deficit alters differentially metabolic pathways affecting important flavor
and quality traits in grape berries of Cabernet Sauvignon and Chardonnay. BMC Genomics 10:
212

Deluc LG, Grimplet J, Wheatley MD, Tillett RL, Quilici DR, Osborne C, Schooley DA, Schlauch
KA, Cushman JC, Cramer GR (2007) Transcriptomic and metabolite analyses of Cabernet
Sauvignon grape berry development. BMC Genomics 8: 429

Dietz KJ, Sauter A, Wichert K, Messdaghi D, Hartung W (2000) Extracellular beta-glucosidase

activity in barley involved in the hydrolysis of ABA glucose conjugate in leaves. J Exp Bot 51:
937-944

Downey MO, Harvey JS, Robinson SP (2003) Synthesis of flavonols and expression of flavonol
synthase genes in the developing grape berries of Shiraz and Chardonnay (Vitis vinifera L.).
Australian Journal of Grape and Wine Research 9: 110-121

62
Düring H, Alleweldt G, Koch R (1978) Studies on hormonal control of ripening in berries and
grape vines. Acta Horticulturae 80: 397–405.

Finkelstein R, Rock C (2002) Abscisic acid biosynthesis and signaling. In The Arabidopsis Book,
C.R. Somerville and E.M. Meyerowitz, eds (Rockville, MD: American Society of Plant
Biologists)

Fujita A, Goto-Yamamoto N, Aramaki I, Hashizume K (2006) Organ-specific transcription of

putative flavonol synthase genes of grapevine and effects of plant hormones and shading on
flavonol biosynthesis in grape berry skins. Biosci Biotechnol Biochem. 70: 632 - 638

Gagne S, Lacampagne S, Claisse O, Geny L (2009) Leucoanthocyanidin reductase and

anthocyanidin reductase gene expression and activity in flowers, young berries and skins of Vitis
vinifera L. cv. Cabernet-Sauvignon during development. Plant Physiol Biochem 47: 282-290

García-Barcelo J (1990) Técnicas analíticas para vinos. Ediciones FAB. Barcelona, España.:
1713

Gholami M, Hayasaka Y, Coombe B, Jackson J, Robinson S, Williams P (1995) Biosynthesis of

flavour compounds in Muscat Gordo Blanco grape berries. Australian Journal of Grape and Wine
Research 1: 19-24

Giovannoni J (2001) Molecular Biology of Fruit Maturation and Ripening. Annu Rev Plant
Physiol Plant Mol Biol 52: 725-749

Giribaldi M, Gény L, Delrot S, Schubert A (2010) Proteomic analysis of the effects of ABA
treatments on ripening Vitis vinifera berries. Journal of Experimental Botany 61: 2447-2458

Giribaldi M, Hartung W, Schubert A (2009) The effects of abscisic acid on grape berry ripening
are affected by the timing of treatment. Journal international des sciences de la vigne et du vin
43: 1–7

Grotewold E, Sainz MB, Tagliani L, Hernandez JM, Bowen B, Chandler VL (2000)

Identification of the residues in the Myb domain of maize C1 that specify the interaction with the
bHLH cofactor R. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 13579-13584

63
Harris J, Kriedemann P, Possingham J (1968) Anatomical aspects of grape berry development.
Vitis 7: 106-119

Hebrero E, Santos-Buelga C, Rivas-Gonzalo JC (1988) High Performance Liquid

Chromatography-Diode Array Spectroscopy Identification of Anthocyanins of Vitis vinifera
variety Tempranillo. Am. J. Enol. Vitic. 39: 227-233

Hichri I, Barrieu F, Bogs J, Kappel C, Delrot S, Lauvergeat V (2011) Recent advances in the
transcriptional regulation of the flavonoid biosynthetic pathway. J Exp Bot

Holton TA, Cornish EC (1995) Genetics and Biochemistry of Anthocyanin Biosynthesis. Plant
Cell 7: 1071-1083

Hufnagel JC, Hofmann T (2008) Quantitative reconstruction of the nonvolatile sensometabolome

of a red wine. J Agric Food Chem 56: 9190-9199

Inaba A, Ishida M, Sobajima Y (1976) Changes in endogenous hormone concentrations during

berry development in relation to ripening of delaware grapes. Journal of the japanese society for
horticultural science 45: 245-252

Jeong ST, Goto-Yamamoto N, Hashizume K, Esaka M (2006) Expression of the flavonoid 3'-
hydroxylase and flavonoid 3',5'-hydroxylase genes and flavonoid composition in grape (Vitis
vinifera). Plant Science 170: 61-69

Jeong ST, Goto-Yamamoto N, Kobayashi S, Esaka M (2004) Effects of plant hormones and
shading on the accumulation of anthocyanins and the expression of anthocyanin biosynthetic
genes in grape berry skins. Plant Science 167: 247-252

Jiang F, Hartung W (2008) Long-distance signalling of abscisic acid (ABA): the factors
regulating the intensity of the ABA signal. J Exp Bot 59: 37-43

Jin H, Cominelli E, Bailey P, Parr A, Mehrtens F, Jones J, Tonelli C, Weisshaar B, Martin C

(2000) Transcriptional repression by AtMYB4 controls production of UV-protecting sunscreens
in Arabidopsis. EMBO J 19: 6150-6161

64
Jin H, Martin C (1999) Multifunctionality and diversity within the plant MYB-gene family. Plant
Mol Biol 41: 577-585

Kanellis AK, Roubelakis-Angelakis KA (1993) Grape. In G Seymour, J Taylor, G Tucker, eds,

Biochemistry of Fruit Ripening. Chapman & Hall, London

Kobayashi S, Ishimaru M, Hiraoka K, Honda C (2002) Myb-related genes of the Kyoho grape (
Vitis labruscana) regulate anthocyanin biosynthesis. Planta 215: 924-933

Koes R, Verweij W, Quattrocchio F (2005) Flavonoids: a colorful model for the regulation and
evolution of biochemical pathways. Trends Plant Sci 10: 236-242

Koyama K, Sadamatsu K, Goto-Yamamoto N (2010) Abscisic acid stimulated ripening and gene
expression in berry skins of the Cabernet Sauvignon grape. Funct Integr Genomics 10: 367-381

Lavee S, Nir G (1986) Grape. In Handbook of fruit set and development. CRC Press, Boca
Raton: 167-191

Lee KH, Piao HL, Kim HY, Choi SM, Jiang F, Hartung W, Hwang I, Kwak JM, Lee IJ (2006)
Activation of glucosidase via stress-induced polymerization rapidly increases active pools of
abscisic acid. Cell 126: 1109-1120

Lee MW, Qi M, Yang Y (2001) A novel jasmonic acid-inducible rice myb gene associates with
fungal infection and host cell death. Mol Plant Microbe Interact 14: 527-535

Liang YK, Dubos C, Dodd IC, Holroyd GH, Hetherington AM, Campbell MM (2005)
AtMYB61, an R2R3-MYB transcription factor controlling stomatal aperture in Arabidopsis
thaliana. Curr Biol 15: 1201-1206

Lin-Wang K, Bolitho K, Grafton K, Kortstee A, Karunairetnam S, McGhie TK, Espley RV,

Hellens RP, Allan AC (2010) An R2R3 MYB transcription factor associated with regulation of
the anthocyanin biosynthetic pathway in Rosaceae. BMC Plant Biol 10: 50

Lin LC, Kuo YC, Chou CJ (2002) Immunomodulatory proanthocyanidins from Ecdysanthera
utilis. J Nat Prod 65: 505-508

65
Marco PH, Scarminio IS (2007) Q-mode curve resolution of UV-vis spectra for structural
transformation studies of anthocyanins in acidic solutions. Anal Chim Acta 583: 138-146

Markham KR, Gould KS, Winefield CS, Mitchell KA, Bloor SJ, Boase MR (2000) Anthocyanic
vacuolar inclusions--their nature and significance in flower colouration. Phytochemistry 55: 327-
336

Martin C, Paz-Ares J (1997) MYB transcription factors in plants. Trends Genet 13: 67-73

Matus JT, Aquea F, Arce-Johnson P (2008) Analysis of the grape MYB R2R3 subfamily reveals
expanded wine quality-related clades and conserved gene structure organization across Vitis and
Arabidopsis genomes. BMC Plant Biol 8: 83

Matus JT, Loyola R, Vega A, Pena-Neira A, Bordeu E, Arce-Johnson P, Alcalde JA (2009) Post-
veraison sunlight exposure induces MYB-mediated transcriptional regulation of anthocyanin and
flavonol synthesis in berry skins of Vitis vinifera. J Exp Bot 60: 853-867

Matus JT, Poupin MJ, Canon P, Bordeu E, Alcalde JA, Arce-Johnson P (2010) Isolation of WDR
and bHLH genes related to flavonoid synthesis in grapevine (Vitis vinifera L.). Plant Mol Biol
72: 607-620

Mengiste T, Chen X, Salmeron J, Dietrich R (2003) The BOTRYTIS SUSCEPTIBLE1 gene

encodes an R2R3MYB transcription factor protein that is required for biotic and abiotic stress
responses in Arabidopsis. Plant Cell 15: 2551-2565

Mol J, Grotewold E, Koes R (1998) How genes paint flowers and seeds. Trends in Plant Science
3: 212-217

Mori K, Saito H, Goto-Yamamoto N, Kitayama M, Kobayashi S, Sugaya S, Gemma H,

Hashizume K (2005) Effect of abscisic acid treatment and night temperatures on anthocyanin
composition in Pinot noir grapes. Vitis 44: 161-165

Nakatsuka T, Mishibaa K-i, Abe Y, Kubota A, Kakizaki Y, Yamamura S, Nishihara M (2008)

Flower color modification of gentian plants by RNAi-mediated gene silencing. Plant
Biotechnology 25: 61–68

66
Nesi N, Jond C, Debeaujon I, Caboche M, Lepiniec L (2001) The Arabidopsis TT2 gene encodes
an R2R3 MYB domain protein that acts as a key determinant for proanthocyanidin accumulation
in developing seed. Plant Cell 13: 2099-2114

Nunan KJ, Sims IM, Bacic A, Robinson SP, Fincher GB (1998) Changes in cell wall composition
during ripening of grape berries. Plant Physiol 118: 783-792

Penfield S, Meissner RC, Shoue DA, Carpita NC, Bevan MW (2001) MYB61 is required for
mucilage deposition and extrusion in the Arabidopsis seed coat. Plant Cell 13: 2777-2791

Peña-Neira A, Cáceres A, Pastenes C (2007) Low Molecular Weight Phenolic and Anthocyanin
Composition of Grape Skins from cv. Syrah (Vitis vinifera L.) in the Maipo Valley (Chile):
Effect of Clusters Thinning and Vineyard Yield. Food Science and Technology International 13:
153-158

Peppi M, Fidelibus M, Dokoozlian N (2007) Application timing and concentration of abscisic

acid affect the quality of „Redglobe‟ grapes. The Journal of Horticultural Science and
Biotechnology 82: 304

Peppi M, Walker M, Fidelbus M (2008) Application of abscisic acid rapidly upregulated UFGT
gene expression and improved color of grape berries. Vitis 47: 14

Quattrocchio F, Wing JF, Leppen H, Mol J, Koes RE (1993) Regulatory Genes Controlling
Anthocyanin Pigmentation Are Functionally Conserved among Plant Species and Have Distinct
Sets of Target Genes. Plant Cell 5: 1497-1512

Ramsay NA, Glover BJ (2005) MYB-bHLH-WD40 protein complex and the evolution of cellular
diversity. Trends Plant Sci 10: 63-70

Rezaian M, Krake L (1987) Nucleic acid extraction and virus detection in grapevine. Journal of
Virological Methods 17: 277–285

Ribéreau-Gayon P (1998) Traité d'Oenologie. 2-Chimie du vin. Stabilitation et traitements.

Editions La Vigne .Paris.1998.

67
Robinson SP, Davies C (2000) Molecular biology of grape berry ripening. Australian Journal of
Grape and Wine Research 6: 175-188

Roggero JP, Ragonnet B, Coen S (1984) Analyse fine des anthocyanes des vins et des pellicules
cle raisin par la technique HPLC. Vigne et Vins 327: 38-42

Rosinski JA, Atchley WR (1998) Molecular evolution of the Myb family of transcription factors:
evidence for polyphyletic origin. J Mol Evol 46: 74-83

Sarry JE, Sommerer N, Sauvage FX, Bergoin A, Rossignol M, Albagnac G, Romieu C (2004)
Grape berry biochemistry revisited upon proteomic analysis of the mesocarp. Proteomics 4: 201-
215

Schwarz M, Picazo-Bacete JJ, Winterhalter P, Hermosin-Gutierrez I (2005) Effect of copigments

and grape cultivar on the color of red wines fermented after the addition of copigments. J Agric
Food Chem 53: 8372-8381

Spelt C, Quattrocchio F, Mol J, Koes R (2002) ANTHOCYANIN1 of petunia controls pigment

synthesis, vacuolar pH, and seed coat development by genetically distinct mechanisms. Plant Cell
14: 2121-2135

Springob K, Nakajima Ji, Yamazaki M, Saito K (2003) Recent Advances in the Biosynthesis and
Accumulation of Anthocyanins. ChemInform 34: no-no

Teng S, Keurentjes J, Bentsink L, Koornneef M, Smeekens S (2005) Sucrose-specific induction

of anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis requires the MYB75/PAP1 gene. Plant Physiol 139:
1840-1852

Terrier N, Torregrosa L, Ageorges A, Vialet S, Verries C, Cheynier V, Romieu C (2009) Ectopic

expression of VvMybPA2 promotes proanthocyanidin biosynthesis in grapevine and suggests
additional targets in the pathway. Plant Physiol 149: 1028-1041

Vailleau F, Daniel X, Tronchet M, Montillet JL, Triantaphylides C, Roby D (2002) A R2R3-

MYB gene, AtMYB30, acts as a positive regulator of the hypersensitive cell death program in
plants in response to pathogen attack. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 10179-10184

68
Venencie C, Uveira MN, Guiet S (1997) Winegrapes maturity : method for routine analysis of
polyphenols. Revue française d'oenologie 167: 36-41

Vernieri P, Perata P, Armellini D, Bugnoli M, Presentini R, Lorenzi R, Ceccarelli N, Alpi A,

Tognoni F (1989) Solid-phase radioimmunoassay for the quantitation of abscisic acid in plant
crude extracts using a new monoclonal antibody. Journal of Plant Physiology 134: 441-446

Verries C, Guiraud JL, Souquet JM, Vialet S, Terrier N, Olle D (2008) Validation of an
extraction method on whole pericarp of grape berry (Vitis vinifera L. cv. Shiraz) to study
biochemical and molecular aspects of flavan-3-ol synthesis during berry development. J Agric
Food Chem 56: 5896-5904

Walker AR, Davison PA, Bolognesi-Winfield AC, James CM, Srinivasan N, Blundell TL, Esch
JJ, Marks MD, Gray JC (1999) The TRANSPARENT TESTA GLABRA1 locus, which regulates
trichome differentiation and anthocyanin biosynthesis in Arabidopsis, encodes a WD40 repeat
protein. Plant Cell 11: 1337-1350

Wasilewska A, Vlad F, Sirichandra C, Redko Y, Jammes F, Valon C, Frey NFd, Leung J (2008)
An Update on Abscisic Acid Signaling in Plants and More …. Molecular Plant 1: 198-217

Wheeler S, Loveys B, Ford C, Davies C (2009) The relationship between the expression of
abscisic acid biosynthesis genes, accumulation of abscisic acid and the promotion of Vitis
vinifera L. berry ripening by abscisic acid. Australian Journal of Grape and Wine Research 15:
195-204

Winkel-Shirley B (2001) Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry,

cell biology, and biotechnology. Plant Physiol 126: 485-493

Yakushiji H, Morinaga K, Kobayashi S (2001) Promotion of berry ripening by 2,3,5-

triiodobenzoic acid in „Kyoho‟ grapes. Journal of the Japanese Society for Horticultural Science
70: 185–190

Zimmermann IM, Heim MA, Weisshaar B, Uhrig JF (2004) Comprehensive identification of

Arabidopsis thaliana MYB transcription factors interacting with R/B-like BHLH proteins. Plant J
40: 22-34
69
70
12. Material Suplementario
Resumen partidores

Nombre Nº Acceso
Genbank Secuencia Comentario
Partidor

VvActin2-S1 AF369525 5´-ACTGCTGAACGGGAAATTGT-3´ Actin 2 Sentido

VvActin2-A1 5´-AGATGGCTGGAAGAGGACT-3´ Actin 2 Antisentido
VvMYB1A-S1 AB097923 5´-AGATGCCGAAAAAGCTGCAG-3´ MYB1A Sentido
VvMYB1A-A1 5´-CTCCTTTTTGAAGTGGTGACT-3´ MYB1A Antisentido
VvMYB4a-S XM_002278186 5´-TCAGAATCAGCCCACCATAC-3´ MYB4a Sentido
VvMYB4a-A 5´-CAACCCTAAGAAGTCATACCC-3´ MYB4a Antisentido
VvUFGT-S1 AB047098 5´-CGGAGGTCCTAGCACTG-3´ UFGT Sentido
VvUFGT-A1 5´-CTCATTAGCCCACTCTTTGT-3´ UFGT Antisentido
VvPAL 1S X75967 5´-CCGAGCATCAACTAAATCCA-3´ PAL Sentido
VvPAL 1A 5´-GCAGAGTGCCACTAGGTAT-3´ PAL Antisentido
VvDFR S1 X75964 5´-ATTGAAGGGATGTTGGGCA-3´ DFR Sentido
VvDFR A1 5´-GAGTCGGTATGATAGTGATG-3´ DFR Antisentido
VvANS S1 EU156063 5´-CTATGAGGGCAAGTGGGTG-3´ ANS Sentido
VvANS A1 5´-GGTGGGAAGAGTGGTGGC -3´ ANS Antisentido
VvLar2 S1 DQ129686 5´-ATTGGACCAGCTCACCCTAG-3´ LAR2 Sentido
VvLar2 A1 5´-GCCTCCTCAATGAACCGTCT-3´ LAR2 Antisentido

Tabla 2. Resumen Partidores. Partidores de oligonucleótidos utilizados para el análisis de PCR

en tiempo real en Vitis vinifera cv Carménère.

71
 Miricetina Flavonol 1
3-O-glucósido

Quercetina Flavonol 2
3-O-glucósido

Kaempferol Flavonol 3
3-O-glucósido

Flavonol 4

Figura 21. Espectros Absorción Flavonoles. Espectros de absorción de los flavonoles

identificados y cuantificados pertenecientes al cromatograma de polifenoles de bajo peso
molecular (figura 18).

72

View publication stats