Cinética Química Biológica

Manual de Laboratorio
Rosa María Zavaleta Martínez.
 Manual de Laboratorio 2
Cinética Química Biológica

ÍNDICE

REGLAMENTO DE LABORATORIO 3

Construcción de una curva de calibración 4

Comprobación del principio de Le Chatelier 6

Velocidad de reacción 10

Determinación cualitativa de la actividad de -amilasa en Bacillus thuringiensis 13

Medición de la actividad de Polifenoloxidasa extraída de manzana 15

Inhibidores de la actividad de Polifenoloxidasa extraída de manzana 18

Curva de crecimiento microbiano 20

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 Manual de Laboratorio 3
Cinética Química Biológica

REGLAMENTO DE LABORATORIO

1. EL PRESENTE REGLAMENTO ES APLICABLE PARA LOS

LABORATORIOS DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA, SU OBSERVANCIA
ES OBLIGATORIA PARA TODAS LAS PERSONAS INVOLUCRADAS
EN LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO.
2. MANTENER LA CORDIALIDAD Y RESPETO ENTRE ALUMNOS,
DOCENTE Y TÉCNICOS DE LABORATORIO.
3. QUEDA PROHIBIDA LA ENTRADA A PERSONAS AJENAS AL
LABORATORIO DURANTE EL DESARROLLO DE CADA UNA DE LAS
PRÁCTICAS.
4. ES OBLIGATORIO USAR GAFETE CON FOTOGRAFÍA Y BATA
BLANCA DE ALGODÓN, ABOTONADA, LIMPIA, DE MANGA LARGA Y
EQUIPO DE SEGURIDAD SI ASI LO REQUIERE LA PRÁCTICA.
5. PROHIBIDO USAR ZAPATO ABIERTO Y CON TACÓN, FALDA,
PANTALÓN CORTO, ARETES, PULSERAS Y CUALQUIER OTRO
TIPO DE ACCESORIO PERSONAL.
6. PROHIBIDO UTILIZAR EL TELÉFONO CELULAR, TABLETA
ELECTRÓNICA, AUDÍFONOS Y CUALQUIER DISPOSITIVO
ELECTRÓNICO DURANTE LA PRÁCTICA.
7. QUEDA PROHIBIDO FUMAR E INGERIR ALIMENTOS.
8. PROHIBIDO JUGAR DENTRO DEL LABORATORIO.
9. EN CASO DE SINIESTRO RESPETAR EL PLAN DE CONTINGENCIA
Y OBEDECER LAS INDICACIONES DEL TÉCNICO DE
LABORATORIO.
10. EL EMPLEO Y USO DE MATERIALES DE LABORATORIO SÓLO
PODRÁ EFECTUARSE MEDIANTE LA ENTREGA DEL VALE
CORRESPONDIENTE (SOLICITARLO CON EL TÉCNICO).
11. ENTREGAR LIMPIO, SECO Y EN BUENAS CONDICIONES EL
MATERIAL AL TÉRMINO DE CADA PRÁCTICA.
12. CUALQUIER MUESTRA ALMACENADA EN LOS REFRIGERADORES
E INCUBADORAS Y CUARTO FRÍO DEBERÁN ESTAR
DEBIDAMENTE EMPAQUETADAS E IDENTIFICADAS CON NOMBRE
COMPLETO DEL ALUMNO, FECHA DE ENTRADA, TIPO DE
MUESTRA, NOMBRE DE LA ASIGNATURA, NOMBRE DEL
PROYECTO, NOMBRE DEL PROFESOR RESPONSABLE.
13. TODO RESIDUO TÓXICO PELIGROSO DEBERÁ SER CONFINADO
EN CONTENEDORES ESPECIALES, ETIQUETADOS Y CERRADOS
HERMÉTICAMENTE PARA SU DISPOSICIÓN FINAL.
14. ANTES DE DESECHAR LOS MEDIOS DE CULTIVO DEBERÁN
PROCEDER A SU INACTIVACIÓN.
15. EL TÉCNICO, DOCENTE Y ALUMNOS DEBEN ASISTIR
PUNTUALMENTE Y PERMANECER EN EL LABORATORIO DURANTE
EL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA.

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 Manual de Laboratorio 4
Cinética Química Biológica

16. DURANTE EL DESARROLLO DE LA PRÁCTICA EL ALUMNO DEBERÁ

COLOCAR SUS ÚTILES FUERA DEL ÁREA DE TRABAJO Y
COLOCARLOS EN LOS ESPACIOS DESTINADOS.
17. EN CASO DE NO FINALIZAR LA PRÁCTICA, SE LE PODRÁ DAR
CONTINUIDAD SI HAY DISPONIBILIDAD DE HORARIO Y
REGISTRARSE EN BITÁCORA.
18. TODO PROYECTO DE RESIDENCIA O INVESTIGACIÓN DEBE
REALIZARSE BAJO SUPERVISIÓN DE SU ASESOR Y CON LA
AUTORIZACIÓN NECESARIA.

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 Manual de Laboratorio 5
Cinética Química Biológica

PRÁCTICA No. 1

“CONSTRUCCIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN”

FUNDAMENTO:

El espectrofotómetro puede usarse para la determinación colorimétrica de la concentración. El

proceso se basa en el hecho de que los iones coloreados absorben (y transmiten) luz en el
espectro visible. Mientras mayor sea la concentración de los iones, mayor será la absorbencia.

El espectrofotómetro debe estar ajustado a la longitud de onda de máxima absorbencia del

ión, mientras se hacen las pruebas con los estándares. Una gráfica que relaciona la
absorbencia (ó el % de transmitancia) con las concentraciones de los estándares, nos da una
curva de calibración. La absorbencia ó (% de T) puede ser entonces medida para una solución
de concentración desconocida y puede ser comparada con la curva para determinar su
concentración. La concentración del ión cobalto (Co 2+) se determinará en éste experimento, la
absorbencia máxima para el Co2+ es a una longitud de onda de 510nm.

PROPÓSITO

Preparar una serie de soluciones de Co2+ y medir el %T de las soluciones y elaborar una curva
de calibración. Con ésta curva determinar experimentalmente la concentración de una
solución de molaridad desconocida.

MATERIALES REACTIVOS

2 pipetas graduadas de 10ml solución estándar de Co(NO3)2 0.1M

1 probeta de 50ml agua destilada
2 vasos de precipitados de 50ml
5 tubos de ensayo de 15x125mm
1 gradilla
1 pizeta con agua destilada
2 jeringas con manguera

PROCEDIMIENTO
A. Preparación de soluciones estándar.

1.-Rotular 5 tubos de ensayo con las siguientes diluciones: 2:10, 4:10, 6:10, 8:10 y
concentrado.

2.-Depositar 8, 6, 4, 2 y 0ml de H2O destilada respectivamente.

3.-Depositar 2, 4, 6, 8 y 10ml de Co(NO3)2 0.1M respectivamente en la misma serie de tubos.

4.-Leer el %T en el espectrofotómetro y registrar sus datos en una tabla como la siguiente:

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 Manual de Laboratorio 6
Cinética Química Biológica

Soluciones estándares Sol.

desconocida
Tubo 1 2 3 4 5 6
Dilución 2:10 4:10 6:10 8:10 10:10
Molaridad
%T

RESULTADOS

1.-Determinar matemáticamente la molaridad de las soluciones 1-5 partiendo del dato de

concentración de la solución original.
2.-Construir una gráfica en papel milimétrico, relacionando el %T (ordenadas) con la molaridad
(abscisas). Ajustar la recta por regresión lineal.
3.-A partir del dato de %T obtenido para el tubo 6, determinar la molaridad de la solución.
4.-Buscar el significado de los términos: absorbencia, transmitancia, Ley de Lambert-Beer.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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 Manual de Laboratorio 7
Cinética Química Biológica

PRÁCTICA No. 2

“COMPROBACIÓN DEL PRINCIPIO DE LeCHATELIER”

FUNDAMENTO:

El movimiento de las moléculas en los sistemas físicos ó en sistemas de reacción química

siempre es continuo y dinámico, y es influenciado por diferentes factores.
El principio de Le Chatelier indica que si un sistema químico en equilibrio es sometido a una
condición de estrés (cambio en la concentración, temperatura, etc.), entonces el equilibrio se
desplaza en la dirección que minimiza el efecto de tal estrés.

PROPÓSITO
Comprobar el efecto de los cambios en la concentración y la temperatura sobre la posición de
equilibrio en diferentes sistemas químicos.

MATERIALES REACTIVOS

2 pipetas graduadas de 1ml Na2CO3 0.1M

7 goteros AgNO3 0.1M
1 vaso de precipitados de 50ml HNO3 6M
5 tubos de ensayo de 15x125mm con tapón de rosca HCl 0.1M
1 pinzas para tubo de ensayo NH3 concentrado
1 gradilla KI 0.1M
1 pizeta con agua destilada Na2S 0.1M
1 hot plate HCl concentrado
1 vaso de precipitados de 250ml NH4Cl
CoCl2 1M

PROCEDIMIENTO
A. Equilibrio del ión plata.

1.-Depositar 10 gotas de AgNO3 0.1M en un tubo de ensayo. Adicionar 10 gotas de Na2CO3

0.1M y registrar sus observaciones en una tabla.
El carbonato de plata precipita en presencia de un exceso de iones Ag+ y CO3-2 en solución
acuosa para establecer un equilibrio dinámico entre el sólido y los iones en solución.
Ag2CO3(s)  2 Ag+(ac) + CO3-2(ac)

2.-Adicionar al mismo tubo algunas gotas de HNO3 6M hasta que no observe cambios en la
reacción. Registrar sus observaciones en la tabla del paso anterior.

La adición de HNO3 causa que el carbonato de plata sólido se disuelva: los iones H+ del HNO3
reaccionan con los iones CO3-2, removiendo al CO3-2 del equilibrio. El sistema se desplaza hacia
la derecha para compensar la remoción de los iones carbonato, ocasionando que el carbonato
de plata se disuelva. El H+ y el CO3-2 se combinan para formar H2CO3, el cual debido a su
inestabilidad a presión y temperatura ambiente, se descompone en CO2 y H20.
3.-Adicionar al mismo tubo algunas gotas de HCl 0.1M, hasta que no observe cambios en la
reacción. Registrar sus observaciones en la tabla del paso 1.

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 Manual de Laboratorio 8
Cinética Química Biológica

4.-Permitir la formación del precipitado y descartar aproximadamente la mitad del

sobrenadante con una pipeta y desecharlo. Agregar (EN CAMPANA DE EXTRACCIÓN DE
VAPORES) algunas gotas de NH3 concentrado (PRECAUCIÓN: evitar la inhalación y el contacto
de la piel con el reactivo) hasta que el precipitado se disuelva y la solución se aclare. Registrar
sus observaciones en la tabla del paso 1.

Al agregar el NH3, se forma el complejo iónico diamina de plata, el cual permanece en solución.

5.-Reacidificar la solución con algunas gotas de HNO3 6M y registrar sus observaciones. ¿Qué
sucede si se agrega un exceso de NH3 concentrado? Pruébelo y Registrar sus observaciones en
la tabla del paso 1.

6.-Adicionar 10 gotas de KI 0.1M al mismo tubo y agitar. Registrar sus observaciones en la tabla
del paso 1.

7.-Adicionar 10 gotas de Na2S 0.1M. Registrar sus observaciones en la tabla del paso 1.

B. Solución saturada de cloruro de amonio.

1.-Preparar una solución saturada de cloruro de amonio con agua desionizada en un tubo de
ensayo. Tocar el fondo del tubo con la mano y registrar si se trata de una reacción endotérmica
ó exotérmica.

2.-Transferir 10 gotas del sobrenadante concentrado a otro tubo y adicionarle de 2 a 3 gotas

de HCl concentrado hasta que ocurra un cambio en la apariencia de la solución. Escribir una
ecuación química para explicar lo ocurrido.

RESULTADOS

Elaborar una tabla de acuerdo a la secuencia de experimentos y escribir delante la ecuación

para cada caso así como los cambios observados en apariencia, color, temperatura, etc.

Anotar los cálculos para la preparación de cada uno de los reactivos usados en la práctica.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

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 Manual de Laboratorio 9
Cinética Química Biológica

PRÁCTICA No.3

“VELOCIDADES DE REACCIÓN”

FUNDAMENTO:

Existen varias condiciones que pueden alterar la velocidad de una reacción química. Los
parámetros experimentales que nosotros podemos cambiar incluyen: temperatura,
concentración, y presión (si se trata de gases), además de la sustitución de una sustancia por
otra más reactiva, el estado de subdivisión de un reactivo (si es sólido ó líquido), ó la inclusión
de un catalizador que pueda incrementar la velocidad de reacción.

Un cambio en la temperatura incrementa la velocidad de reacción debido a que incrementa el

promedio de energía cinética de las moléculas reactantes. La distribución de la energía
adicional entre los átomos en las moléculas colindantes, incrementa la probabilidad de que los
enlaces se rompan. La subsecuente recombinación de los fragmentos puede resultar en la
formación de producto, obteniendo un incremento global en la velocidad de reacción.

Un incremento en la concentración de un reactivo, incrementa la probabilidad de colisión

entre las moléculas reactantes (ó iones). Como resultado, muchas velocidades de reacción se
incrementan cuando las concentraciones de reactivo incrementan también, aunque hay
sistemas en los cuales hay un decremento ó no ocurre cambio en la velocidad de reacción.

Ocurre más rápidamente una reacción cuyos reactantes tengan un tamaño pequeño de
partícula; por otra parte, los catalizadores generalmente cambian el mecanismo de una
reacción disminuyendo su energía de activación y por lo tanto, haciendo que ocurra más
rápidamente.

PROPÓSITO

Medir y comparar las velocidades de reacción, considerando la influencia de variables como:

temperatura, concentración y grado de subdivisión de los reactivos.

MATERIALES REACTIVOS

3 pipetas graduadas de 10ml solución de Na2S2O3 0.1M

2 vidrios de reloj solución de HCl 0.1M y 6M
3 vasos de precipitados de 50ml trozo de gis (CaCO3)
11 tubos de ensayo de 15x125mm polvo de gis
1 gradilla agua destilada
1 pizeta con agua destilada hielo molido
3 jeringas con manguera
cronómetro
hot plate
1 vaso de precipitados de 250ml
1 termómetro

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 Manual de Laboratorio 10
Cinética Química Biológica

PROCEDIMIENTO

A. Influencia de la Concentración de reactivo.

1.-Rotular 5 tubos de ensayo de 16x125mm con las siguientes diluciones: 1:2, 1:4, 1:5, 1:10 y
1:20 y colocarlos en una gradilla. Las diluciones se harán a partir de una solución patrón de
tiosulfato de sodio 0.1M.

2.-Realizar los cálculos respectivos (para preparar 5ml de cada dilución) y proceder a preparar
las diluciones con agua destilada. El experimento se llevará a cabo a temperatura ambiente.

3.-Agregar al primer tubo 5ml de HCl 0.1M y enseguida tomar el tiempo que tarda en aparecer
una coloración blanca en forma de nubosidad, lo cual está indicando la formación de SO2,
como se indica en la siguiente reacción:

2HCl (ac) + Na2S2O3 (ac) S (s) + SO2 (g) + 2 NaCl (ac) + H2O (l)

4.-Registrar los datos de tiempo de reacción en una tabla como la siguiente y graficar tiempo
(en segundos) contra molaridad (M) de Na2S2O3 . Realizar el mismo procedimiento con los
otros 4 tubos.

Tubo 1 2 3 4 5
Dilución 1:2 1:4 1:5 1:10 1:20
Molaridad
tiempo

B. Influencia de la Temperatura de reacción.

1.-Rotular 3 tubos de ensayo de 16x125mm con las siguientes temperaturas: frío, ambiente,
35C y colocarlos en una gradilla. Pipetear 5ml de tiosulfato de sodio 0.1M en cada tubo.
Pipetear 5ml de HCl 0.1M en otra serie de 3 tubos de la misma medida.

2.-Llevar una pareja de tubos (1 con Na2S2O3 0.1M y otro con HCl 0.1M) al interior de un baño
de hielo y permitir que tomen la temperatura del mismo (aproximadamente 5 minutos).
Enseguida adicionar el HCl al tubo que contiene el tiosulfato de sodio y medir el tiempo que
tarda en aparecer una coloración blanca en forma de nubosidad, lo cual está indicando la
formación de SO2.

3.-Repetir el paso número 2, pero ahora hacerlo a temperatura ambiente.

4.-Repetir el paso número 2, pero a una temperatura de 35C.

10
 Manual de Laboratorio 11
Cinética Química Biológica

5.-Registrar los datos de tiempo de reacción en una tabla como la indicada para la sección A y
graficar tiempo (en segundos) contra temperatura (C) .

C. Grado de subdivisión.

1.-pesar aproximadamente 0.2g de gis (CaCO3) y depositarlo en un vidrio de reloj. Pesar la

misma cantidad pero ésta vez usar polvo de gis y depositar en otro vidrio de reloj.

2.-Adicionar a la primera muestra algunas gotas de HCl 6M hasta que se haya disuelto todo el
gis. Registrar la cantidad de gotas de HCl que gastó para tal efecto.

3.- Adicionar a la segunda muestra algunas gotas de HCl 6M hasta que se haya disuelto todo el
polvo de gis. Registrar la cantidad de gotas de HCl que gastó para tal efecto.

RESULTADOS

1.-Determinar matemáticamente la molaridad de las soluciones 1-5 de la sección A, partiendo

del dato de concentración de la solución original.
2.-Construir una gráfica en papel milimétrico, relacionando el tiempo vs la temperatura de
reacción y en otra gráfica el tiempo vs la concentración de tiosulfato de sodio.
3.-A partir del dato de gotas gastadas en la sección C, explicar sus observaciones de acuerdo al
fundamento de la práctica.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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 Manual de Laboratorio 12
Cinética Química Biológica

PRÁCTICA No. 4

“DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE LA ACTIVIDAD DE -AMILASA EN Bacillus thuringiensis”

FUNDAMENTO

Las especies del género Bacillus crecen bien en medios definidos utilizando distintas fuentes de
carbono. Muchos producen enzimas extracelulares, que rompen polisacáridos complejos,
ácidos nucleicos ó ácidos grasos hasta unidades asimilables por la célula. Otros producen
antibióticos como la bacitracina, polimixina, tirocidina, gramicidina y circulina. Algunas de sus
especies com B. popilliae y B. thuringiensis producen toxinas larvicidas de insectos.
El almidón es un polisacárido de glucosa que es catabolizado por la alfa amilasa, producida por
muchos hongos y bacterias, entre ellas, B. thuringiensis.
Las amilasas son de considerable utilidad en industrias donde debe digerirse almidón, tales
como en la industria textil, en lavanderías, y en las industrias papelera y alimentaria.

PROPÓSITO

Determinar a nivel cualitativo la actividad enzimática de una exoenzima microbiana y

establecer la relación existente entre cantidad de inóculo bacteriano y actividad biológica.

MATERIALES REACTIVOS

3 pipetas graduadas de 10ml peptona

1 matraz Erlenmeyer de 250ml extracto de levadura
1 matraz Erlenmeyer de 125ml NaCl
1 vaso de precipitados de 250ml almidón soluble
5 tubos de ensayo de 13x125mm agua destilada
1 probeta de 100ml K2HPO4
1 gradilla agar
1 hot plate
4 cajas Petri de vidrio
1 espátula
1 jeringa con manguera
4 pipetas de 1ml

PROCEDIMIENTO

1.-Preparar 100ml de agar almidón de acuerdo a las siguientes instrucciones: en 50ml de agua
destilada, disolver 0.3g de almidón soluble, calentar y agitar. Solubilizar los otros ingredientes
en el agua restante (peptona 0.5g, extracto de levadura 0.5g, K2HPO4 0.5g, agar 1.8g), mezclar
las 2 partes y esterilizar en autoclave durante 15min a 15lb/in2. Una vez tibio el agar, verter en
las cajas Petri, que deberán esterilizarse junto con las pipetas y los tubos con medio LB.

3.-Preparar 50ml de caldo LB de acuerdo a las siguientes instrucciones: pesar 0.5g de peptona,
0.5g de NaCl y 0.25g de extracto de levadura, disolver en 50ml de agua destilada, adicionar
9.9ml de medio a los tubos y esterilizar bajo las mismas condiciones que en el caso anterior.

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 Manual de Laboratorio 13
Cinética Química Biológica

4.-Rotular los tubos de ensayo con las siguientes preparaciones: muestra concentrada, 1:100,
1:10,000, 1:1,000,000 y control; colocarlos en una gradilla. Las diluciones se harán a partir de
un inóculo concentrado de B. thuringiensis, usando como diluyente caldo LB.

5.-Inocular en el agar 0.02ml (o una gota) de cultivo bacteriano como se muestra en la Fig. 1

6.-Dejar secar las cajas en la campana de flujo laminar y posteriormente incubarlas a 35C
durante 24h.
7.-Una vez cumplido el tiempo de incubación, retirar el crecimiento bacteriano con un
cubreobjeto limpio.

Fig.1 División de la caja Petri para inocular

8.-Cubrir la caja con una capa líquida de lugol. Dejar reposar 1minuto y desechar el colorante.

9.-Realizar una medición del halo de degradación (diámetro) producido a causa de la actividad
de -amilasa.

RESULTADOS

Elaborar una gráfica donde se relacione la medida del halo de degradación vs la concentración
de bacterias.
Proponer una explicación de lo observado.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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 Manual de Laboratorio 14
Cinética Química Biológica

PRÁCTICA No. 5

“MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD DE POLIFENOLOXIDASA EXTRAÍDA DE MANZANA”

FUNDAMENTO

Las polifenoloxidasas (PFO) que se encuentran en las plantas, son las responsables de las
reacciones de pardeamiento enzimático que ocurren durante el almacenamiento,
manipulación y procesamiento de frutas y vegetales. Las PFO también conocidas como
tirosinasas, fenoloxidasas, monofenoloxidasas o cresolasas, catalizan la hidroxilación de
monofenoles a ortodifenoles, posteriormente oxidados a ortoquinonas, las cuales se
polimerizan dando lugar a pigmentos que presentan color marrón, rojo o negro, dependiendo
de los componentes naturales presentes en los tejidos vegetales. Estas reacciones modifican
las características organolépticas y nutricionales del alimento, depreciando su calidad.
Ocasionalmente, este cambio de color es deseado.

PROPÓSITO

Obtener un extracto enzimático a partir de manzana y medir la actividad polifenoloxidasa, así

como algunos parámetros cinéticos como KM y Vmáx.

MATERIALES REACTIVOS

1 balanza granataria Na2HPO4

1 licuadora HCl para ajustar pH
1 cuchillo NaOH para ajustar pH
1 tabla para picar Soluciones buffer de pH
1 vaso de precipitados de 250ml catecol
1 vaso de precipitados de 500ml
1 probeta de vidrio de 250ml
15 tubos Falcon de 15ml
1 hielera
1 potenciómetro
Centrífuga
2 matraces Erlenmeyer de 50ml
1 pipeta graduada de 10ml
1 pipeta graduada de 5ml
1 probeta de 100ml
2 celdas para espectrofotómetro
tiras indicadoras de pH
1 gradilla
1 espátula
1 jeringa con manguera

PROCEDIMIENTO

I.-OBTENCIÓN DE EXTRACTO ENZIMÁTICO.

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 Manual de Laboratorio 15
Cinética Química Biológica

1.-Pesar 300g de tejido vegetal, homogeneizar en una licuadora con 300ml de buffer 1 (fosfato
dibásico de sodio 50mM pH 6.5). Realizar éste paso en el menor tiempo posible y en frío.

2.-Mantener en hielo 10 tubos Falcon de 15ml, agregar el homogeneizado a los tubos y

pesarlos por pares para meterlos a centrifugar. Mantenerlos en hielo una vez que se ha
equilibrado el peso.

3.-Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 4000rpm. Colectar el líquido sobrenadante

en un nuevo tubo y mantenerlo en refrigeración hasta su uso, ó en hielo si lo va a usar
inmediatamente.

II.-DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.

1.-Preparar 30ml de catecol 50mM, usando como diluyente el buffer fosfato 50mM pH 6.5, y
mantener la mezcla a temperatura ambiente.

2.-En un matraz Erlenmeyer de 50ml, poner 1.5ml de buffer adicionado con catecol. Adicionar
12.5ml del extracto enzimático e inmediatamente hacer lecturas de absorbancia a 400nm,
cada 10 segundos, durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Usar como blanco la solución
preparada en el paso 1.

3.-Para determinar las unidades enzimáticas (actividad enzimática), considerar que una unidad
de actividad PFO (polifenoloxidasa) corresponde a un aumento de 0.001 unidades de
absorbancia por minuto y por ml de enzima.

4.-Hacer una tabla donde incluya los datos registrados de absorbancia y tiempo. Graficar sus
resultados (Absorbancia vs tiempo, actividad vs tiempo y actividad vs absorbancia).

III.-DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD PFO.

1.-Incubar durante 20 minutos a 40C, 12.5ml del extracto enzimático.

2.-Enfriar la mezcla en baño de hielo. Una vez alcanzada la temperatura ambiente, agregar
1.5ml de buffer + sustrato y determinar la actividad enzimática repitiendo los pasos 2, 3 y 4 del
punto II.

IV.-DETERMINACIÓN DEL EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD PFO.

1.-Ajustar el pH al extracto enzimático a un valor de 9.0.

2.-Agregar 1.5ml de buffer + sustrato y determinar la actividad enzimática repitiendo los pasos
2, 3 y 4 del punto II.

V.-DETERMINACIÓN DE KM y Vmáx.

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 Manual de Laboratorio 16
Cinética Química Biológica

1.-Hacer una serie de reacciones a diferentes concentraciones de catecol en buffer fosfato pH

6.5: 20, 80, 110 y 140mM, con la misma cantidad de extracto enzimático (12.5ml).

2.-Enseguida hacer las lecturas de absorbancia cada 10s durante 10 min. Tabular y graficar sus
resultados. Para encontrar los datos cinéticos, KM y Vmáx, determinar primero la actividad
enzimática al inicio de la reacción (velocidad inicial). Con los datos de concentración de
sustrato y velocidad inicial, trazar la gráfica de dobles inversos ó de Lineweaver-Burk para
determinar los valores de KM y Vmáx.

RESULTADOS

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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 Manual de Laboratorio 17
Cinética Química Biológica

PRÁCTICA No. 6

“INHIBIDORES DE LA ACTIVIDAD DE POLIFENOLOXIDASA EXTRAÍDA DE MANZANA”

FUNDAMENTO

La vida depende de la existencia de catalizadores poderosos y específicos: los enzimas.

Prácticamente cada reacción bioquímica está catalizada por una enzima. Con la excepción de
unos cuantos RNA catalíticos (ribozimas), todos los enzimas son proteínas.
Los enzimas se pueden inactivar por modificación irreversible de un grupo funcional esencial
para la actividad catalítica. También se pueden inhibir por moléculas que se fijan
reversiblemente. Los inhibidores competitivos compiten reversiblemente con el sustrato para
fijarse en el sitio activo, pero no son transformados por el enzima. Los inhibidores
acompetitivos se fijan al complejo ES en un sitio diferente del centro activo. En la inhibición
mixta, un inhibidor se fija a E ó a ES, también en un sitio distinto del que une el sustrato.

PROPÓSITO

El alumno(a) hará una serie de experimentos en los que observará y cuantificará el efecto
inhibidor de diferentes sustancias sobre la actividad de la PFO extraída de manzana.

MATERIALES REACTIVOS

1 balanza granataria Na2HPO4

1 licuadora HCl para ajustar pH
1 cuchillo NaOH para ajustar pH
1 tabla para picar Soluciones buffer de pH
1 vaso de precipitados de 250ml catecol
1 vaso de precipitados de 500ml ácido ascórbico
1 probeta de vidrio de 250ml ácido benzoico
15 tubos Falcon de 15ml NaCl
1 hielera
1 potenciómetro
Centrífuga
3 matraces Erlenmeyer de 50ml
1 pipeta graduada de 10ml
3 pipetas graduadas de 5ml
1 probeta de 100ml
2 celdas para espectrofotómetro
tiras indicadoras de pH
1 gradilla
1 espátula
1 jeringa con manguera

PROCEDIMIENTO
I.-OBTENCIÓN DE EXTRACTO ENZIMÁTICO.

1.-Pesar 300g de tejido vegetal, homogeneizar en una licuadora con 300ml de buffer 1 (fosfato
dibásico de sodio 50mM pH 6.5). Realizar éste paso en el menor tiempo posible y en frío.

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 Manual de Laboratorio 18
Cinética Química Biológica

2.-Mantener en hielo 10 tubos Falcon de 15ml, agregar el homogeneizado a los tubos y

pesarlos por pares para meterlos a centrifugar. Mantenerlos en hielo una vez que se ha
equilibrado el peso.

3.-Centrifugar las muestras durante 15 minutos a 4000rpm. Colectar el líquido sobrenadante

en un nuevo tubo y mantenerlo en refrigeración hasta su uso, ó en hielo si lo va a usar
inmediatamente.

II.-DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA USANDO INHIBIDORES.

1.-Preparar 15ml de catecol 50mM, usando como diluyente el buffer fosfato 50mM pH 6.5, y
mantener la mezcla a temperatura ambiente.

2.-Tomar 5ml de la mezcla anterior y depositarlos en un tubo ó matraz. Agregar ácido

ascórbico a una concentración de 30mM en la mezcla. Mantener a temperatura ambiente.

3.-En un matraz Erlenmeyer de 50ml, poner 1.5ml de buffer adicionado con catecol y ácido
ascórbico. Adicionar 12.5ml del extracto enzimático e inmediatamente hacer lecturas de
absorbancia a 400nm, cada 10 segundos, durante 10 minutos, a temperatura ambiente. Usar
como blanco la solución preparada en el paso 1.

4.-Para determinar las unidades enzimáticas (actividad enzimática), considerar que una unidad
de actividad PFO (polifenoloxidasa) corresponde a un aumento de 0.001 unidades de
absorbancia por minuto y por ml de enzima.

5.-Hacer una tabla donde incluya los datos registrados de absorbancia y tiempo. Graficar sus
resultados (Absorbancia vs tiempo, actividad vs tiempo y actividad vs absorbancia).

6.-Repetir los pasos 2 a 5, pero ahora agregar ácido benzoico a una concentración 30mM en
lugar del ácido ascórbico.

7.-Repetir los pasos 2 a 5, pero ahora agregar NaCl 30mM en lugar del ácido ascórbico.

RESULTADOS

A partir de sus datos y gráficas, determinar si alguna de las 3 sustancias usadas como
inhibidores realmente tuvieron esa función.

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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 Manual de Laboratorio 19
Cinética Química Biológica

PRÁCTICA No. 7

“CURVA DE CRECIMIENTO MICROBIANO”

FUNDAMENTO

El crecimiento microbiano involucra un incremento en el número de células más que el

aumento de tamaño de las células individuales. El crecimiento es una función esencial de la
célula microbiana, ya que cada célula tiene un tiempo finito de vida.
La célula bacteriana es como una “máquina sintética” capaz de reproducirse a sí misma. Una
de las características del crecimiento exponencial es que la velocidad de incremento en el
número de células es inicialmente lenta, pero se incrementa con rapidez una vez superada la
fase lag.
Midiendo la absorbancia de una muestra de cultivo microbiano, es posible determinar la
concentración de células a través de una curva de calibración, en la que se relacione la
cantidad de células y la absorbancia.

PROPÓSITO

El alumno(a) realizará la cinética de un cultivo bacteriano y relacionará la absorbancia con la

cantidad de células presentes en determinado momento para construir una curva de
crecimiento típica.

MATERIALES REACTIVOS

2 matraces Erlenmeyer de 500ml Peptona de caseína

1 asa bacteriológica Extracto de levadura
1 matraz Erlenmeyer de 50ml NaCl
1 vaso de precipitados de 250ml agar bacteriológico
1 vaso de precipitados de 125ml
1 probeta de vidrio de 250ml
1 balanza granataria
1 espátula
16 cajas Petri de vidrio
16 tubos de ensayo de 18x150mm con tapón de rosca
16 pipetas de vidrio de 1ml
1 pipeta de vidrio de 10ml
1 gradilla
1 jeringa con manguera
2 celdas para espectrofotómetro
1 pizeta con agua destilada
1 mechero Fisher
Incubadora con agitación
Autoclave

PROCEDIMIENTO

I.-Preinoculación

19
 Manual de Laboratorio 20
Cinética Química Biológica

1.-Preparar 25ml de caldo LB en un matraz Erlenmeyer de 50ml, aparte preparar otros 250ml
del mismo medio en un matraz Erlenmeyer de 500ml. Esterilizar en autoclave durante 15min a
15lb/in2. Mantener a 45C el agar hasta su uso.

2.-A partir de un cultivo fresco de E. coli, hacer un preinóculo de la misma pasando una azada
de cultivo en el matraz que contiene los 25ml de caldo. Incubar toda la noche a 35-37C con
agitación constante.

3.-Agregar el preinóculo (los 25ml) al matraz que contiene los 250ml de medio, en condiciones
asépticas. Mantener el cultivo en agitación a 35-37C durante 3h.

4.-Preparar 320ml de agar LB y esterilizar en autoclave junto con las cajas Petri y las pipetas de
1ml. Mantener el agar a 45C hasta su uso.

5.-Después de transcurridas las 3 horas, hacer una lectura de absorbancia en el

espectrofotómetro, a 600nm, usando como blanco el medio LB sin inocular. Al mismo tiempo,
tomar 1ml de cultivo en condiciones asépticas y depositarlo en un tubo conteniendo 9ml de
medio líquido. A partir de ésta dilución, tomar 1ml y pasar al segundo tubo, así sucesivamente
hasta completar 4 diluciones.

5.-Sembrar en caja Petri por vertido, adicionando 1ml de cultivo y aproximadamente 20ml de
agar LB. Homogeneizar con movimientos rotatorios y dejar gelificar.

6.-Repetir la toma de muestra y lectura de absorbancia y siembra en agar otras 3 veces más,
con un espacio entre muestra y muestra de 30 minutos.

7.-Incubar a 35-37C durante 18-24horas y contar el número de UFC/ml presentes en cada

dilución.

8.-Trazar una gráfica en la que muestre la relación absorbancia vs tiempo y otra en la que
muestre concentración de células (expresadas como UFC/ml) vs tiempo. Finalmente otra
gráfica en la que relacione UFC/ml vs absorbancia.

RESULTADOS

En base a sus resultados, ¿cuál sería el tiempo de generación para la bacteria utilizada?

OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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