BiocatalizadoresdelLabalaIndustria PDF

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BIOCATALIZADORES. DEL LABORATORIO A LA INDUSTRIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE QUILMES
Rector
Gustavo Eduardo Lugones
Vicerrector
Mario E. Lozano
Biocatalizadores.
Del laboratorio a la industria
Elizabeth Lewkowicz
(compiladora)
Bernal, 2011
Colección Nuevos enfoques en ciencia y tecnología
Dirigida por Florencia M. Rembado
Biocatalizadores: del laboratorio a la industria / compilado por

Elizabeth Lewkowicz - 1a ed. - Bernal : Universidad Nacional de
Quilmes, 2011.
216 p. : il. ; 22x15 cm. - (Nuevos enfoques en ciencia y tecnología /
Florencia Mabel Rembado)
ISBN 978-987-558-221-7
1. Biotecnología. 2. Enzimas. I. Lewkowicz, Elizabeth, comp.

CDD 574
Diseño de colección: Hernán Morfese

Realización: Mariana Nemitz
© Elizabeth Lewkowicz. 2011

© Universidad Nacional de Quilmes. 2011
Universidad Nacional de Quilmes

Roque Sáenz Peña 352
(B1876BXD) Bernal, Provincia de Buenos Aires
República Argentina
http://www.unq.edu.ar
editorial@unq.edu.ar
ISBN: 978-987-558-221-7
Queda hecho el depósito que marca la ley 11.723
ÍNDICE
Los autores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Agradecimientos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Prólogo, por Elizabeth Lewkowicz. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
Capítulo 1. Fuentes de biocatalizadores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Elizabeth Lewkowicz y Daniela Gamenara
Capítulo 2. Los vegetales en biocatálisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Marcela Kurina-Sanz y Alejandro A. Orden
Capítulo 3. Biocatálisis en medios no convencionales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

Adolfo M. Iribarren
Capítulo 4. Aplicaciones de la biología molecular en biocatálisis.

Técnicas de clonación, sobreexpresión y evolución dirigida. . . . . . . . . . . . . 95
Paola Panizza y Sonia Rodríguez
Capítulo 5. Aplicaciones del modelado molecular a la biocatálisis. . . . . . . . . . 125

José María Sánchez Montero y Andrés R. Alcántara León
Capítulo 6. Biocatálisis enzimática industrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

Andrés Illanes
Capítulo 7. Procesos industriales biocatalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

Pablo Domínguez de María
LOS AU TORES
Andrés R. Alcántara León, Grupo de Biotransformaciones (btg), De-

partamento de Química Orgánica y Farmacéutica, Facultad de Farmacia,
Universidad Complutense de Madrid, España; <andresr@farm.ucm.es>.
Pablo Domínguez de María, Institute of Technical and Macromolecu-
lar Chemistry, rwth Aachen University, Alemania; <dominguez @itmc.
rwth-aachen.de>.
Daniela Gamenara, Grupo de Fisicoquímica Orgánica y Bioprocesos,
Laboratorio de Síntesis Orgánica, Departamento de Química Orgánica,
Facultad de Química, Universidad de la República (UdelaR), Montevi-
deo, Uruguay; <dgamenar@fq.edu.uy>.
Andrés Illanes, Laboratorio de Biocatálisis, Escuela de Ingeniería Bioquími-
ca, Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Chile; <aillanes@ucv.cl>.
Adolfo M. Iribarren, Laboratorio de Biotransformaciones, Departamen-
to de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Argentina;
<airibarren@unq.edu.ar>.
Marcela Kurina-Sanz, intequi-Conicet, Facultad de Química, Bioquími-
ca y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Argentina; <mkurina@
unsl.edu.ar>.
Elizabeth Lewkowicz, Laboratorio de Biotransformaciones, Departa-
mento de Ciencia y Tecnología, Universidad Nacional de Quilmes, Bue-
nos Aires, Argentina; <elewko@unq.edu.ar>.
Alejandro A. Orden, intequi-Conicet, Facultad de Química, Bioquími-
ca y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis, Argentina; <aaorden@
unsl.edu.ar>.
| 9
Paola Panizza, Cátedra de Microbiología, Departamento de Biociencias,
Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay;
<ppanizza@fq.edu.uy>.
Sonia Rodríguez, Cátedra de Microbiología, Departamento de Biocien-
cias, Facultad de Química, Universidad de la República, Montevideo,
Uruguay; <soniar@fq.edu.uy>.
José María Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones (btg), De-
partamento de Química Orgánica y Farmacéutica, Facultad de Farmacia,
Universidad Complutense de Madrid, España; <jsanchez@farm.ucm.es>.
10 | LOS AUTORES
AGRADECIMIENTOS
En primer lugar a los autores de los capítulos que conforman esta obra
por su disposición a participar en la difusión de la biocatálisis entre
los miembros de la comunidad científica de habla hispana y su siem-
pre amable colaboración en todos los emprendimientos que venimos
llevando a cabo para hacer importante esta poco conocida rama de la
ciencia.
A la Universidad Nacional de Quilmes por darnos el espacio y el
apoyo necesarios para que el Laboratorio de Biocatálisis pueda crecer
día a día.
A las entidades nacionales (Conicet, anpcyt, etc.) e internacionales
que subsidian nuestras investigaciones.
A todos los integrantes del Laboratorio de Biocatálisis por su esfuer-
zo y su dedicación y por crear un ámbito maravilloso de trabajo.
Al doctor Adolfo Iribarren, alma máter del grupo, por su fuerza para
llevarlo adelante, por compartir el cariño por la ciencia y principalmen-
te por su calidez humana y su apoyo incondicional.
Y finalmente a mi familia, Roberto, Florencia y Vanesa, por estar
siempre a mi lado, por entender y soportar las tardanzas, las ausencias y
las preocupaciones que involucra el trabajo científico y por ser las per-
sonas maravillosas con las que amo compartir la vida.
Elizabeth Lewkowicz
| 11
PRÓLOGO
Elizabeth Lewkowicz
En la biotecnología las enzimas desempeñan una función clave como

catalizadores y esa función es aprovechada por muchas industrias que
intentan satisfacer las necesidades humanas cotidianas. El amplio es-
pectro de sus aplicaciones abarca desde la producción de alimentos
procesados –pan, queso, jugos de fruta o cerveza– y productos farma-
céuticos o de química fina hasta el procesamiento del cuero y textiles o
como adyuvantes en detergentes e ingeniería ambiental.
La llamada “biotecnología blanca” utiliza catalizadores biológicos,
entre ellos células y enzimas, para garantizar una actividad más ecológica
en los procesos industriales. Estos biocatalizadores presentan ventajas
tales como alta especificidad, eficiencia, reducción de la contaminación
y ahorro de energía, características que los hacen aptos para ser em-
pleados en el desarrollo de nuevos procesos de producción sostenible,
lo que ha representado un incentivo importante para el desarrollo de
la biocatálisis y la tecnología enzimática.
Un conocimiento exhaustivo de las enzimas como biocatalizadores
requiere la integración de conocimientos de química, bioquímica, bio-
logía e ingeniería, en particular de aspectos fisicoquímicos de cinéti-
ca e interacciones moleculares, catálisis, biotransformaciones, sistemas
heterogéneos, procesos de transferencia de masa, reactores y procesos
de separación, de escalado y de tratamiento de residuos. Las estrategias
utilizadas actualmente para la búsqueda de nuevos procesos quimioen-
zimáticos seguros para el ambiente, que implican el uso de herramientas
modernas de biología molecular y de ingeniería de proteínas, también
desempeñan un papel importante en la obtención de biocatalizadores
nuevos y más eficientes. En los siete capítulos de este libro se abordan
algunos de estos temas con el objetivo de brindar una visión general,
actualizada y concisa de los distintos pasos de un proceso biocataliza-
do durante la transición del laboratorio a la planta.
| 13
En el capítulo 1 se puede hallar un panorama general de los dis-
tintos tipos de biocatalizadores, de sus usos y sus fuentes y también de
las diversas técnicas de screening y selección que permiten una rápida
identificación de actividades enzimáticas con propiedades adecuadas
para su aplicación en biocatálisis. En el capítulo 2 se presenta un aná-
lisis particularmente detallado del uso de catalizadores de origen vege-
tal, de sus diversas formas y de sus múltiples aplicaciones, que ofrecen
alternativas únicas frente a otros sistemas.
En la naturaleza los biocatalizadores desarrollan su actividad óptima en
entornos acuosos y ambientes con pH neutro, temperaturas por debajo de
40 °C y presión osmótica baja. A la hora de optimizar una reacción, estas
condiciones pueden resultar una complicación en cuanto a la relación es-
pacio-tiempo-rendimiento o bien para obtener una alta concentración
de producto a fin de facilitar el procesamiento posterior. Por ese moti-
vo existe una búsqueda continua de condiciones alternativas que permi-
tan lograr mejoras respecto de la solubilidad del sustrato, la selectividad,
el rendimiento y la estabilidad del biocatalizador. El uso de medios no
convencionales de reacción fue uno de los grandes hitos de la biocatálisis
durante el siglo xx. Si bien los solventes orgánicos fueron los compuestos
más utilizados, en los últimos años se han desarrollado medios más favo-
rables en términos ambientales, los que se describen en el capítulo 3. Más
recientemente la ingeniería de proteínas ha añadido nuevas y potentes
herramientas para el desarrollo de mejores biocatalizadores. En el capítu-
lo 4 se explica la forma de mejorar los procesos biocatalizados mediante
el uso de enzimas fácilmente accesibles en cantidad y con propiedades
que puedan ser modificadas a demanda. La bioinformática también ha
contribuido a este propósito. El modelado molecular constituye una he-
rramienta de gran utilidad pues permite interpretar de manera racional
los procesos biocatalizados, como se describe en el capítulo 5.
Finalmente, todos los avances mencionados han confluido para favorecer
la transformación del proceso biocatalizado desarrollado en el laboratorio
en un proceso industrial. En los capítulos 6 y 7 se analizan los requeri-
mientos, las características y las motivaciones, junto a diversos ejemplos,
para diseñar procesos industriales biocatalíticos rentables y sostenibles.
Esta obra, dirigida a un público interdisciplinario y de habla caste-
llana, ha sido diseñada como libro de texto para cursos de pregrado y
posgrado sobre biocatálisis y temáticas relacionadas, aunque también se
espera que sea de interés para todos los que trabajan en este campo.
14 | PRÓLOGO
CAPÍTULO 1
Fuentes de biocatalizadores
Elizabeth Lewkowicz y Daniela Gamenara
INTRODUCCIÓN
Los procesos biotecnológicos son aquellos que involucran el uso de

una o más enzimas como biocatalizadores, utilizando o no cofactores
o cosustratos. En los últimos años, la biocatálisis ha adquirido un
lugar destacado en su carácter de “herramienta de la química orgánica
sintética”.
Las tecnologías biocatalíticas se consideran “verdes” por ser gene-
ralmente “amigables” con el medioambiente. Las reacciones cataliza-
das por enzimas –sea por enzimas aisladas o células enteras– pueden
llevarse a cabo en medios acuosos, a temperatura ambiente y con pH
neutro y no necesitan altas presiones ni condiciones de reacción ex-
tremas, lo que permite lograr un ahorro energético importante. En la
industria química la biocatálisis es una metodología suplementaria
muy útil porque torna viables y eficientes reacciones que ofrecen di-
ficultades para la síntesis orgánica clásica y porque en algunos casos
simplifica procesos que mediante síntesis clásica deberían realizarse en
varias etapas de reacción. El alto grado de quimioselectividad, regio-
selectividad y estereoselectividad de los biocatalizadores permite sim-
plificar los procesos sintéticos y por ende los torna más económicos y
seguros desde el punto de vista ambiental.
En un proceso sintético catalizado por enzimas pueden utilizarse
tanto células enteras como enzimas aisladas. El uso de células enteras
tiene la enorme ventaja de que en la célula están los cofactores necesa-
rios para la reacción –en los casos de las reacciones que los involucran–
y las vías metabólicas adecuadas para su regeneración. Las desventajas
| 15
más significativas consisten en que los procesos pueden tener baja pro-
ductividad debido a la potencial toxicidad celular de los sustratos o al
gran volumen de biomasa que suele dificultar la recuperación de los
productos. En el caso de sustratos o productos quirales el transporte
hacia la célula y desde ella puede influir en la especificidad de la reac-
ción global y determinar que los procesos sean menos eficientes. Otro
problema frecuente en los procesos biocatalizados por células enteras
es su baja selectividad, que puede deberse a: 1) que ambos estereoisó-
meros sean sustratos de una misma enzima y que el proceso transcurra
a través de estados de transición con valores similares de energía libre
para ambos estereoisómeros y 2) que dos enzimas con preferencias es-
tereoquímicas opuestas compitan por el mismo sustrato. En este caso
la pureza óptica de los productos está determinada por las velocidades
relativas de las reacciones individuales.
Trabajar con enzimas aisladas tiene la ventaja de que se pueden de-
sarrollar procesos altamente eficientes y selectivos y eliminar reacciones
competitivas catalizadas por otras enzimas del sistema. Por otra parte,
el aislamiento de los productos de biotransformación suele ser sencillo,
en particular si se trabaja con enzimas inmovilizadas. Los reactores pue-
den ser más pequeños que los requeridos en procesos de fermentación
y la posibilidad de reutilizar el biocatalizador permite diseñar procesos
continuos con una mejora de su productividad y su eficacia. Las des-
ventajas más significativas del uso de enzimas aisladas son la necesidad
que existe en algunos casos de incorporar cofactores al sistema y rege-
nerarlos adecuadamente así como el elevado costo tanto de las enzimas
como de los cofactores mismos. El uso de enzimas aisladas también es
limitado, porque estas enzimas pueden inactivarse fácilmente al carecer
del “entorno protector” de la célula. El costo de un proceso enzimático
debe reducirse utilizando enzimas más estables, sin perder la actividad
de la enzima original. El proceso enzimático está directamente vincu-
lado con los procesos de producción y purificación de la enzima y estos
deben diseñarse de un modo que permita obtener enzimas estables y con
alto grado de pureza, lo que reducirá los costos de producción. Lo pri-
mero que debe hacerse para lograr ese objetivo es encontrar una fuente
adecuada de la enzima. Las fuentes naturales (tejidos de origen animal
y de plantas superiores y cepas naturales de microorganismos) por lo
general producen cantidades insuficientes de cada enzima por lo que el
paso que sigue a la obtención de una enzima a partir de cepas natura-
16 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

les de microorganismos es la optimización del proceso de producción.
Los organismos clasificados como de clase I o gras (del inglés Generaly
Recognize As Safe)1 son aquellos que han sido utilizados durante largo
tiempo en la industria alimentaria sin provocar daños observables en la
salud humana o de los animales. En la mayoría de los países esta clasi-
ficación está regulada por leyes locales y es revisada en forma continua
por autoridades sanitarias internacionales –World Health Organization
(who) y Food and Agricultural Organization (fao, Naciones Unidas).
Cuando el organismo productor de la enzima no es un organismo de
clase I, o gras, no puede ser utilizado para la producción de enzimas,
de acuerdo con los criterios de seguridad establecidos. En estos casos,
el gen que codifica la producción de la enzima puede ser transferido a
un organismo de clase I y sobreexpresado en él. Por último, la enzima
producida debe ser purificada adecuadamente para su uso como bioca-
talizador. Este proceso de purificación es más sencillo si la enzima es
extracelular porque puede aislarse directamente del medio de cultivo
sin necesidad de lisar las células, como ocurre en el caso de las enzi-
mas intracelulares. El costo de la purificación disminuye al aumentar el
contenido de enzima en el medio y crece al aumentar el requerimiento
de pureza para su aplicación final.
Desde los comienzos de la biotecnología la principal fuente de enzi-
mas ha consistido en células de diferentes orígenes. Estas enzimas pue-
den obtenerse tanto por extracción directa de las células como a partir
de exudados celulares de organismos vivos. En un principio, las fuentes
más importantes de enzimas eran tejidos vegetales y órganos de anima-
les. En 1960, alrededor del 70% de las enzimas se extraían de tejidos
vegetales o de exudados de órganos de origen animal. Veinte años más
tarde la situación se modificó y la mayoría de las enzimas utilizadas en la
industria eran producidas por microorganismos. Actualmente persisten
en el mercado enzimas de origen animal de relevancia comercial, sobre
todo hidrolasas, que representan el 10% de las enzimas de uso industrial
(Illanes, 2008). Hoy en día las enzimas de origen animal más utiliza-
das en las industrias alimentaria y del cuero son la catalasa del hígado,
las lipasas, la quimiotripsina y la tripsina del páncreas (Kosikowski y
Mistry, 1997; Oberg et al., 1992). Las enzimas de origen vegetal, como
las proteasas papaína y cisteína obtenidas del látex de papaya (Carica
1
<http://www.accessdata.fda.gov/scripts/fcn/fcnNavigation.cfm?rpt=grasListing>.
FUENTES DE BIOCATALIZADORES | 17
papaya, Carica candamarcensis), también tienen importancia industrial
y representan el 5% del mercado (Baladrin et al., 1985; Uhlig, 1998).
Otras enzimas, como la invertasa (Pressi et al., 2003), la proteasa neutra
(Cimino et al., 2006) y la fosfatasa ácida (Su y Arias, 2003), son pro-
ducidas in vitro en cultivos de células vegetales mediante procesos de
gran complejidad y de costo elevado por lo que su utilización a nivel
industrial es limitada (Chu y Robinson, 2001). Algunas glicoenzimas
(glutamina sintetasa) se producen también in vitro en cultivos de líneas
celulares de origen animal (Barnes et al., 2000).
Si bien los orígenes de los biocatalizadores son muy diversos, los
microorganismos constituyen una fuente muy rica y el uso de micro-
organismos o enzimas microbianas como biocatalizadores es por lejos
el más descrito en la bibliografía. Las enzimas microbianas han reem-
plazado a las de otros orígenes desde la década de 1960 y hoy en día
representan más del 90% del mercado total (Illanes, 2008). En la ac-
tualidad, uno de los objetivos más importantes de la biocatálisis es la
explotación de la diversidad microbiana en busca de otras enzimas con
actividades novedosas, complementada con el diseño racional de enzi-
mas y su producción y sobreexpresión en huéspedes microbianos me-
diante técnicas de ingeniería genética (Beloqui et al., 2008).
ORIGEN DE LOS BIOCATALIZADORES
Animales y plantas
Los tejidos de origen animal y vegetal son fuentes clásicas de biocatali-

zadores, en especial los que son residuos en la industria alimentaria. La
lipasa de páncreas porcino (ppl) (Liu et al., 2004; Takemura et al., 2008),
la esterasa de hígado de cerdo (ple) (Domínguez de María et al., 2007),
la quimotripsina y la tripsina, la alcohol deshidrogenasa de hígado de
caballo (HLADH) (Grunwald et al., 1986), citocromos P 450 (cyp
450) (Liu et al., 2004), entre otros, son ejemplos de enzimas aisladas de
tejidos animales frecuentemente utilizadas como biocatalizadores (Liese
et al., 2006). Las células enteras de tejidos vegetales también tienen
una importante aplicación en biocatálisis tanto como cultivos celulares
como con partes de plantas (hojas, raíces, semillas, etc.) (véase cap. 2;
Domínguez de María et al., 2006a; Maczka y Mironowicz, 2002; Miya-

zawa et al., 2005; Yadav et al., 2002). Algunos de estos tejidos de origen
vegetal o animal pueden proporcionar grandes cantidades de enzima
(hasta el 1% de peso de tejido húmedo), como en el caso de las enzimas
digestivas producidas en el páncreas y en órganos de reserva (semillas)
y también de las enzimas que intervienen en metabolismos específicos
(en el hígado o el corazón). Sin embargo, como la recuperación de las
enzimas de los tejidos suele ser dificultosa deben encontrarse fuentes
alternativas para su producción con fines sintéticos. Además, en el caso
de las enzimas pancreáticas, a partir del descubrimiento del páncreas
como productor de insulina (1921) el tejido comenzó a ser muy caro
como fuente de enzimas para biocatálisis. Las enzimas que todavía se
siguen obteniendo del páncreas, como la tripsina y la quimotripsina,
son subproductos de la producción de insulina. Actualmente, la insu-
lina se produce sobre todo en microorganismos recombinantes (E. coli
o células de levaduras), al igual que otras enzimas que en un principio
se obtenían del páncreas. El uso de microorganismos recombinantes se
concibió inicialmente para la producción de proteínas de interés tera-
péutico pero su verdadera ventaja consiste en la reducción de los costos
de producción para una gran variedad de proteínas, en comparación con
el uso de microorganismos en fermentación (Buchholz et al., 2005).
Microorganismos naturales (wild type)
Los microorganismos han sido ampliamente explotados en las áreas de

la medicina, la agricultura y la industria alimentaria y sus aplicaciones
industriales tienen cada vez más repercusión. La mayor parte de las
enzimas utilizadas actualmente a nivel industrial provienen de micro-
organismos. Estos han sido utilizados como catalizadores en una gran
variedad de transformaciones químicas empleando células enteras. Por
otra parte, mediante ingeniería genética se han producido proteínas y
microorganismos recombinantes de uso cada vez más generalizado en
la industria farmacéutica y en la de los biocombustibles, entre otras
(Zhao y Chen, 2008).
Desde los comienzos de la biotecnología se han utilizado cepas sal-
vajes de microorganismos para la producción de alimentos y bebidas.
Esas cepas son fuentes ideales de biocatalizadores para la industria
alimentaria, cuando por normas de seguridad se requieren microorga-
nismos gras.
Las cepas salvajes de microorganismos también se utilizan cuando
se quieren buscar enzimas “nuevas” que puedan catalizar la conversión
o la degradación de un compuesto determinado.
En catálisis enzimática habitualmente se utilizan levaduras, hongos y
bacterias, que constituyen las fuentes de biocatalizadores más usadas con
fines de síntesis tanto en la industria química como en la alimentaria.
Levaduras
El uso en gran escala de levaduras en procesos catalizados por enzimas

comenzó hace varios siglos con la producción de etanol a partir de
glucosa para la fabricación de bebidas alcohólicas. El microorganismo
de elección en dicho proceso industrial fue Saccharomyces cerevisiae (le-
vadura de panificación), sobre todo debido a su gran disponibilidad y
su bajo costo.
Los objetivos sintéticos más destacados al pensar en utilizar leva-
duras como biocatalizadores son la introducción de centros quirales, la
resolución de racematos o la conversión selectiva de grupos funcionales
en presencia de otros de reactividad química similar. Hoy S. cerevisiae
sigue siendo la levadura más utilizada en biocatálisis, lo que además
de deberse a las ventajas mencionadas anteriormente, se debe a que no
necesita medios de crecimiento estériles y es viable y sencillo trabajar
con ella en un laboratorio no especializado en microbiología.
Los sistemas enzimáticos de las levaduras que se destacan desde el
punto de vista de su utilidad sintética incluyen enzimas vinculadas con
reacciones redox (deshidrogenasas, oxigenasas y oxidasas), enzimas hi-
drolíticas (lipasas y epóxido hidrolasas) y liasas que catalizan la forma-
ción de enlaces C-C.
Entre las enzimas redox, las deshidrogenasas son muy versátiles y
por ese motivo constituyen una herramienta poderosa para la química
orgánica sintética (Gamenara y Domínguez de María, 2009). Intervie-
nen en reacciones de reducción de grupos carbonilo en las que gene-
ran alcoholes quirales (Soni et al., 2007; Wolberg et al., 2004; Zagozda
y Plenkiewicz, 2006) o reducciones asimétricas de olefinas (Hall et al.,
2008) o iminas (Vaijayanthi y Chadha, 2008). Las reacciones de oxida-
ción enzimática no representan un objetivo sintético tan valioso porque
por lo general involucran la destrucción de centros quirales y no poseen
ventajas frente a las oxidaciones clásicas. En el caso de la reducción de

grupos carbonilo las deshidrogenasas de las levaduras se comportan so-
bre todo de acuerdo con la regla de Prelog (Prelog, 1964) y por eso se
las relaciona con la preparación de alcoholes de configuración S. Pue-
den trabajarse tanto con la célula entera como con la enzima aislada,
siempre que se suministren los cofactores correspondientes y se diseñe
un sistema adecuado para su regeneración (Faber, 2004).
S. cerevisiae es muy eficiente para lograr la reducción selectiva de
compuestos monocarbonílicos –aldehídos y cetonas– con sustituyentes
alquilo o arilo, compuestos dicarbonílicos –α y β-dicetonas cíclicas y
acíclicas, α y β-cetoésteres– y obtener alcoholes secundarios de con-
figuración S. Las cetonas impedidas estéricamente en general no son
sustratos, salvo las metilcetonas (Azerad y Buisson, 2000; Danchet et
al., 1998).
La mayoría de las oxigenasas (monooxigenasas y dioxigenasas) son
enzimas intracelulares de modo que las reacciones en las que intervie-
nen tienen lugar dentro de la célula. A pesar de que son muchas las
oxigenasas conocidas y descritas, su utilización en síntesis orgánica si-
gue siendo limitada a causa de su escasa disponibilidad en grandes can-
tidades, su gran inestabilidad, su baja actividad específica y el elevado
costo de los cofactores necesarios. Además, muchas de estas enzimas
son proteínas asociadas a membrana, lo que reduce aun más su poten-
cial aplicación en síntesis. Algunos de estos inconvenientes han podido
subsanarse utilizando la célula entera o preferentemente microorganis-
mos recombinantes que sobreexpresen la enzima.
Las oxidasas son enzimas que no requieren cofactores para desa-
rrollar su ciclo catalítico y utilizan oxígeno como aceptor de electrones
en la oxidación de alcoholes a aldehídos o cetonas. El hecho de que
las oxidasas no requieran cofactores determina que su uso en procesos
biocatalíticos sea más sencillo que el de las deshidrogenasas y el de las
oxigenasas. Estas enzimas pueden utilizarse como agentes de resolu-
ción de alcoholes quirales por oxidación selectiva de uno de los enan-
tiómeros (Mauersberger et al., 1992).
Entre las enzimas hidrolíticas de levaduras, las lipasas ocupan una
posición destacada en la preparación de una gran variedad de com-
puestos. Se trata de enzimas extracelulares, muchas veces producidas
en forma de isoenzimas, y es posible obtenerlas en grandes cantida-
des y a bajo costo. Catalizan reacciones de hidrólisis (Domínguez de
María et al., 2005; Nishigaki et al., 2008), esterificación (Nishigaki et
al., 2008), transesterificación (Chojnacka et al., 2007; Devaux-Bas-
séguy et al., 1997; Domínguez de María et al., 2005; Domínguez de
María et al., 2006b), N-acilación (Domínguez de María et al., 2005;
Gotor Fernández et al., 2006a; Gotor Fernández et al., 2006b), alco-
hólisis (Capello et al., 2007), aminólisis y amonólisis (López García
et al., 2003), epoxidación y apertura de epóxidos (Kroutil y Faber,
2000; Orellana-Coca et al., 2007), reacciones de Baeyer y Villiger
(Ten Brink et al., 2004), etc. Las lipasas tienen la ventaja de que no
necesitan cofactores y es sencillo utilizarlas como enzimas aisladas.
El hecho de que sean extracelulares facilita su purificación y hay una
gran variedad de lipasas comerciales disponibles. Las principales leva-
duras productoras de lipasas pertenecen a los géneros Candida (rugosa,
antarctica), Geotrichum (candidum, asteroides), Trichosporon, Yarrowia
(lipolytica) y Kluyveromyces. Su utilización en biotecnología, en las
industrias farmacéutica y agroquímica, en el tratamiento de los resi-
duos y en las industrias alimentaria y del cuero se lleva a cabo tanto
con el microorganismo en crecimiento (fermentación) como con las
células en reposo o utilizando las enzimas aisladas con diferente gra-
do de purificación.
Las epóxido hidrolasas también tienen un potencial sintético im-
portante puesto que catalizan la apertura de epóxidos en forma enan-
tioselectiva y regioselectiva. No requieren cofactores y se puede trabajar
fácilmente con la enzima aislada –los preparados enzimáticos liofiliza-
dos son muy estables– o con la célula entera. Las principales levaduras
productoras de epóxido hidrolasas pertenecen a los géneros Rhodotorula
y Rhodosporidium. Estas enzimas aceptan una gran diversidad estruc-
tural de sustratos, entre ellos epóxidos con impedimento estérico. Al
igual que las lipasas, las enzimas aisladas son muy útiles para trabajar en
sistemas bifásicos y en biotransformaciones con células enteras pueden
utilizarse disolventes orgánicos. Otro aspecto que debe considerarse es
que las epóxido hidrolasas de diferentes microorganismos pueden te-
ner enantioselectividades o regioselectividades complementarias por lo
que constituyen una potente herramienta sintética.
La formación de enlaces C-C es un objetivo sintético fundamental
para la química orgánica. Un ejemplo de utilización de liasas de levadu-
ras en síntesis de intermedios farmacéuticos es el descrito por Kostraby
(Kostraby et al., 2002). El objetivo es la producción de l-fenilacetilcar-
binol (l-pac), un intermediario en la síntesis de drogas vasodepreso-

ras como la efedrina y la seudoefedrina, a través de una condensación
aciloínica de benzaldehído y piruvato catalizada por S. cerevisiae como
paso clave.
Hongos
Tradicionalmente, los hongos han sido uno de los sistemas de células

enteras más estudiados como biocatalizadores (Bastos Borges et al.,
2009). Se los puede obtener mediante la identificación sistemática de
una gran variedad de ambientes distribuidos en la naturaleza y todavía
hay muchos hábitats por explorar en la búsqueda de nuevas especies de
interés en biocatálisis. La bioprospección en busca de nuevos biocata-
lizadores, incluso en ambientes de condiciones extremas –ecosistemas
termales, de fríos extremos o hipersalinos– puede llevar al descubri-
miento de nuevas enzimas con capacidad de catalizar una gran variedad
de reacciones de interés sintético.
Entre los sistemas enzimáticos de los hongos que más se han ex-
plorado en biocatálisis se destacan las enzimas de óxido-reducción y
las enzimas hidrolíticas, que catalizan reacciones de hidroxilación, sul-
foxidación, epoxidación y apertura de epóxidos, oxidación de Baeyer y
Villiger, desracemización y reducción estereoselectiva y enantioselectiva
de compuestos carbonílicos (Bastos Borges et al., 2009).
Las reacciones de reducción catalizadas por deshidrogenasas fúngi-
cas, entre ellas las reducciones de grupos carbonilo, son las descritas con
mayor amplitud en la bibliografía y permiten obtener alcoholes quira-
les con un alto grado de regioselectividad y estereoselectividad (Bastos
Borges et al., 2009; Nakamura et al., 2001; Pedrini et al., 2009; Ravía
et al., 2009). La amplia especificidad de sustratos de estas enzimas po-
sibilita la obtención de compuestos estructuralmente muy diferentes,
entre ellos alcoholes R o S cíclicos o de cadena abierta, aromáticos o
alifáticos o α- o β-hidroxiésteres e hidroxicetonas. Las reacciones de
racemización o desracemización catalizadas por deshidrogenasas re-
presentan una estrategia eficaz para la interconversión de enantióme-
ros y en la bibliografía se han descrito numerosos ejemplos del uso de
hongos como biocatalizadores en ese tipo de reacciones (Bastos Bor-
ges et al., 2009).
Las reacciones de oxidación que permiten la introducción regiose-
lectiva y enantioselectiva de átomos de oxígeno en sustratos orgánicos
tienen gran utilidad en síntesis. Se han descrito reacciones de Baeyer y
Villiger catalizadas por monooxigenasas fúngicas (Fantin et al., 2006),
reacciones de epoxidación (Dembitzky, 2003), sulfoxidaciones (Fernán-
dez y Khiar, 2003), hidroxilaciones (Kinne et al., 2009) y oxidaciones
(Bastos Borges et al., 2009), tanto con células enteras en fermentación
o en reposo como con enzimas aisladas. Las lacasas de origen fúngico
también se destacan en reacciones de oxidación y acoplamiento (Go-
chev y Krastanov, 2007).
Las reacciones catalizadas por hidrolasas fúngicas están menos des-
critas que las reacciones de oxidación-reducción; básicamente se trata de
reacciones de hidrólisis o transesterificación que se llevan a cabo tanto
con enzimas aisladas como con células enteras en reposo (Hernández
Rodríguez et al., 2009; Méndez et al., 2007).
Bacterias
Los microorganismos procariontes (Bacteria y Archaea), y entre ellos las

bacterias, constituyen la fuente de biocatalizadores más ampliamente ex-
plotada. La variedad de géneros y especies de bacterias y las diferencias
en el contenido enzimático de acuerdo con su metabolismo, su función
y su ambiente determinan que estos microorganismos sean una fuente
muy rica de biocatalizadores. Las bacterias utilizadas en biocatálisis
pertenecen a una gran diversidad de géneros, entre los que se destacan
Escherichia, Rhodococcus, Bacillus, Lactobacillus, Nocardia, Pseudomonas,
Acinetobacter, Alcaligenes, Corynebacterium, etc. (Buchholz et al., 2005;
Liese et al., 2006).
Al igual que las enzimas provenientes de células eucariotas, las en-
zimas bacterianas pueden utilizarse tanto como enzimas aisladas como
en la célula entera (o en una combinación de ambas formas) y tanto
libres (Voss et al., 2007) como inmovilizadas (Goldberg et al., 2008).
Como enzimas aisladas se utilizan sobre todo enzimas extracelulares no
dependientes de cofactores, como por ejemplo hidrolasas, mientras que
las células enteras de microorganismos se utilizan en procedimientos de
síntesis que involucran enzimas dependientes de cofactores.
Las biotransformaciones catalizadas por enzimas o células bacteria-
nas tienen aplicación, en general, en la preparación industrial de una
gran variedad de productos pero la industria farmacéutica es el sector
en el que se utilizan más ampliamente debido a la necesidad de reac-

ciones enantioselectivas y a la capacidad de las vías enzimáticas de lle-
varlas a cabo (Liese et al., 2006).
Las dos metodologías de síntesis en las que se utilizan reacciones
catalizadas por enzimas de origen bacteriano son la resolución de race-
matos y la síntesis de compuestos quirales. Las enzimas más utilizadas
en la resolución cinética de racematos son las hidrolasas (Wiggers et al.,
2009), que en general se trabajan inmovilizadas. El inconveniente de
esta metodología es que solo se puede obtener un rendimiento máximo
del 50% en cada uno de los enantiómeros, lo que ha debido solucionarse
mediante el empleo de resoluciones cinéticas dinámicas (Faber, 2004).
Para la síntesis de compuestos quirales se utilizan sobre todo microor-
ganismos recombinantes debido a su enantioespecificidad (Buchholz
et al., 2005; Clouthier y Kayser, 2007; de Gonzalo et al., 2007; Liese et
al., 2006; Panizza et al., 2007; Schroer et al., 2007).
Las enzimas bacterianas más utilizadas en la preparación de inter-
medios quirales destinados a la industria farmacéutica son las hidrola-
sas –para la síntesis de derivados de ácidos y la hidrólisis de epóxidos
(Fujino et al., 2007) y nitrilos (Kinfe et al., 2009)–, las deshidrogenasas
(Matsuda et al., 2009) involucradas en la reducción de grupos carbo-
nilo (Moore et al., 2007) y en la oxidación enantioselectiva de alcoho-
les (Edegger et al., 2006), las monooxigenasas y las dioxigenasas –para
oxidaciones de Baeyer y Villiger o hidroxilación de átomos de carbono
no activados (Matsuda et al., 2009)–, las aldolasas –para la formación
de enlaces C-C mediante condensación de compuestos carbonílicos
(Seoane, 2000)– y las oxinitrilasas –para la síntesis de cianohidrinas
(Holt y Hanefeld, 2009).
Microorganismos recombinantes
Las técnicas de ingeniería genética de clonado y expresión de enzimas

han permitido producir esas enzimas en gran escala para su purificación
posterior, y el diseño y construcción de microorganismos que expresen
las enzimas de interés en sistemas de células enteras. La expresión de
enzimas para ser utilizadas como biocatalizadores en forma de “enzi-
mas aisladas” es una herramienta que permite su sobreproducción y
purificación en escala apropiada para fines industriales. Se trata de una
estrategia útil para la producción de enzimas que no requieren cofacto-
res, como las hidrolasas. En el caso de las enzimas que sí los requieren
los clones se sobreexpresan en microorganismos huéspedes que aportan
el sistema de cofactores necesarios sin necesidad de incorporarlos en
cantidades estequiométricas o de desarrollar técnicas eficaces para su
reciclado.
Búsqueda y selección de actividad catalítica
El uso industrial de enzimas se ha extendido rápidamente (Schmid

et al., 2001); sin embargo, como los sustratos utilizados en general
no son productos naturales, las enzimas adecuadas para llevar a cabo
esos procesos en muchos casos no se conocen. Por lo tanto, uno de
los mayores desafíos al encarar un desarrollo comercial biocatalizado
es contar con el biocatalizador apropiado. Para ello es necesario saber
que a pesar de la existencia de muchos procesos –incluso industriales–
realizados con enzimas desarrolladas para otras aplicaciones (a modo
de ejemplo, para la preparación industrial de uno de los productos
intermedios en la síntesis del ciprokiren, un inhibidor de la renina, se
utiliza subtilisina Carlsberg, una enzima desarrollada para formulacio-
nes de detergentes) (Doswald et al., 1994), es posible que sustratos con
estructuras muy relacionadas requieran biocatalizadores diferentes para
llevar a cabo reacciones en condiciones óptimas. Como muestra de
lo dicho, el 2,6-diaminopurinribósido pudo obtenerse, con excelentes
rendimientos, mediante una reacción de transglicosidación microbiana
catalizada por nucleósido fosforilasas de Aeromonas hydrophila a partir
de uridina y 2,6-diaminopurina (Medici et al., 2006) mientras que
una reacción idéntica llevada a cabo con adenina (6-aminopurina) no
produce adenosina, supuesto sustrato natural de la enzima (Nóbile et
al., 2009).
En esta era posgenómica el concepto de biocatalizador ha evolu-
cionado notoriamente y por lo tanto sus fuentes pueden ser diversas y
evolucionar cada día. En esencia, se pueden mencionar como biocatali-
zadores enzimas, células enteras o material genético, sea como genes que
codifican para determinadas enzimas o directamente ADN genómico.
Como se mencionó anteriormente, el espectro de biocatalizadores na-
turales no se restringe al mundo microbiano, sin embargo –tanto a nivel
académico como industrial– los microorganismos y sus enzimas son los
más utilizados. Adicionalmente, existen diferentes estrategias para au-
mentar la diversidad de enzimas accesibles, para mejorar la performance

de las enzimas existentes o para desarrollar actividades enzimáticas nue-
vas (Carballeira et al., 2009). Dichas estrategias incluyen:
a. Búsqueda de nuevas actividades en diferentes ambientes, que pue-

den ser naturales o inducidos. Así, por ejemplo, el análisis de microor-
ganismos asociados a raíces de semillas en germinación permitió hallar
una nueva fitasa debido a que su sustrato natural, el fitato, es el com-
ponente principal de algunas semillas (Williams et al., 1984).
b. Descubrimiento de actividades no naturales de enzimas conoci-
das (promiscuidad enzimática). Se encontraron carbonil reductasas de
Candida parapsilosis con capacidad de llevar a cabo la reducción asimé-
trica de iminas (Vaijayanthi y Chadha, 2008).
c. Uso de diferentes medios de reacción (ingeniería del medio). Kise y
Tomiuchi (Kise y Tomiuchi, 1991) describieron el efecto del acetonitrilo
en la enantioselectividad de diferentes proteasas respecto de la resolución
de ésteres etílicos de aminoácidos aromáticos. De esta manera se obtuvo
l-dopa con 99% ee en presencia de 90% v/v de acetonitrilo.
d. Aplicación de técnicas de ingeniería genética. Haciendo uso de
métodos recombinantes y no recombinantes actualmente es posible ob-
tener diversidad. En general los métodos recombinantes crean nuevas
enzimas mientras que los no recombinantes permiten introducir cam-
bios estructurales para modificar selectividades, aceptación de sustrato
o estabilidad (Cowan et al., 2005).
Actualmente, se considera que por cada producto deseado se puede en-

contrar un biocatalizador. Una de las formas más eficientes y eficaces de
llevar a cabo la búsqueda es a través de técnicas de screening y selección de
microorganismos (Shimizu et al., 1997), las que permiten una rápida iden-
tificación de las actividades enzimáticas. En la era del boom de la tecnología
del ADN recombinante parece obsoleto realizar screenings para buscar en-
zimas o microorganismos (véase cap. 4); sin embargo, esta sigue siendo una
de las metodologías más empleadas por su sencillez, rapidez y versatilidad
mientras que la ingeniería genética se reserva para mejorar la actividad y
la estabilidad enzimática. Para llevar a cabo el screening lo ideal es analizar
un gran número de especies (High Throughput Screening, hts, o screening de
alto rendimiento). Actualmente, los métodos de hts más eficientes se basan
en el uso de robots que permiten el escaneo simultáneo de una cantidad
de muestras del orden del millón (Houston y Bankst, 1997).
Junto con el crecimiento del interés por la biocatálisis preparativa
se fueron estableciendo fuentes de provisión de biocatalizadores tanto
públicas como privadas, lo que condujo a una mayor accesibilidad y por
consiguiente a una reducción de los costos.
FUENTES DE BIOCATALIZADORES
Fuentes de enzimas
El recurso más sencillo y rápido es la fuente comercial. Muchos desa-

rrollos se lograron mediante el empleo del limitado conjunto de en-
zimas accesibles en el comercio y actualmente existen varias empresas
(Novozymes, Sigma-Aldrich, Amano y Codexis, entre otras) que las
proveen. Se pueden adquirir en forma relativamente económica hidro-
lasas como las lipasas, las esterasas y las proteasas mientras que algunas
oxidorreductasas y algunas liasas se consiguen a precios accesibles. Hoy
en día numerosas fuentes disponen de kits de screening así como de
bibliotecas de enzimas. Sin embargo, en muchos casos no es posible
obtener la enzima individual y para ello hay que recurrir a colecciones
de microorganismos o a bancos de clones o de genes.
Fuentes de microorganismos
Colecciones
Dado que los microorganismos representan la fuente más útil y accesible

de biocatalizadores, muchos laboratorios han construido sus propias colec-
ciones como forma de disponer de una variedad de especies y géneros a la
hora de encarar la búsqueda de una actividad catalítica novedosa o simple-
mente de nuevas fuentes de actividades conocidas. Muchas colecciones que
fueron creadas por instituciones oficiales de diferentes países con el objetivo
primario de constituir un depósito de cepas patentadas, en la actualidad
representan un valioso instrumento para acceder a microorganismos. En
estas colecciones cada cepa se clasifica con un número y pueden obtenerse
muestras de ellas a precios accesibles. En algunos casos no solo se pueden
adquirir células enteras sino también cADN o ADN genómico. En el
cuadro 1 se muestran algunas de las colecciones más conocidas.

CUADRO 1. Algunas colecciones de microorganismos de instituciones nacionales
Abreviatura Nombre Lugar
atcc American Type Culture Collection Maryland, Estados Unidos
cbs Centraalbureau voor Schimmelcultur Utrecht, Holanda
ccm Czechoslovak Collection of Microorganisms Universidad Purkyne, Brno,

República Checa
cdda Canadian Department of Agriculture Ottawa, Canadá
cip Collection of the Institut Pasteur París, Francia
dsmz Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen Braunschweig, Alemania
jcrb Japanese Collection of Research Biosources Tokio, Japón
nctc National Collection of Type Cultures Londres, Reino Unido
cect Colección Española de Cultivos Tipo Universidad de Valencia, España
ncimb National Culture of Industrial and Marine Bacteria Aberdeen, Reino Unido
ifo Institute for Fermentation, Culture Collection of Microorganisms Osaka, Japón
Ambientes naturales
Como los microorganismos se adaptan fácilmente a cambios de nu-

trientes, la posibilidad de obtenerlos de distintos ambientes favorece la
diversidad enzimática. La cantidad de nutrientes presentes en el medio
natural es mucho menor que la que se agrega a los medios de cultivo, y
como además en un mismo ambiente conviven muchos y variados or-
ganismos, la cantidad de microorganismos que se producen es bastante
menor que la común en el laboratorio. Esto sucede porque los tiempos
de crecimiento de los microorganismos en esos ambientes son mucho
más largos y en general dicho crecimiento ocurre en etapas, ante la dis-
ponibilidad eventual de alimento. Esto condujo al desarrollo de métodos
de aislamiento específicos basados en diferentes principios, a saber:
a. Ambiente específico. La diversidad se obtiene con un aumento de

la concentración de sustrato en ambientes en los que solo puede exis-
tir un tipo determinado de microorganismos. Así, por ejemplo, a partir
de residuos alcalinos de industrias procesadoras de papa y fruta se han
aislado microorganismos alcalófilos productores de amilasas (Gee et al.,
1980) mientras que de suelos tratados con compuestos organofosfora-
dos en Filipinas se obtuvieron bacterias que contenían fosfotriesterasas
(Zhongli et al., 2001).
b. Cultivo enriquecido. Se manipulan las condiciones de cultivo de
manera que puedan crecer y sobrevivir microorganismos que expresen
una enzima determinada. Para ello se cultivan en un medio muy rico
microorganismos provenientes de un medio natural propicio para de-
terminada actividad enzimática y luego se los somete a un medio míni-
mo que contenga como única fuente de carbono el sustrato de interés.
Williams y col. (Vickers et al., 1984) usaron una combinación de ami-
noácidos e hidratos de carbono con antibióticos y sin ellos para favore-
cer el crecimiento de una especie no común de estreptomicetos. Estos
microorganismos son fuentes promisorias de metabolitos con actividad
antibiótica. Asano y col. (Asano, 2002) utilizaron esta técnica para ais-
lar las cepas R. rhodochrous J1 y P. chlororaphis B23, específicas para la
degradación de acetonitrilo e isobutironitrilo, respectivamente.
c. Aclimatación. El uso de sustratos tóxicos o no naturales puede
extender en gran medida los tiempos de análisis mediante la técnica
de cultivo enriquecido. Como alternativa se puede inducir la adapta-
ción de microorganismos a medios sintéticos que contengan el sus-
trato de interés. Los microorganismos que se pueden aislar, llamados
extraquimófilos (como una clase especial de los extremófilos, o sea es-
pecies que viven en ambientes extremos), en general presentan cam-
bios genéticos y por consiguiente pueden descubrirse nuevas enzimas a
partir de ellos (Asano, 1996). La enzima d-aminoácido amidasa fue
aislada de la cepa Ochrobactrum anthropi SV3, obtenida de una mues-
tra de suelo aclimatada por tres meses a un medio que contenía d-va-
linamida (Asano et al., 1989).
Metagenómica
El éxito del aislamiento de microorganismos de ambientes naturales de-

pende directamente del número de especies cultivables en el laboratorio.
Se sabe que solo se ha podido aislar y caracterizar el 1% de los micro-
bios y que, por lo tanto, aún existe en la naturaleza un gran potencial

enzimático sin descubrir (Amann et al., 1995). Por fortuna, las nuevas
tecnologías nos permiten acceder a esa porción de microorganismos no
cultivables (Short, 1997). El ADN genómico del conjunto de especies
presentes en muestras tomadas del ambiente seleccionado se extrae, en
forma total o parcial, mediante una estrategia de enriquecimiento que
favorece la presencia de los genes de los microorganismos de mayor
interés (Cowan et al., 2005). Luego, el ADN puede ser evaluado para
detectar actividades conocidas mediante el uso de técnicas de pcr (reac-
ción en cadena de la polimerasa) o bien utilizado para la formación de
bibliotecas de genes. Para este último uso se lo digiere con el objeto
de que se formen pequeños fragmentos que posteriormente se clonan
y se expresan en el vector adecuado. Una de las primeras bibliotecas se
obtuvo de ambientes marinos a mediados de la década de 1990 (Stein
et al., 1996) y a partir de allí se descubrieron alrededor de 150 enzimas
mediante esta técnica. En particular se encontró una esterasa que se
utiliza a escala industrial para degradar ésteres de terftalato, un com-
ponente importante de los bioplásticos (Michels et al., 2007). Actual-
mente es posible el acceso comercial a diferentes bibliotecas de genes
(Majernik et al., 2001). Además, la combinación de la metagenómica
con las diferentes tecnologías de ingeniería genética (dna shuffling,
proteómica, entre otras) ofrece un enorme potencial para el constante
descubrimiento de nuevos biocatalizadores.
SELECCIÓN DEL BIOCATALIZADOR
A diferencia de lo que sucede cuando se emplean los reactivos comu-

nes de química orgánica, es poco lo que se puede decir previamente
acerca de la especificidad de sustratos de la mayoría de las enzimas,
siendo que naturalmente evolucionan a catalizar reacciones cada vez
más específicas con alta eficiencia, al tiempo que pierden esa espe-
cificidad. Además, la velocidad de las reacciones enzimáticas puede
alterarse en presencia de diferencias estructurales mínimas respecto
de sus sustratos naturales. Todo lo expuesto determina que sea casi
imposible predecir si un compuesto no natural podrá ser sustrato de
una enzima determinada o no y por lo tanto es frecuente que se reali-
ce un screening para encontrar el biocatalizador más adecuado para la
biotransformación buscada.
Por otro lado, encontrar una nueva enzima significa encontrar una
nueva función microbiana. En ese sentido, las técnicas de screening clási-
cas son herramientas potentes porque involucran células vivas que man-
tienen sus funciones originales. Sin embargo, la combinación con las
nuevas tecnologías (biblioteca de genes, técnicas de evolución dirigida,
entre otras) ofrece interesantes posibilidades cuando lo que se requiere
es modificar enzimas de actividad conocida (Ogawa y Shimizu, 1999).
Screening versus selección
Cuando se desea evaluar un número elevado de muestras con el fin

de encontrar el biocatalizador adecuado para una biotransformación
específica, una de las primeras decisiones que se debe tomar es si se
llevará a cabo un screening o una selección. Esta decisión generalmente
se basa en el conocimiento previo de la enzima en estudio.
El método de selección consiste en favorecer solo el crecimiento de
células que contengan una actividad determinada. Se trata de un mé-
todo cualitativo y por lo general rápido que permite el análisis simul-
táneo de muchas muestras pero que puede resultar complejo porque no
siempre es posible desarrollar un ensayo adecuado para una propiedad
o reacción dadas. Sin embargo, una selección eficiente puede resultar
un primer paso atractivo para un proceso posterior de screening (Sean
et al., 2001). Los criterios de selección, como temperatura y pH, varían
de acuerdo con las propiedades de la enzima y por lo general se aplican
consideraciones similares a las establecidas para la técnica del cultivo
enriquecido. Mediante el empleo de esta estrategia se aislaron veinte
levaduras con potencial actividad probiótica después de sobrevivir en
líquidos intestinales expuestos previamente a jugos gástricos (Pennac-
chia et al., 2008) así como diversas Pseudomonas, luego caracterizadas,
fueron capaces de crecer en presencia de herbicidas (Chatterjee et al.,
1982). Más recientemente Rustler y Stolz (Rustler y Stolz, 2007) ob-
tuvieron una cepa de Exophiala mesophila apta para hidrolizar ciano-
hidrinas inestables a un pH mayor de 5 con 2-fenilacetonitrilo como
única fuente de carbono a pH 3.
Por su parte, el screening requiere que cada muestra sea analizada
por separado y puede conducir a resultados cuantitativos. Los ensayos
usualmente se llevan a cabo en microplacas con reacciones de detección
rápidas basadas en sustratos cromogénicos o fluorogénicos. Si esto no

es posible porque no existe una reacción adecuada o por problemas de
difusión (Chen, 2007) se pueden realizar ensayos con sustratos solubles
y efectuar la detección por cg o hplc. Si el número de muestras lo re-
quiere, el procedimiento puede llevarse a cabo en forma automatizada.
En consecuencia, a la hora de encarar un screening hay que considerar
tres puntos importantes (Ogawa y Shimizu, 1999):
a. El diseño del proceso. La principal consideración es la selección

del sustrato y de las condiciones de reacción. Lo ideal es mimetizar al
máximo la aplicación final que se busca. Para ello, el sustrato debe te-
ner una estructura lo más semejante posible a la del sustrato blanco, si
no fuera factible utilizarlo, y las condiciones deben ser las que permi-
tan una reacción eficiente y escalable.
b. La fuente de los biocatalizadores. La decisión acerca de qué grupo
de microorganismos o genes se va a seleccionar puede basarse en cono-
cimientos previos o bien ser aleatoria y se la puede tomar de acuerdo
con dos concepciones distintas: la del screening ecológico, en el que los
microorganismos se obtienen de ambientes ricos en sustratos análogos
como por ejemplo cuando se buscan lipasas en suelos provenientes de
fábricas de aceites, o la del screening taxonómico, en el que se utilizan
organismos de diversos filos provenientes de colecciones (Carballeira
et al., 2009).
c. El ensayo de detección. Debe idearse un ensayo de alta sensibi-
lidad, sencillo y de aplicación amplia que pueda ser utilizado en una
gran cantidad de muestras. Este aspecto es clave para el buen desarro-
llo del screening.
Entre los biocatalizadores positivos seleccionados se buscarán princi-

palmente aquellos que cumplan los siguientes criterios:
a. Producir la enzima con buen rendimiento y en tiempos razo-

nables.
b. Requerir nutrientes económicos y accesibles.
c. Ser fácilmente separables del medio de fermentación o de la en-
zima responsable de la actividad; ser extracelulares y fácilmente aisla-
bles del medio de cultivo.
d. No ser patógenos, ser genéticamente estables y no formar pro-
ductos secundarios o tóxicos.
La reducción enzimática de 4-cloroacetoacetato de etilo a 4-cloro-3-
hidroxibutanoato de etilo suele ser estereoespecífica. Esta actividad se
distribuye en forma amplia en las levaduras, los hongos y las bacterias
para dar generalmente el enantiómero S. En el caso particular de C.
magnoliae se ha demostrado su cualidad de excelente productor de
una enzima que genera dicho enantiómero. Sin embargo, a través
de un screening se comprobó que S. salmonicolor, Micrococcus luteus y
Cellulomonas sp. producen en forma predominante el enantiómero R
con alta conversión molar. La aldehído reductasa de S. salmonicolor ha
sido clonada, modificada y expresada en E. coli para la obtención de
4-cloro-3-hidroxibutanoato de etilo, producto intermedio en la síntesis
industrial de L-carnitina (Kita et al., 1996).
Métodos de screening
Screening jerárquico
Para llevar a cabo este screening se combinan varios tipos de ensayos en

etapas sucesivas con el fin de reducir el muestreo y aumentar la espe-
cificidad. El ensayo más simple y menos específico se realiza en primer
lugar mientras que el más complejo y cuantitativo se efectúa cuando el
número de candidatos es reducido. A modo de ejemplo, si el screening
completo consta de tres pasos:
Etapa 1: screening general o primario, que es rápido y simple y sir-

ve para eliminar la mayor parte de los resultados negativos. En gene-
ral se utilizan sustratos análogos económicos. Puede sustituirse por un
paso de selección.
Etapa 2: screening intermedio o secundario, en el que se emplean
sustratos más específicos o aproximaciones semicuantitativas.
Etapa 3: screening específico, que es más cuidadoso y cuantitativo y
en general involucra métodos cromatográficos (hplc, gc) o espectro-
fotométricos.
Ogawa y colaboradores (Ogawa et al., 2003) llevaron a cabo un scree-

ning jerárquico que les permitió identificar una bacteria con activi-
dad de dera (2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa) capaz de catalizar
la síntesis de 2-desoxirribosa-5-fosfato (DR5P) a partir de glucosa.

Un primer paso de la selección consistió en aislar a partir de mues-
tras de suelo 117 cepas que crecieron en presencia de 2-desoxirribosa
como única fuente de carbono. Seis de los microorganismos evaluados
fueron seleccionados después de verificar la formación de DR5P y su
supervivencia a partir de gliceraldehído-3-fosfato, su sustrato natural, y
altas concentraciones de acetaldehído, que es un requisito esencial para la
reacción. Finalmente se seleccionó una cepa identificada como Klebsiella
pneumoniae porque producía grandes cantidades del producto buscado.
Screening de alto rendimiento
El constante desarrollo de nuevos procesos industriales exige que día

a día se descubran biocatalizadores de mayor especificidad y para en-
contrarlos por lo general se necesita la realización de un screening que
será más efectivo cuanto mayores sean la diversidad y la versatilidad
de sus componentes. Tanto la naturaleza, con los cientos de miles de
microorganismos que pueden hallarse en una muestra determinada,
como las nuevas tecnologías, que nos brindan numerosos bancos de
clones o de genes, contribuyen a ese propósito.
Los métodos de hts son esencialmente similares a los tradicionales
pero han sido adaptados para el tratamiento de una gran cantidad de
muestras. Hasta hace unos años, la metodología era básicamente manual,
trabajosa y con bajos rendimientos, lo que conducía a costos de desa-
rrollo elevados (Houston, 1996). El aumento del número de muestras
y el avance en instrumentación llevaron a la instalación definitiva de
la automatización. Las microplacas tradicionales de 96 lugares fueron
sustituidas por placas de 3.456, con volúmenes que alcanzan el orden
de los nanolitros (Comley et al., 1997). Mediante el empleo de siste-
mas robotizados, junto con sistemas de detección eficientes que deben
ser específicamente diseñados para hts, se pueden analizar cerca de
106 cepas en forma simultánea y a costos relativamente bajos (Hous-
ton y Bankst, 1997).
Los trabajos desarrollados con galactosa oxidasa constituyen un
ejemplo ilustrativo. Esa enzima cataliza la oxidación de alcoholes pri-
marios a aldehídos en condiciones mucho más favorables, en términos
sintéticos y ambientales, que la mayoría de los reactivos químicos uti-
lizados habitualmente. Por ese motivo en los últimos años ha sido un
blanco atractivo para el desarrollo de procesos industriales. Después de
realizar estudios de evolución dirigida se desarrollaron diversos hts con
el propósito de superar las limitaciones de las enzimas naturales sobre
diferentes sustratos, como el descrito para el polímero vegetal guar, uti-
lizado como aditivo en la industria del papel (Delagrave et al., 2001).
Ensayos de detección
El diseño y la utilización de ensayos de detección de funciones en-

zimáticas (enzyme assays) han alcanzado un enorme desarrollo en los
últimos años debido al aumento del uso de biotransformaciones a nivel
industrial y al descubrimiento de enzimas a través de técnicas de hts
(Ogawa y Shimizu, 1999; Reetz et al., 2001; Reymond, 2006).
El ensayo ideal debe ser de realización sencilla, utilizar reactivos
económicos y accesibles y dar una respuesta confiable; esto es, que no
conduzca a resultados falsos positivos o falsos negativos (Beloqui et al.,
2008). Para producir una señal observable cuando un sustrato se convier-
te en producto existen diferentes caminos, los que pueden ser directos o
indirectos. Dentro de los directos pueden ocurrir cambios macroscópi-
cos del medio de reacción (producción de calor, modificación del color
o aparición de precipitados) o cambios espectrales debidos a diferen-
cias estructurales entre reactivos y productos que permitirán seguir la
reacción por uv, em o rmn. También es posible utilizar métodos ana-
líticos tradicionales como cg o hplc para examinar el avance de la re-
acción. Los métodos indirectos más simples involucran quimiosensores
colorimétricos o fluorimétricos que responden a cambios relacionados
con la formación de producto o el consumo de sustrato, como puede ser
un indicador de pH. Otro método indirecto muy usado se basa en el
acoplamiento de otra reacción enzimática o química que utilice como
sustrato el producto obtenido.
Por otra parte, los métodos de detección pueden ser continuos o bien
involucrar el análisis de los productos obtenidos una vez finalizada la
reacción (Martínková et al., 2008). Se ha descrito un ejemplo de método
continuo directo para detectar actividad de nitrilasa o de nitrilohidrata-
sa (Vejvoda et al., 2008). En este ensayo la conversión de benzonitrilo
en benzamida o ácido benzoico puede llevarse a cabo espectrofotomé-
tricamente a 238 nm debido a que el sustrato no presenta absorción a
esa longitud de onda. Puede detectarse el mismo tipo de actividad si
se controla la fluorescencia del nadh formado o consumido por aco-

plamiento con la reacción de obtención de glutamato a partir de amo-
níaco y 2-cetoglutarato que requiere nadh, catalizada por la enzima
glutamato deshidrogenasa (Reisinger et al., 2006). Este ensayo puede
usarse tanto para enzimas aisladas como para células enteras.
Para detectar actividad de aldolasa se han desarrollado diversos mé-
todos de detección fluorogénicos y amperométricos. En particular se en-
contraron nuevos biocatalizadores con actividad retro-aldol, retro-Michael
utilizando la formación de complejos con hierro (Shamis et al., 2007).
Hevea brasiliensis y Prunus amygdalus son fuentes de hidroxinitri-
lo liasas que se utilizan en aplicaciones industriales para la síntesis de
numerosos precursores de compuestos en química fina. Después de
aplicar técnicas de evolución dirigida y selección de nuevas enzimas
por hts a partir de bibliotecas de mutantes se consiguieron mejoras
en cuanto a la estabilidad y la aceptación de sustratos específicos. Los
ensayos enzimáticos informados involucran la detección por métodos
colorimétricos del hcn gaseoso liberado durante la reacción (Krammer
et al., 2007). También se han obtenido mutantes que contienen de d-
amino oxidasa activa sobre ácido d-aspártico a partir de una biblioteca
generada por técnicas de mutagénesis y hts con un sistema de detec-
ción de alta sensibilidad basado en el acoplamiento con una peroxidasa
que utiliza el peróxido de hidrógeno formado durante la desaminación
oxidativa del sustrato para formar un producto de oxidación insoluble
(Khoronenkova y Tishkov, 2008).
CONCLUSIONES
El empleo de biotransformaciones tanto en ámbitos académicos como

industriales es cada vez más frecuente. Se utilizan enzimas de las más
variadas fuentes como biocatalizadores para llevar a cabo reacciones que
eran impensables dos décadas atrás. No hay biotransformaciones im-
posibles, solo hay biocatalizadores desconocidos.
La Tierra contiene una gran cantidad de ambientes únicos y varia-
dos; naturales simples o extremos, artificiales como las instalaciones
industriales o las plantas de tratamiento de residuos. El potencial del
screening radica en esta enorme diversidad de la Tierra. Los organis-
mos están allí; tenemos que desarrollar las técnicas necesarias para
seleccionarlos y para aislarlos. El mayor desafío actual es el desarro-
llo de técnicas de detección que permitan analizar un gran número
de muestras en forma simultánea. Se trata de un problema multidis-
ciplinario que requiere los conocimientos de químicos, ingenieros y
microbiólogos.
La búsqueda de nuevos biocatalizadores es un desafío importante
para la biotecnología. Cabe esperar que los avances en las áreas de in-
geniería genética y de proteínas tengan una repercusión sustancial so-
bre la generación de nuevos sistemas, si bien por ahora ese progreso se
ve sobre todo a nivel de la optimización del producto.
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CAPÍTULO 2
Los vegetales en biocatálisis

Marcela Kurina-Sanz y Alejandro A. Orden
INTRODUCCIÓN
Como resultado de la actividad fotosintética las 320 mil especies vege-

tales que, aproximadamente, existen en el planeta sintetizan metabo-
litos primarios de los que derivan vías metabólicas secundarias que se
presume que comenzaron a evolucionar hace más de 1.700 millones de
años. Estos procesos evolutivos han dado origen a una gran diversidad
de compuestos cuya estructura solo se ha determinado en unos 140
mil casos, agrupados en no más de 6.000 tipos de esqueletos básicos.
Muchos de esos metabolitos secundarios son exclusivos del reino ve-
getal. Como consecuencia, las plantas constituyen interesantes fuentes
de enzimas que no se encuentran presentes ni en los microorganismos
ni en los animales. En las últimas décadas la enzimología vegetal se ha
concentrado en el entendimiento de los procesos básicos que permi-
ten que las plantas se desarrollen y sobrevivan. Además, ha realizado
aportes a la comprensión de cómo se entrecruzan las vías del meta-
bolismo primario y secundario para la síntesis de entidades químicas
específicas en respuesta a situaciones particulares y generales, vinculadas
con la interrelación de las plantas y su ambiente. Las células vegetales
son totipotentes, lo que significa que cada célula no solo conserva la
misma información genética de la planta parental sino también las
mismas capacidades bioquímicas, es decir, que potencialmente puede
expresar las mismas enzimas. Esto significa que los cultivos celulares
o de tejidos representan una alternativa tecnológica interesante tanto
para la producción de metabolitos secundarios de alto valor como para
la utilización de sus enzimas en biocatálisis y biotransformaciones.
| 47
Afortunadamente, muchos catalizadores de origen vegetal exhiben una
amplia tolerancia de sustratos, aceptan una considerable cantidad de
compuestos xenobióticos y conservan en buen grado su quimio-, regio-
y enantioselectividad.
Durante décadas, los químicos han usufructuado esas caracterís-
ticas para realizar biotransformaciones de productos naturales, sobre
todo con cultivos celulares, mediante la incorporación como sustratos
de moléculas de diverso origen biogenético. En algunos casos se han
transformado intermediarios de rutas biosintéticas propias de la espe-
cie en cuestión para que fueran “metabolizados” a compuestos termina-
les de esas vías o incluso para generar compuestos novedosos. En este
sentido, los estudios de biotransformación han permitido interpretar
interacciones alelopáticas.
A pesar de que los químicos se sienten atraídos por las ventajas me-
todológicas que representa el uso de enzimas aisladas y de sistemas de
reciclado de cofactores, para muchas enzimas estas herramientas todavía
se encuentran en los comienzos de su desarrollo. Como consecuencia,
el uso de microorganismos sigue cobrando importancia, al igual que el
de catalizadores de origen vegetal, como una fuente alternativa de en-
zimas. Estas últimas pueden provenir del empleo de material obtenido
de plantas silvestres o cultivadas, de órganos específicos desarrollados
in vitro o de células indiferenciadas.
ÓRGANOS Y TEJIDOS VEGETALES COMO BIOCATALIZADORES
Indudablemente, el gran atractivo de utilizar fragmentos de vegetales

frescos como biocatalizadores es la sencillez con la que puede desa-
rrollarse la etapa de catálisis, dado que en su mayor parte consiste en
realizar una desinfección superficial de los órganos o tejidos seleccio-
nados e incorporarlos al medio de biorreacción, generalmente agua o
soluciones reguladoras con o sin el agregado de azúcares. Sin embargo,
esta metodología puede complicarse, según el tipo de tejido utilizado,
en la etapa de extracción y purificación de los productos de biotransfor-
mación, puesto que los solventes extraen gran cantidad de compuestos
del vegetal. El principal inconveniente, salvo en casos excepcionales, es
la falta de reproducibilidad, aun cuando se tenga la certeza de haber
realizado una clasificación botánica rigurosa. Las variaciones estacio-
48 | MARCELA KURINA-SANZ Y ALEJANDRO A. ORDEN

nales, geográficas, de los cultivares disponibles y, muy especialmente,
la presencia de microorganismos asociados y endofíticos, son las prin-
cipales causas que impiden estandarizar los procesos.
Zanahoria, un biorreductor estereoselectivo
Sin lugar a dudas la especie vegetal más estudiada en biocatálisis asimé-

trica, particularmente en la reducción de aldehídos y cetonas proquirales,
es Daucus carota (zanahoria). Su gran disponibilidad, su bajo costo y la
sencillez del proceso de purificación y recuperación de los productos de
reacción ponen a este biocatalizador en ventaja frente a otros sistemas
vegetales (figura 1).
Baldasarre y col. fueron los primeros en utilizar raíces frescas de zana-
horia en agua como medio de reacción para la biorreducción de mezclas
racémicas de 2-metilciclohexanona y 2-hidroxiciclohexanona (Baldas-
arre et al., 2000). El procedimiento de biotransformación es muy sim-
ple y resulta una alternativa al uso de levaduras de cerveza (Bruni et al.,
2002) porque el medio de reacción es simplemente agua sin el agregado
de fuentes de hidrato de carbono y esa característica facilita el proceso de
purificación y recuperación de productos debido a que no hay forma-
ción de espuma y la relación sustrato:catalizador es de 1/200.
En un trabajo de referencia se evaluó la reducción asimétrica de ce-
tonas comerciales precursoras en la síntesis de drogas y agroquímicos
quirales, derivadas de acetofenona, cetonas alifáticas cíclicas y de cade-
na abierta, β-cetoésteres y azidocetonas (Yadav et al., 2002). En el caso
de las acetofenonas, la reducción siguió la regla de Prelog y condujo
a los S-alcoholes con excelentes rendimientos y purezas ópticas en un
período breve (40-50 horas). Se observó que la presencia de sustitu-
yentes dadores de electrones (-metil y -metoxi) disminuía la velocidad
de reacción. La cetona cíclica indanona y distintas tetralonas fueron
reducidas de manera eficiente después de las 70 horas de incubación,
con conversiones de solo el 60% pero con una excelente enantioselec-
tividad. Los β-hidroxiésteres sirven como material de partida para la
síntesis de β-lactamas, feromonas de insectos y carotenoides. La reduc-
ción de β-cetoésteres catalizada por D. carota condujo a los alcoholes,
en su mayor parte con estereoquímica S, con muy buena pureza óptica
y buenas conversiones. Hubo una excepción, constituida por los sustra-
tos 4-azido-3-oxobutanoato de etilo, 4,4,4-triflúor-3-oxobutanoato de
LOS VEGETALES EN BIOCATÁLISIS | 49

FIGURA 1. Raíces de zanahoria, un biocatalizador altamente selectivo “al alcance
de su mano”
O OH
S S
L L
etilo y 3-oxo-4-fenilsulfonilbutanoato de etilo, en los cuales la trans-

ferencia del hidruro del NAD(P)H tuvo lugar por la cara si, para ren-
dir el enantiómero R. Como ya se mencionó, los sustituyentes dadores
de electrones en posiciones orto y para del anillo aromático se reducen
muy lentamente, resultados compatibles con los informados por Mączka
y Mironowicz, autores que además de D. carota emplearon la especie
Apium graveolans (apio) para estudiar la influencia en las biorreduccio-
nes de los sustituyentes -metoxi y -bromo en las posiciones orto, meta
y para de acetofenona (Mączka y Mironowicz, 2004). Por otro lado,
la reducción asimétrica de cetonas alifáticas de cadena abierta de 4 a
7 miembros requirió mayor tiempo de incubación (3-5 días) para al-
canzar rendimientos aislados de solo 30 a 50%. Esos bajos índices de
recuperación pueden ser explicados en parte por la elevada volatilidad
de estos compuestos con la consiguiente pérdida durante el proceso de
purificación. Los compuestos que presentaban mayor diferencia en la
longitud de las cadenas de ambos sustituyentes, como la 2-hexanona
y la 2-heptanona, dieron los mejores ee (superiores al 90%). Las raíces
de D. carota resultaron muy efectivas en la reducción de azidocetonas,
con excelentes purezas ópticas y muy buenos rendimientos (49-72%).
Si bien la configuración de los alcoholes obtenidos fue R, es importante
tener en cuenta que esto se debe a que la prioridad de los sustituyen-
tes que flanquean al grupo carbonilo (según la regla de Cahn, Ingold
y Prelog) es diferente de la de los otros sustratos estudiados, por la
presencia de los átomos de nitrógeno con mayor número atómico. Sin
embargo, esto no indicaría una estereopreferencia opuesta a la descrita
para las enzimas presentes en D. carota.

Si bien el potencial biocatalítico de las células de D. carota ha que-
dado bien establecido, a partir de raíces de zanahoria se aislaron varias
cepas de microorganismos endofíticos, entre ellos levaduras del género
Pichia y bacterias de los géneros Pseudomonas, Staphylococcus y Micro-
coccus. Como se demostró que esos agentes presentaban la capacidad de
reducir cetonas proquirales con cierto grado de estereocontrol se piensa
que podrían estar involucrados, en cierta medida, en el proceso global
de la biorreducción (Rodríguez et al., 2007).
Reducción estereoselectiva mediada por zanahoria como etapa clave

en la preparación quimioenzimática de compuestos de interés
La reducción estereoselectiva de 2-azido-1-feniletanonas con raíces

de zanahoria constituye la etapa biocatalítica de la preparación qui-
mioenzimática del fármaco R-denopamina, un antagonista β selectivo
para el tratamiento de trastornos cardíacos congestivos, y de otras dos
moléculas bioactivas naturales, R-tembamida y R-aegelina, usadas en
medicina tradicional hindú como hipoglucemiantes (figura 2). Si bien
al ser llevada a cabo con cultivos de Saccharomyces cerevisiae la etapa de
reducción brindó resultados comparables, se seleccionaron las raíces
de zanahoria a causa de la simplicidad operacional, la mayor facilidad
en el aislamiento de los productos y la disponibilidad y economía del
biocatalizador (Yadav et al., 2001).
También se han empleado las raíces de D. carota para reducir
γ-nitrocetonas con el fin de obtener δ-nitroalcoholes, que son sintones
en la preparación de alcaloides como las pirrolidinas, las indolizinas y
las pirrolizidinas, feromonas como espirocetales y lactonas. En todos los
casos se obtuvieron los S-alcoholes, excepto para el m-nitro derivado,
con purezas ópticas de entre el 73 y el 100% de ee. La enantioselectivi-
dad de las reducciones es mayor que la observada con S. cerevisiae para
los mismos sustratos, aunque con las raíces de zanahoria se transformó
un número menor de cetonas (Scarpi et al., 2005).
Las raíces de este biocatalizador han sido utilizadas en la preparación
quimioenzimática de S-tetrahidropiranoles por medio de la reduc-
ción enantioselectiva de tetrahidropiran-4-onas sustituidas en posición
2 (Yadav et al., 2008). En ella la transferencia del hidruro tiene lugar
sobre la cara re de la cetona proquiral, independientemente de la con-
figuración del estereocentro en la posición 2 (figura 3). También se han

FIGURA 2. Preparación quimioenzimática de los principios activos tembamina,
aegelina y denopamina. Etapa clave en la reducción enantioselectiva catalizada
por raíces de zanahoria
O OH
N3 D. carota N3
c: 99%, ee: 99%
RO H2O, Tamb. RO
H2 (Pd/C)
MeOH, Tamb
OH
NH2
RO
O 50% NaOHaq /Cl 2CH2
R1 Cl tolueno 5-10ºC
OH H OH H
N N
MeO O MeO O
Tembamida Aegelina
OH H
N OMe
HO O OMe
Denopamina
FIGURA 3. Resolución de racematos a una mezcla de diastereoisómeros por

reducción enantioselectiva con raíces de zanahoria
O OH OH
D. carota
+
H2O, Tamb.
R O R O R O
(+/-) (-)-2S,4S (+)-2R,4S
R= aril o alquil

aplicado con buenos resultados raíces de D. carota en la reducción de
3-oxo-aminas cíclicas, precursoras de la síntesis de capromorelina, un
fármaco que se encuentra en estudio por sus propiedades antienvejeci-
miento, debido a que produce un aumento de la producción de hormona
del crecimiento (Lacheretz et al., 2009).
Otras especies vegetales comestibles como catalizadores quirales
A partir de 2006 empezaron a aparecer publicaciones con descripciones

de la reducción de cetonas y la oxidación de sec-alcoholes en procesos
biocatalizados por plantas enteras, en la mayor parte de los casos de
especies comestibles. Por ejemplo, se describió el empleo de raíces
de Manihot esculenta y M. dulcis (mandioca), especies de importancia
agronómica usadas en la preparación de alimentos tradicionales en el
noreste de Brasil, en África y en Asia, para la reducción de aldehídos y
cetonas aromáticas y alifáticas. Los S-alcoholes fueron obtenidos con
excelentes rendimientos y ee al cabo de tres días de reacción. Ambas
especies tuvieron un comportamiento similar en la reducción del grupo
carbonilo e incluso, en algunos casos, comportamientos superiores a los
observados con raíces de D. carota (Machado et al., 2006).
En un estudio de carácter más sistemático se analizó la capacidad
biocatalítica de varias especies comestibles en la reducción de cetonas
aromáticas y la biooxidación de alcoholes secundarios (Andrade et al.,
2006). Las mejores purezas ópticas en la reducción de acetofenona, con
ee del S-alcohol mayores del 98%, se alcanzaron con cilantro (Corian-
drum sativum), nabo (Brassica rapa), cebolla de verdeo (Allium schoeno-
prasum) y jengibre (Zingiber officinale). El alcohol con estereoquímica
R solo se obtuvo con pureza óptica aceptable con remolacha (Beta vul-
garis). La resolución cinética de la mezcla racémica de 1-feniletanol
fue satisfactoria con cebolla de verdeo (A. schoenoprasum) y rabanitos
(Raphanus sativus). En el primer caso, al cabo de seis días, alrededor
del 54% del alcohol se oxidó a acetofenona y dejó el R-1-feniletanol
con excelente pureza óptica. Por otro lado, se obtuvieron resultados más
atractivos con arracacha (Arracacia xanthorrhiza), jengibre (Z. officina-
le) y bacón (Polymnia sonchifolia), que mostraron el comportamiento
característico de una completa desracemización. La formación de un
enantiómero con un ee >90% a partir de un racemato podría proceder
a través de una secuencia redox en dos etapas, es decir, un enantiómero

es oxidado a la correspondiente cetona, la que a su vez es reducida, en
un segundo paso, por otra enzima redox con preferencia estereoquími-
ca opuesta (figura 4).
Recientemente se demostró la capacidad de la corteza de los fru-
tos de maracuyá (Passiflora edulis) para reducir carbonilos, particular-
mente aldehídos, pero también cetonas y β-cetoésteres aunque con
baja estereoselección, con el uso de agua como solvente (Machado et
al., 2008).
CÉLULAS VEGETALES INDIFERENCIADAS COMO BIOCATALIZADORES
El cultivo de vegetales in vitro permite planificar la producción de

acuerdo con la demanda e independientemente del clima, las enfer-
medades, las características del suelo, las interacciones alelopáticas, la
presencia de microorganismos y los problemas sociopolíticos. Incluso
es posible explotar especies no domesticadas o de difícil cultivo en
el campo. Es factible establecer cultivos en medios sólidos de tejidos
vegetales indiferenciados, denominados callos, a partir de explantos de
plantas silvestres o de plántulas germinadas in vitro a partir de semi-
llas, en medios de cultivo especialmente formulados y suplementados
con fitorreguladores (figura 5). Estos desarrollos poseen gran aptitud
para la multiplicación vegetativa por lo que pueden ser subcultivados
repetidas veces de manera de obtener líneas celulares que, en términos
biotecnológicos, pueden ser tratadas en forma similar a los cultivos micro-
bianos. Una característica muy interesante es que en medios líquidos el
medio de cultivo funciona como una organela más, o bien puede con-
siderarse una continuación del apoplasto, donde se excretan enzimas
con buenos índices de actividad y se almacenan sustratos y productos
que se intercambian en forma dinámica, tanto por transporte activo
como pasivo, con las células en cultivo. Las biorreacciones pueden ser
catalizadas por exoenzimas como las peroxidasas o las hidrolasas o
por enzimas intracelulares. Como ya se mencionó, las células pueden
captar una gran diversidad de sustratos e introducirlos en los compar-
timientos enzimáticos y sus productos de bioconversión pueden ser
liberados en el medio de cultivo. Este fenómeno facilita enormemente
las operaciones de recuperación y purificación y en muchos casos
permite optimizar los procesos mediante la aplicación de técnicas de

FIGURA 4. Secuencia de desracemización de (R, S) alcoholes catalizada por
plantas
OH O OH
Biooxidación + *
R R R
(+/-) (R) o (S)
Biorreducción
inmovilización celular. Una modalidad muy conveniente consiste en

trabajar con sistemas de células en reposo, en los que los medios de
biorreacción se simplifican de manera de utilizar sencillamente solu-
ciones tamponadas, lo que facilita los procesos de extracción y reduce
al mínimo la posibilidad de reacciones secundarias. La capacidad de
biocatalizar de una línea celular determinada puede ser optimizada
mediante selección celular, permeabilización, elicitación biótica o abió-
tica, cambios en las características de los medios de cultivo, sistemas
de incubación, etcétera.
A pesar de que el uso de cultivos vegetales indiferenciados ha dado
lugar a reacciones de particular interés, debido al amplio repertorio en-
zimático de las plantas superiores, el mismo presenta algunas desventa-
jas. Los callos suelen mostrar inestabilidad genética como resultado de
su tendencia a duplicar el número de cromosomas por endorreduplica-
ción, lo que causa poliploidía, o por su tendencia a perder cromosomas
individuales. La inestabilidad también puede ser epigenética, es decir,
debida a una expresión selectiva de los genes que ocasiona cambios fe-
notípicos, que no son el resultado de variaciones del ADN. Aunque no
hay transmisión de este tipo de variaciones por meiosis a la progenie,
los cambios epigenéticos son hereditarios y estables porque se mani-
fiestan en las generaciones de células hijas originadas por mitosis. Por
otro lado, estos cultivos requieren un equipamiento especial que incluya
cabina de flujo laminar, salas de incubación con control de la tempera-
tura y la iluminación, estricta vigilancia de las condiciones de esterili-
dad y, sobre todo, un alto grado de entrenamiento en la iniciación y el
mantenimiento de las líneas celulares.

FIGURA 5. Tejidos vegetales indiferenciados en medios sólidos

Hidroxilaciones regioselectivas y estereoselectivas
Un tipo de reacción muy explotado con cultivos celulares es la hidroxi-

lación de sustratos exógenos, por lo general con un enfoque más rela-
cionado con la biotransformación de metabolitos de interés que con la
biocatálisis. En este sentido abundan los ejemplos de biotransformacio-
nes oxidativas sobre terpenos, esteroides, fenilpropanoides y alcaloides.
El grado de regioselectividad y estereoselectividad de estas reacciones
es muy alto. La incorporación de oxígeno molecular puede tener lugar
mediante la monohidroxilación de carbonos no activados o de centros
activados por medio de la presencia de un doble enlace C=C en po-
sición alílica y también la dihidroxilación estereoespecífica de dobles
enlaces C=C. En la década de 1980 se publicó una sucesión de trabajos
que daban cuenta de la capacidad de los cultivos celulares de Nicotia-
na tabacum para hidroxilar posiciones alílicas endocíclicas y exocícli-
cas en monoterpenos como linalool, dihidrolinalool, (±)-α-terpineol,
β-terpineol, (4S)-α-terpineol y (4R)-α-terpineol (figura 6) (Ishihara
et al., 2003). Se comprobó que en la hidroxilación de la posición alílica
de α−terpineol el sistema presenta enantiopreferencia por el isómero
4S. Sobre el α, el β y el γ−terpineol y sus acetatos las dihidroxilaciones
sobre los dobles enlaces rindieron predominantemente los dioles trans,
lo que sugiere que podría tratarse de una epoxidación del doble enlace
seguida de hidrólisis (figura 7).
Con cultivos en suspensión de células del género Digitalis se logró
hidroxilar el heterósido cardiotónico digitoxigenina en uno de los pri-
meros trabajos de biotransformación con cultivos celulares vegetales
(Hirotani y Furuya et al., 1980). Posteriormente, con cultivos de especies
de Strophanthus se pudieron hidroxilar estereoselectivamente las posi-
ciones C-1, C-5, C-12 y C-16 del mismo sustrato (figura 8) (Furuya
et al., 1988; Kawaguchi et al., 1989).
Reductasas sobre xenobióticos proquirales
Carbonil reductasas
En la década de 1990 Naoshima y Akakabe abordaron la reducción

asimétrica de cetonas aromáticas con células indiferenciadas de Gardenia
jasminoides, N. tabacum y D. carota, inmovilizadas en perlas de algina-

FIGURA 6. Sitios de hidroxilaciones alílicas sobre monoterpenos mediadas por
monooxigenasas de cultivos de células vegetales
OR
OR
FIGURA 7. Dihidroxilación de monoterpenos con cultivos celulares de N. tabacum

(muy posiblemente mediada por la apertura de epóxidos generados por la acción
de monooxigenasas)
OH OH OH
OH
N. tabacum N. tabacum
OH
OH OH OH
α y β-terpineol γ -terpineol
Monooxigenasa OH
O
OH
to de calcio, y obtuvieron los S-alcoholes con excelentes ee y tasas de

conversión aceptables (figura 9) (Naoshima y Akakabe, 1991; Akakabe
y Naoshima, 1994).
Se llevaron a cabo otras experiencias con el objeto de investigar
la capacidad reductora de líneas celulares provenientes de varias es-
pecies vegetales sobre metilcetonas con diferentes características es-
téricas y estereoelectrónicas. Se usaron 18 líneas celulares, entre ellas
D. carota, frente a la reducción de la cetona alifática 2-pentanona, la
acetofenona y el β-cetoéster acetoacetato de etilo. En todos los casos

FIGURA 8. Posiciones de hidroxilación regioselectivas y enantioselectivas de digitoxi-
genina con monooxigenasas de diferentes cultivos celulares indiferenciados
O O
Digitalis lanata
Strophanthus gratus Digitalis purpurea
OH
HO
H
Strophanthus intermedius
FIGURA 9. Reducción enantioselectiva de alquilarilcetonas con células inmovilizadas

de D. carota (zanahoria), N. tabacum (tabaco) y G. jasminoides (jazmín del cabo)
OH HO OH
OH
O O
D. carota
N. tabacum
O O
G. augusta
OH OH HO
D. carota proporcionó los mejores rendimientos al cabo de 24 horas

de incubación, con ee superiores al 98% de los S-alcoholes (Villa et
al., 1998). De las 18 especies consideradas en este ensayo, 16 redu-
jeron el β-cetoéster con mejores tasas de conversión y pureza óptica
que las informadas para N. tabacum (Naoshima y Akakabe, 1989). La
capacidad biocatalítica de los cultivos de células indiferenciadas de D.

carota fue explorada también en la reducción de α-cetoésteres de áci-
dos carboxílicos 4-aril-α-hidroxi-buten-3-oicos (Baskar et al., 2004).
Si bien en esta experiencia el tiempo de reacción fue prolongado (10
días), en todos los casos se obtuvieron conversiones del 100% con ren-
dimientos aislados de los productos de entre el 52 y el 73% y elevadas
purezas ópticas (92-98% de ee) de los isómeros R. Una de las principa-
les ventajas del uso de este sistema biocatalítico es la selectividad en la
reducción del grupo carbonilo sin compromiso del doble enlace C=C
adyacente a él (figura 10).
Enoato reductasas
Las enoato reductasas son enzimas muy interesantes para la biocatálisis

porque pueden reducir dobles enlaces en posiciones α a grupos car-
bonilo. Si bien han sido muy estudiadas en levaduras, en los vegetales
también muestran un alto grado de estereoselección cuando el doble
enlace presenta sustituyentes distintos del hidrógeno. Los cultivos ce-
lulares de varias especies, como por ejemplo Medicago sativa, Glycine
max, Vinca minor y Catharanthus roseus, reducen selectivamente el doble
enlace C=C de 2,3-ciclohexenona (Kergomard et al., 1988). N. taba-
cum también ha demostrado ser capaz de reducir selectivamente los
dobles enlaces C=C endocíclicos conjugados con grupos carbonilo de
4R y 4S-carvonas, sin atacar al doble enlace C=C de la cadena lateral
no conjugado con el grupo carbonilo. Esta es una reacción estereose-
lectiva, dado que se trata de una anti adición de hidrógeno sobre la
cara si del C-2 y sobre la cara re del C-3 con generación de (2R, 5R)-
dihidrocarvona. Otro ejemplo es la reducción de este monoterpeno con
cultivos en suspensión de plantas hepáticas para obtener el producto
(+)-n-dihidrocarvona que luego, en una etapa lenta, es aceptado como
sustrato por una carbonil reductasa que genera neo-dihidrocarvenol
(Speicher et al., 2003). Asimismo, hay estereocontrol de la reducción
del doble enlace C=C de verbenona y pulegona, esta última también
catalizada por cultivos en suspensión de Mentha sp. (Ishihara et al.,
2003). Esta biorreacción, catalizada por células de N. tabacum, fue
utilizada para obtener succinimidas por hidrogenación estereoselectiva
de maleimidas N-sustituidas (Hirata et al., 2004), mientras que con
cultivos celulares de Marchantia polymorpha se hidrogenaron enlaces
C=C conjugados con grupos carbonilo presentes en los sesquiterpenos

FIGURA 10. Reducción quimioselectiva y enantioselectiva de α-cetoésteres con
cultivos indiferenciados de zanahoria
O OH
OR' D. carota OR'
O O
R R
c: 100%; ee: 92-99%
santonina y p-hidroxibenzoato de lancerodiol (Hegazy et al., 2006).

Estos últimos cultivos celulares también fueron eficaces para realizar
reducciones asimétricas del enlace C=C de 2-butenólidos 2-sustituidos
(figura 11) (Shimoda y Kubota, 2004).
Las carvonas, junto con geraniol, también han sido sustratos mo-
noterpénicos modelo utilizados para estudiar biotransformaciones con
cultivos en suspensión de C. roseus. En esos estudios se observó que
en el terpeno acíclico se hidroxilaba selectivamente la posición alílica
C-10 y se generaba, probablemente por acción de una monooxigenasa,
el alcohol primario 10-hidroxigeraniol. La (-)-carvona sufre la acción de
ceto reductasas y enoato reductasas, además de ser hidroxilada selecti-
vamente en la posición C-4β (figura 12) (Hamada et al., 1997; 1998).
Glicosidaciones
Las conjugaciones con azúcares son reacciones de biotransformación

características en diferentes sistemas vegetales dado que presentan una
gran distribución de glicosiltransferasas. Esto se debe a que en las plan-
tas superiores muchos grupos de metabolitos secundarios, como por
ejemplo las saponinas y las antocianinas, se presentan como glicósidos
que se acumulan en el interior de las vacuolas. Aun con la probabilidad
de que los metabolitos finales no sean excretados al espacio extracelular,
el estudio de estas reacciones sobre sustratos xenobióticos resulta muy
interesante porque brinda la posibilidad de realizar un procedimien-
to “one-step” de glicosidación. En general, se presentan dos tipos de
conjugaciones con azúcares: la formación de ésteres a partir de ácidos
carboxílicos, como sucede con el ácido 2-fenilpropanoico con raíces de

FIGURA 11. Enoato reductasas vegetales. Su empleo para la generación de nuevos
centros estereogénicos
O Medicago sativa O
Glycine max
Vinca minor
Catharanthus roseus
Marchantia polimorfa
Enoato reductasas en cultivos celulares vegetales
R R
N. tabacum
O M. sativa O
O O O O
R M. polimorfa R
N N (R/S)-carvona
O O O O
R1 R1
Panax ginseng (Furuya et al., 1989) (figura 13), y la formación de glicó-

sidos, en su mayor parte O-glicósidos sobre grupos hidroxilo (figura 14),
o en ocasiones N-glicósidos (Ishihara et al., 2003). En ambos casos las
reacciones más comunes son las reacciones con glucosa pero abundan
las conjugaciones con otros azúcares, por ejemplo con xilosa, L-fucosa,
disacáridos como la sacarosa y la gentibiosa, diversos oligosacáridos y
el polialcohol inositol.
Tal vez los cultivos celulares vegetales que más se han empleado
para glicosidar sustratos xenobióticos sean los de eucalipto (Eucalyp-
tus perriniana) y tabaco (N. tabacum). Entre los primeros trabajos se
describe el empleo de suspensiones de células de eucalipto para trans-
formar los monoterpenos mentol y β-thujaplicina y generar derivados
O-β-D-gentibiósidos (Orihara et al., 1991; Furuya et al., 1997). Sin
embargo, la reacción más difundida es la glicosidación de hidroxilos
fenólicos porque los vegetales la utilizan como un mecanismo efi-
ciente de detoxificación. Solo a modo de ejemplo se podrían men-

FIGURA 12. Biotransformación de geraniol y carvona con cultivos celulares de
C. roseus (obsérvese la actividad de enoato reductasa, adh y monooxigenasas
determinada por la funcionalización del sustrato)
CH 2 OH CH 2 OH O OH
C. roseus C. roseus
HO
CH 2 OH
Geraniol (-)-carvona
FIGURA 13. Formación de ésteres con azúcares y polialcoholes
OH OH
O HO O
HO O OH
HO HO
OH O
O COOH
O
OH
HO O Esterificaciones
HO O con raíces de OH
OH OH
O Panax ginseng OH
HO O O OH
HO OH OH
O O
cionar la preparación de los glucósidos, gentibiósidos y rhamnósidos

derivados del tocoferol con E. perriniana (Shimoda et al., 2007a) y
la glucosidación del fitorregulador ácido salicílico con Mallotus japo-
nicus (Umetani et al., 1990) y del metabolito bioactivo sesamol con
E. perriniana y N. tabacum (Shimoda et al., 2009). En el estudio de
la cinética de glicosidación de tres monoterpenos aromáticos –ti-
mol, carvacrol y eugenol– con el mismo biocatalizador se observa la
formación de los β-glucósidos sobre los hidroxilos fenólicos y pos-

FIGURA 14. Glicosidaciones de compuestos fenólicos con cultivos celulares de
Gardenia jasminoides (jazmín del cabo) y Cannabis sativa (marihuana)
OH OH OH OH
HO HO O HO O
G. jasminoides O O
HO HO
OH OH
HO
OH
HO HO O
G. jasminoides O
HO
HO O OH
O
HO O O
OH
O O OH
O OH HO O
HO HO
OH
C. sativus O OH
O OH
OH HO
HO O
HO OH
OH HO O
OH O O OH
HO O
HO
OH
O OH
HO
OH
teriormente los gentibiósidos, es decir los 6-O-(β-D-glucopiranosil)-

β-D-glucopiranósidos; estos glicósidos son de acumulación intracelular
(Shimoda et al., 2006a).
En un trabajo interesante se analiza la glucosidación de la esco-
poletina (6-metoxi-7-hidroxicumarina) con suspensiones celulares de
N. tabacum. Esta cumarina es una fitoalexina que se acumula en esta y
otras especies vegetales en respuesta a infecciones fúngicas o ataques
de insectos pero que produce muerte celular en vegetales por apopto-
sis. La escopoletina y otras hidroxicumarinas exógenas fueron conju-
gadas de manera eficiente por los cultivos celulares y se formaron sus
β-glucopiranósidos, que no causan fragmentación del ADN, en lo que
representa una clara reacción de detoxificación (Hirata et al., 2000).

Otra especie cuyos cultivos celulares han sido muy utilizados con el
propósito de glicosidar xenobióticos es C. roseus; con esa especie se ha
podido aumentar la hidrosolubilidad de un amplio rango de sustratos,
entre ellos alcaloides como la capsaisina (Shimoda et al., 2007b), al-
coholes y ácidos bencílicos (Shimoda et al., 2002, y vitaminas lipófilas
como tocoferoles y homólogos de la vitamina A (figura 15) (Shimoda
et al., 2006b). Un ejemplo diferente con esta especie consiste en la po-
sibilidad de formar monoglicósidos y diglicósidos sobre el sec-alcohol
1-feniletanol (Hirata et al., 2001).
RAÍCES TRANSFORMADAS EN BIOCATÁLISIS
Cultivos de raíces transformadas genéticamente (RT)
En los últimos años los cultivos in vitro de raíces transformadas han

despertado gran interés como sistemas modelo para estudios fisiológi-
cos y bioquímicos (Abdala et al., 2003) y también para la producción
de fitoquímicos (Shanks y Morgan, 1999; Guillon et al., 2006). Estos
cultivos se obtienen por transformación de explantos vegetales (hojas,
tallos, etc.) con Agrobacterium rhizogenes, un bacilo gramnegativo que
habita en el suelo y es capaz de integrar parte de su ADN plasmídico,
el denominado T-ADN, a las células vegetales. Las cepas virulentas de
A. rhizogenes infectan a la mayoría de las especies de plantas dicotiledó-
neas (aunque se admite que algunas plantas son más susceptibles que
otras) mientras que las especies monocotiledóneas son particularmente
resistentes a la infección. La enfermedad causada por este proceso infec-
cioso se denomina “raíces en cabellera” (hairy roots) porque produce un
crecimiento neoplásico de raíces adventicias en el sitio de la infección,
y confiere al material vegetal transformado un potencial rizogénico
permanente. Este fenotipo es generado por una transformación genética
análoga a la que se observa en el desarrollo de la enfermedad llamada
“agalla de corona”, que resulta de la infección por Agrobacterium tume-
fasciens. La integración al genoma vegetal de una parte del plásmido
Ri (inductor de raíces) de origen bacteriano, seguida de la expresión de
sus genes, da lugar a una transformación fenotípica caracterizada por
la aparición de raíces adventicias, las que pueden ser separadas de la
planta y establecerse asépticamente en cultivos como clones de raíces

FIGURA 15. Glicosidación de vitaminas liposolubles con cultivos celulares
vegetales
OH
HO O
HO O
C. roseus HO
OH
O n* O n*
n=1, 2 y 3 n=1, 2 y 3
OH
C. roseus HO O
HO O
P. americana HO
2 OH 2
que se regeneran con rapidez y transmiten el Ri T-ADN a su progenie

(Lipp João y Brow, 1994). Se trata de cultivos que se caracterizan por su
estabilidad genética y bioquímica, que muestran un crecimiento rápido
e ilimitado en medios sin agregado de hormonas (con una velocidad
de crecimiento superior a la de las raíces normales) y que tienen la
capacidad de generar abundante biomasa. También presentan un alto
grado de ramificación con dominancia apical menor, desarrollo plagio-
trópico y la capacidad de regenerar plantas completas y genéticamente
estables, en algunos casos de manera espontánea y en otros mediante
el agregado de reguladores del crecimiento (Giri y Lakshmi Narasu,
2001). Las RT son robustas y como se desarrollan muy bien en medios
de cultivo líquidos resultan aptas para ensayos de biotransformación y
biocatálisis (figura 16).
Biotransformaciones con cultivos de RT
En el campo de las biotransformaciones las raíces en cabellera han sido

utilizadas fundamentalmente para llevar a cabo reacciones de glicosida-
ción. Se han usado RT de Coleus forskohlii en reacciones de glicosidación
de alcoholes de bajo peso molecular como metanol, etanol e isopropa-
nol de manera de obtener los correspondientes β-D-glucopiranósidos
y β-D-ribohex-3-ulopiranósidos, estos últimos por la acción de una
glucopiránosido-3-oxidasa posterior a la conjugación (Li et al., 2003).
También se han empleado RT de Pharbitis nil en la glicosidación de
derivados de cumarinas y flavonas (Kahno et al., 2004; Yaoya et al.,

FIGURA 16. Obtención de clones de RT por infección de explantos vegetales con
A. rhizogenes
Infección con
A. rhizogenes
Plántula Clon de RT
2004), en la reducción de derivados de benzaldehído y acetofenona

a sus correspondientes alcoholes y en la glicosidación de compuestos
fenólicos con comprobación de la acumulación intratisular de los gli-
cósidos y la excreción del producto de reducción al medio de cultivo
(figura 17) (Kahno et al., 2005).
Las RT de Panax ginseng se utilizaron en la bioconversión del tri-
terpeno ácido 18-β-glicirretínico (Asada et al., 1993), caso en el que se
observaron tanto glicosidaciones como formaciones de ésteres; estas RT
también conjugaron el cardenólido digitoxigenina no solo mediante la
formación de glicósidos sino también con formación de ésteres de áci-
dos grasos (Kawaguchi et al., 1990); asimismo, con ellas se realizaron
biotransformaciones sobre compuestos mucho más sencillos, como los
derivados del ácido hidroxibenzoico (Chen et al., 2008).
La preparación de β-O-glucósidos bioactivos como la arbutina y la
gastrodina a partir de derivados sencillos 4-hidroxibencénicos fue es-
tudiada por diversos autores con cultivos de RT de P. ginseng (Cai et
al., 2005), Poligonum multiflorum (Yan et al., 2007) y Brugmansia can-
dida (Casas et al., 1998). Por otra parte, un esteroide de origen animal,
la dehidroepiandrosterona, ha sido reducido, oxidado e hidroxilado por
cultivos de RT de Anisodus tanguticus (figura 18) (Liu et al., 2004).
Potencialidad de los clones de RT como biocatalizadores
Como se ha explicado en los apartados anteriores D. carota, una de las

especies vegetales más estudiadas para la reducción de cetonas, genera
los correspondientes alcoholes quirales con ee y tasas de conversión

FIGURA 17. Biotransformación de vainillina y acumulación intratisular de
glucósidos en RT de Pharbitis nil (adaptada de Kahno et al., 2005)
Medio de cultivo
MeO CHO MeO CHO

Me O CHO
HO Glc-O
HO
Vainillina
MeO CH2OH
Me O CH2OH MeO CH2OH Glc-O
HO HO MeO CH2O-Glc
Alcohol vainillínico
HO
RT de Pharbitis nil
FIGURA 18. Biotransformación de dehidroepiandrosterona con cultivos de RT

de A. tanguticus
OH
OH
O
O
17β-hidroxiandrost-4-ene-3-ona OH
18 O O 6a,17β-dihidroxiandrost-4-ene-3-ona
19 Anisodus
tanguticus RT
O
HO
Androst-4-ene-3,17-diona O
Dehidroepiandrosterona C-19 O
O
O
O Androst-4-ene-3,6,17-triona
OH
6α-hidroxiandrost-4-ene-3,17-diona

FIGURA 19. Biorreducción regioselectiva y enantioselectiva con raíces transformadas
de B. napus (nabo)
O O OH O
RT de B. Napus
O O
c: 78%
ee: 99% (S)
excelentes. Los cultivos de RT de zanahoria se han empleado como bio-

catalizadores para la reducción estereoselectiva de una serie de cetonas
proquirales y β-cetoésteres, reacción con la que se obtuvieron en mayor
medida productos “Prelog”, tal como ocurre con las raíces de zanahoria
sin transformar (Caron et al., 2005). De manera análoga, con RT de
nabo (Brassica napus) se logró la reducción de dicetonas proquirales de
origen natural en una reacción con muy buen rendimiento y un alto
grado de regioselectividad y estereoselectividad en la que el hidruro fue
transferido con absoluta discriminación sobre la cara re de la metilcetona
(figura 19) (Orden et al., 2006). Este mismo sistema también fue capaz
de glicosidar derivados fenólicos que liberó, al menos parcialmente, en
el medio de cultivo.
Recientemente se utilizaron RT de rabanito (R. sativus) para redu-
cir una serie de alquilarilcetonas proquirales de manera anti-Prelog; en
este trabajo la mayoría de las reacciones prosiguieron con altos rendi-
mientos y con excelentes estereoselectividades hacia los alcoholes de
configuración R (Orden, A. et al., 2009).
A pesar de los avances logrados en el estudio de los sistemas de
RT y de su aplicación en ciertos campos de la biotecnología, como la
biorremediación y la producción de metabolitos secundarios de alto
valor agregado, el uso de estos sistemas como agentes biocatalíticos
en reacciones diferentes de las glicosidaciones no ha sido abordado
en forma exhaustiva, aun cuando se trata de sistemas experimentales
convenientes para utilizar las enzimas vegetales en biotransformacio-
nes xenobióticas.

CONSIDERACIONES FINALES
Los sistemas de biocatalizadores vegetales a célula entera, como los

ejemplos presentados aquí, poseen una gran potencialidad para llevar a
cabo reacciones quimioselectivas, regioselectivas y estereoselectivas sobre
sustratos naturales y xenobióticos de muy diversa naturaleza química.
La originalidad de las rutas biosintéticas secundarias de los vegetales y
la promiscuidad de algunas de sus enzimas ofrecen alternativas únicas
que difícilmente se encuentren en otros organismos. Entre las reacciones
más preciadas que pueden catalizar estos sistemas se encuentran las
oxifuncionalizaciones, sea a través de monohidroxilaciones estereoes-
pecíficas o de epoxidaciones estereocontroladas con posterior apertura
de los oxiranos generados, las glicosidaciones de hidroxilos primarios,
secundarios y fenólicos y la formación de ésteres de azúcares. Asimismo,
se han aplicado con éxito en reducciones estereoselectivas de cetonas
proquirales y enlaces C=C activados por carbonilos.
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CAPÍTULO 3
Biocatálisis en medios
no convencionales
Adolfo M. Iribarren
INTRODUCCIÓN
Si bien el agua es el solvente seleccionado por la naturaleza y en él se

desarrollan las reacciones que hacen posible la vida, no es el solvente
ideal para llevar a cabo la mayoría de las reacciones involucradas en
síntesis orgánica. Esto se debe a dos motivos principales: la baja solu-
bilidad de los compuestos orgánicos en medios acuosos y la alta reac-
tividad del agua como nucleófilo. Esta reactividad se ve incrementada
por la alta concentración en la que se encuentra (55 M), lo que genera
una importante competencia entre las reacciones de hidrólisis y las de
síntesis.
El agua también puede reaccionar con las enzimas y producir su
inactivación mediante hidrólisis de uniones peptídicas y desaminación
de cadenas laterales. Si bien en medios acuosos la flexibilidad de las
enzimas aumenta y por consiguiente en algunos casos la actividad ca-
talítica mejora, también puede facilitarse su inactivación; por ende, es
posible que las enzimas presenten una estabilidad mayor en medios no
acuosos. Además, como esa flexibilidad produce cambios conforma-
cionales, el uso de medios no acuosos puede afectar las selectividades
de las enzimas.
Por último, desde el punto de vista preparativo es difícil remover
el agua de medios de reacción. Por estos y otros motivos el estudio de
reacciones enzimáticas en medios no acuosos es de suma utilidad y ya
ha sido abordado hace tiempo.
| 77
La rama más analizada involucra el uso de solventes orgánicos pero
esa temática no será abordada en este capítulo porque se la trata en
forma inclusiva a lo largo de todo el libro.
Aquí nos concentraremos en la realización de una breve reseña de
los fundamentos y las aplicaciones de otros medios no convencionales
como los líquidos iónicos, los solventes con eutécticos profundos y los
solventes supercríticos.
LÍQUIDOS IÓNICOS
Generalidades
Los líquidos iónicos han surgido como un medio de reacción en bioca-

tálisis porque tienen características muy particulares. Son sales orgánicas
con puntos de fusión menores que la temperatura ambiente, es decir
que a diferencia de los solventes tradicionales, que son líquidos mo-
leculares, estos líquidos están compuestos por iones. Por consiguiente,
tienen propiedades únicas que los convierten en alternativas atractivas
de los solventes orgánicos, no son volátiles ni inflamables, presentan una
muy buena estabilidad térmica y química y pueden ser sintetizados “a
medida”, sobre todo por la posibilidad de combinar cationes y aniones
distintos.
No obstante, también tienen limitaciones, como por ejemplo su alto
costo, la carencia de estudios suficientes como para permitir generali-
zaciones, la disponibilidad de pocos datos toxicológicos y la necesidad
de estudios sistemáticos de reciclado y recuperación de los correspon-
dientes productos de reacción.
En la figura 1 se muestran los iones más representativos cuya com-
binación genera diferentes líquidos iónicos.
Los líquidos iónicos en general tienen una polaridad muy alta. Esta
propiedad, que se vincula con la capacidad de solvatar cargas, no debe
confundirse con hidrofilicidad. En una escala de polaridades en la que
el tetrametilsilano es 0 y al agua se le asigna un valor de 1, los líquidos
iónicos se encuentran en un rango intermedio-alto (de más de 0,5) que
se parece al de la formamida y los alcoholes de bajo peso molecular. Por
consiguiente, son medios muy apropiados para llevar a cabo distintos
tipos de reacciones porque disuelven moléculas muy diferentes como
78 | ADOLFO M. IRIBARREN
FIGURA 1. Cationes y aniones más utilizados en líquidos iónicos
R2
R1 R1
R CH3
N N
R4 N R2 R4 P R2
N R3 R3
1-alquil-3-metil R1
imidazolio 1,4-Dialquilpiridinio Tetraalquilamonio Tetraalquilfosfonio
BF4 PF6 CF 3 SO 3
Tetrafluorborato Hexafluorofosfato Triflato
(CF3 SO 2 )NH CF 3 CO 2
Bistriflicimida Trifluoroacetato
compuestos inorgánicos, orgánicos y polímeros y llenan el gap de pola-

ridades entre agua y solventes orgánicos con log P mayores que 2.
En el cuadro 1 se menciona una serie de líquidos iónicos con sus
correspondientes nombres y abreviaturas y sus polaridades relativas.
Estos solventes tienen viscosidades mucho mayores que las de los
solventes orgánicos, por ejemplo, el [BMIM] [BF4] tiene una visco-
sidad parecida a la del etilenglicol, lo que hace más difícil su manejo.
Para minimizar este problema es recomendable reducir la superficie de
contacto, lo que puede conseguirse utilizando aniones menos volumi-
nosos y cationes con cadenas alquílicas más cortas. Como alternativa
pueden agregarse solventes orgánicos.
Diversos estudios han probado que los aniones altamente cosmotrópi-
cos estabilizan las proteínas mientras que los cationes con iguales carac-
terísticas las desestabilizan; por consiguiente, en biocatálisis es deseable
utilizar líquidos iónicos compuestos por cationes caotrópicos y aniones
cosmotrópicos. En la figura 2 se puede observar una lista de cationes y
aniones con sus relativas propiedades como estabilizantes de proteínas.
Sin embargo, esta generalización depende de varios factores, como por
ejemplo de la presencia o la ausencia de agua y de las características es-
tructurales de las proteínas correspondientes (Zhao, 2005).
BIOCATÁLISIS EN MEDIOS NO CONVENCIONALES | 79

CUADRO 1. Nomenclatura, abreviatura y polaridad de los líquidos iónicos más
utilizados y comparación con solventes tradicionales
Nombre Abreviatura Polaridad
Tiocianato de diisopropilamonio [Pr2NH2][SCN] 1,006
Agua 1,000
Nitrato de propilamonio [PrNH3][NO3] 0,923
Tetrafluorborato de 1-butil-3-metilimidazolio [BMIM][BF4] 0,673
Hexafluorfosfato de 1-butil-3-metilimidazolio [BMIM][BP6] 0,663
Etanol 0,654
Bis (triflic) imida 1-butil-3-metilimidazolio [BMIM][Tf2N] 0,642
Hexafluorfosfato de 1-octil-3-metilimidazolio [OMIM][BP6] 0,633
Bis (triflic) imida 1-octil-3-metilimidazolio [OMIM][ Tf2N] 0,630
Trifluoroacetato de 1-butil-3-metilimidazolio [BMIM][TFA] 0,620
Tetrafluorborato de 1-oximetil-3-metilimidazolio [OMMIM][BF4] 0,543
Bis (triflic) imida de 1-oximetil-3-metilimidazolio [OMMIM][Tf2N] 0,525
Nitrato de tetraetilamonio [Et4N][NO3] 0,460
Acetonitrilo 0,460
Cloruro de tetraetilamonio [Et4N][Cl] 0,454
Dietiléter 0,116
FIGURA 2. Capacidad relativa como estabilizantes de proteínas
Estabilizante Desestabilizante
F -> PO 43->SO 42->CH 3COO ->Cl ->Br ->I ->SCN -

Aniones
Me 4N +>Me 2NH 2+>NH 4+>K +>Na +> Li +> Mg 2+> Ca 2+

Cationes
CUADRO 2. Miscibilidad en agua de algunos líquidos iónicos
Catión Anión Miscibilidad en agua
EMIM BF4 Sí
TfO Sí
Tf2N No
BMIM BF4 Sí
PF6 No
Tf2N No
TfO Sí
HexMIM BF4 Parcial
OMIM BF4 Parcial
PF6 No
ButMe3N Tf2N No
BMPL pirrolidinio Tf2N Parcial
Muchos de los ejemplos disponibles en la bibliografía sobre reaccio-

nes biocatalizadas en líquidos iónicos, y sobre todo con células enteras
como biocatalizadores, se refieren a reacciones llevadas a cabo con sis-
temas bifásicos. En el cuadro 2 se presenta una lista de líquidos iónicos
y se indica si son solubles en agua o no.
Aunque la hidrosolubilidad de los líquidos iónicos depende en cier-
to grado de la lipofilicidad del catión, como se comprueba al analizar
la miscibilidad de los que contienen [BF4], es más determinante la es-
tructura del anión y en general puede afirmarse, por ejemplo, que los
derivados de [Tf2N] y [PF6] tienden a ser inmiscibles en agua.
Líquidos iónicos en biocatálisis
Antes de comenzar con las aplicaciones de los líquidos iónicos en bio-

catálisis quizá sea útil formular algunas consideraciones generales:

• Para mantener la actividad enzimática debe haber una mínima
cantidad de agua presente (actividad acuosa); si el agua es secuestra-
da por el líquido iónico la enzima puede inactivarse. La mayor parte
de estos líquidos son muy higroscópicos, lo que puede producir varia-
ciones en la actividad del agua y por consiguiente en la actividad en-
zimática.
• Cuando las reacciones enzimáticas se realizan en buffers acuosos
la adición de cantidades crecientes de líquidos iónicos a veces produce
precipitados de composición desconocida.
• Las impurezas o los propios iones del líquido iónico pueden actuar
como inhibidores reversibles o irreversibles de la enzima.
• Para estudios cinéticos y para mediciones de actividad habitual-
mente se usan ensayos fotométricos o hplc. Los líquidos iónicos o sus
impurezas pueden interferir en el método analítico.
• Muchas veces los líquidos iónicos se preparan en el laboratorio, lo
que justifica los diferentes resultados informados en algunos casos.
• Las enzimas no son solubles en la mayoría de los líquidos iónicos
y por consiguiente deben ser usadas en suspensión o inmovilizadas.
• En general, las enzimas activas en solventes orgánicos van a fun-
cionar con los líquidos iónicos.
Un parámetro que es indispensable analizar cuando se estudian medios

no convencionales para ser aplicados en biocatálisis es su influencia
sobre la estabilidad de la enzima.
Ya hemos mencionado la influencia de los iones sobre la estabili-
dad de las proteínas. En cuanto a los líquidos iónicos más utilizados en
biocatálisis, puede decirse que los que contienen [BF4], [PF6] y [Tf2N]
son los más adecuados mientras que los que poseen aniones como Cl-,
NO3- y CF3SO3- muchas veces producen la inactivación de los bioca-
talizadores (Kaar et al., 2003). Estos datos sugieren que los aniones con
una menor basicidad de puente de hidrógeno son más compatibles con
las enzimas porque minimizan la interferencia sobre sus puentes de hi-
drógeno intramoleculares. Respecto de los cationes, la mayoría de las
enzimas informadas en líquidos iónicos presentan buenas actividades
con cationes como metilimidazolios y piridonios. Por ejemplo, se han
llevado a cabo esterificaciones que demostraron que cal-b es diez ve-
ces más activa en [BMP][BF4] y [BMIM][Tf2N] que en diisopropiléter
(Van Rantwijk et al., 2003).
Es difícil generalizar y la estabilidad no siempre se condice con la
actividad; algunas enzimas, como la α-quimotripsina, la cal-b y la es-
terasa de Bacillus stearothermophilus, son más estables en algunos líqui-
dos iónicos que en solventes orgánicos, aunque no necesariamente más
activas; el motivo se desconoce pero se supone que puede estar relacio-
nado con interacciones coulómbicas.
Cabe resaltar que los solventes orgánicos y los líquidos iónicos de
polaridades semejantes pueden comportarse como medios muy distin-
tos. Por ejemplo, un estudio realizado con la lipasa de Pseudomonas ce-
pacia (pcl) demostró que esta se inactiva en solventes como metanol o
dimetilformamida mientras que mantiene su actividad en líquidos ióni-
cos con polaridades parecidas como [RMIM][BF4] y [PF6] (Seongsoon
y Kazlauskas, 2003).
Aplicaciones de líquidos iónicos en biocatálisis
Enzimas como biocatalizadores
El primer estudio que utilizó un líquido iónico y una enzima se realizó

con la fosfatasa alcalina de E. coli en mezclas de nitrato de etilamo-
nio con agua y demostró un efecto activante que podía llegar hasta el
10% (Magnuson et al., 1984). Sin embargo, el primer ejemplo exitoso
de biotransformación en un líquido iónico corresponde a un trabajo
en el que se utilizó termolisina para la síntesis de z-aspartamo en un
líquido iónico hidrófobo [BMIM][PF 6], saturado en buffer.
La mayoría de los datos disponibles provienen del uso de lipasas, lo
que no es sorprendente dada su tolerancia a los solventes orgánicos.
En la transesterificación catalizada por cal-b del butanoato de eti-
lo con butanol se observaron actividades semejantes cuando se usaron
como solventes [BMP][BF4], [BMIM][Tf2N], t-butilalcohol, dioxano
y tolueno (Nara, 2002).
Es posible que uno de los usos más extensos de las lipasas sea en la
resolución de alcoholes quirales mediante su acilación enantioselectiva.
La influencia de los líquidos iónicos en estas reacciones fue estudiada
principalmente usando cal-b, pcl y vinilacetato como dador de acilo.
Se encontró, por ejemplo, que el (R)-1-feniletanol podía ser resuelto casi
cuantitativamente utilizando pcl y [BMIM][TfO] o [BMIM][Tf2N]
mientras que la misma reacción producía relaciones enantioméricas mo-

destas si se utilizaba tbme como solvente (Schöfer et al., 2001). Tam-
bién se estudiaron reacciones de hidrólisis enantioselectivas de ésteres
de N-acilaminoácidos en los correspondientes (S)-N-acilaminoácidos
con subtilisina. En estos casos era necesario agregar solventes orgánicos
para mejorar la solubilidad y la reacción resultaba más enantioselectiva
cuando se usaba [Epy] [TFA] agua 15:85 en lugar de acetonitrilo-agua
15:85 (Zhao y Malhotra, 2002).
En otro ejemplo que demuestra la potencialidad y la impredecibili-
dad del comportamiento de los líquidos iónicos se describe cómo en la
síntesis de N-acetillactosamina catalizada por β-galactosidasa el agre-
gado de 25% de [MMIM][MeSO4] suprime la hidrólisis del producto
y aumenta el rendimiento del 30% en buffer al 60% en buffer-líquido
iónico (Kaftzik et al., 2002).
Un estudio que ejemplifica la posibilidad de diseñar líquidos iónicos
con propósitos particulares es el que seleccionó el metoxi-tributilfosfo-
nio [Tf2N] como muy útil en transesterificaciones catalizadas por lipasas
porque permite obtener velocidades superiores a las informadas con sol-
ventes orgánicos y la reutilización del biocatalizador (Abe et al., 2008).
El diseño de los líquidos iónicos puede ser de utilidad no solo para
modular polaridades y otras propiedades sino también para casos en los
que se conozca la influencia de ciertos iones sobre la enzima. Por ejem-
plo, se diseñó en forma racional un líquido iónico, el tetrakis (2-hidroxie-
til)amonio [Tfms] para la peroxidasa del rábano (hrp), sobre la base de
la estabilidad y la actividad de la peroxidasa en diferentes líquidos ióni-
cos que contenían un excipiente, el tris(hidroximetil)aminoetano. En ese
medio la hrp presenta un aumento de actividad de entre 30 y 240 veces
respecto de los líquidos iónicos convencionales (Das et al., 2007).
Células enteras como biocatalizadores
Los líquidos iónicos también se han probado en sistemas que utilizan

células enteras como biocatalizadores. En general, cuando se obtienen
buenos resultados estos pueden ser atribuidos a la mejor biocompatibili-
dad de algunos líquidos iónicos comparados con los solventes orgánicos
tradicionales, a los adecuados coeficientes de distribución de sustratos y
productos reducen el acumulamiento de productos dentro de la célula, y a
la presencia de interacciones iónicas favorables con los grupos cargados
que se encuentran en las membranas celulares.
Respecto de la biocompatibilidad, se llevaron a cabo estudios com-
parativos de viabilidad celular en los que se utilizaron E. coli y una
concentración de 20% (v/v) de distintos solventes. Se demostró que
la mayoría de los solventes orgánicos dañaban la integridad de la
membrana, con excepción del decano, mientras que los líquidos ióni-
cos insolubles en agua ensayados –[BMIM][PF 6], [BMIM][Tf2N] y
[OMA] (metil-trioctilamonio) [Tf2N]– eran biocompatibles, y podían
ser usados como reservorios de sustratos y como agentes extractivos de
productos. La eficiencia de estos procesos se puede ejemplificar con la
reducción asimétrica de 4-cloroacetofenona con L. kef ir, que genera
(R)-1-(clorofenil)etanol con un rendimiento del 50% en el sistema
acuoso, mientras que en el sistema bifásico aumenta al 80-90%, lo que
indica que a pesar de la mayor viscosidad de los líquidos iónicos la
transferencia de masa es buena (Pfruender et al., 2006).
Las consideraciones mencionadas en la figura 3 fueron propuestas
para identificar líquidos iónicos adecuados para biotransformaciones
bifásicas con células enteras y sentar las bases de un sistema de scree-
ning útil en procesos industriales (Pfruender et al., 2006).
FIGURA 3. Criterios por considerar para la elección de líquidos iónicos en

reacciones biocatalizadas por células enteras
LI* inmiscibles en agua
Precondición para Precondiciones para la

uso en biocatálisis ingeniería de reacción
Precondiciones para la Coeficiente de distribución, viscosidad, aislamiento

ingeniería de reacción de productos y reuso
Precondiciones para
Disponibilidad, costo, datos toxicológicos, estabilidad, corrosividad
uso industrial
Desarrollo del proceso
LI*= Lis.

También se llevó a cabo la reducción asimétrica de diversas cetonas
proquirales mediante el empleo de E. coli recombinante con regenera-
ción intracelular del cofactor y sistemas bifásicos agua/líquidos ióni-
cos. Se observó que tanto [HMIM][PF6] y [NTf2] como [BMPL] y
[HMPL][NTf2] mejoraban la eficiencia de la bioconversión en forma
similar a [BMIM][PF6] y [NTf2]. Además se demostró que los líqui-
dos iónicos no interferían sobre la regeneración intracelular del nadh
por lo que el rendimiento y la enantioselectividad del proceso mejora-
ban respecto del sistema acuoso (Bräutigam et al., 2007).
SOLVENTES DE EUTÉCTICO PROFUNDO
Una alternativa interesante de los líquidos iónicos surgió con la aplica-

ción en biocatálisis de los solventes de eutécticos profundos (des, del
inglés Deep Eutectic Solvent).
En un trabajo fundacional sobre esta temática se utilizaron distin-
tas proteasas y mezclas eutécticas de derivados de aminoácidos, con
adyuvantes y sin ellos, para sintetizar diferentes oligopéptidos (Gill y
Vulfson, 1994).
Estas mezclas eutécticas, además de tener bajas presiones de vapor
y baja inflamabilidad, pueden estar formadas por compuestos no tóxi-
cos y económicos como cloruro de colina/urea u otras sales de amonio
y dadores de puentes de hidrógeno con diversas estructuras. La carac-
terización de estos solventes y su capacidad para disolver distintos sus-
tratos es un tema en constante estudio (Morrison et al., 2009).
Aunque la mezcla de urea con haluros de amonio no parece ser útil
en biocatálisis, se halló que las lipasas eran activas en estos medios. Por
ejemplo, el proceso de transesterificación y aminólisis catalizado por cal
b en mezclas de cloruro de colina/urea 1:2 y cloruro de colina/glicerol
1:2 se desarrolló con actividades similares a las obtenidas en tolueno
(Gorke et al., 2008). Se comprobó que el glicerol de la mezcla eutéc-
tica era 200 veces menos reactivo en la transesterificación que el gli-
cerol libre y que la lipasa era 20 veces más estable en una solución de
la mezcla colina/urea que en iguales concentraciones de esas especies
por separado. Estos hechos experimentales sugerirían la formación de
estructuras de puentes de hidrógeno muy fuertes y estables entre los
componentes de estas mezclas eutécticas.
Además, el agregado de esas mezclas en medios acuosos también
aumentó tres veces la actividad de la hidrólisis catalizada por las este-
rasas de hígado de cerdo (ple, pig liver esterase) y de Rhizopus oryzae.
Se observó un efecto aún mayor, consistente en un aumento de 20 ve-
ces en la conversión de óxido de estireno en estireno mediada por una
epóxido hidrolasa de Agrobacterium radiobacter, causado por la adición
de 25% de la mezcla colina/glicerol al medio de reacción.
La condición para que se formen estos sistemas de bajo punto de
fusión es la presencia de un dador de puentes de hidrógeno y un acep-
tor como el ion cloruro en una relación molar dada. Como dadores de
puentes de hidrógeno pueden utilizarse distintos compuestos, como al-
coholes, azúcares, amidas y diversos tipos de estructuras, muchas de ellas
productos naturales renovables, lo que hace de estos medios un vasto
campo de investigación en el marco de las tecnologías verdes.
FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
Finalmente, otros medios no convencionales que se han venido utili-

zando en los últimos años en biocatálisis son los fluidos supercríticos
(fsc). Estos medios están constituidos por materiales que se encuentran
por encima de su temperatura crítica (Tc) y de su presión crítica (Pc).
La Tc de un compuesto es la temperatura por encima de la cual no
existen fases líquida y gaseosa diferenciables. Cuando se alcanza la Tc
las propiedades de las fases líquida y gaseosa son iguales y resultan en
una única fase: el fluido supercrítico. Por consiguiente, las propiedades
de estos fluidos se encuentran entre las propiedades de los líquidos y
las de los gases (cuadro 3).
CUADRO 3. Propiedades del CO2 scf comparadas con las de la fase líquida y
gaseosa
Propiedades Gas scf Líquido

3
Densidad (kg/m ) 1 100-800 1000
Viscosidad (cP) 0,01 0,05-1 0,5-1
Difusividad (m2/s) 1. 10-5 1. 10-7 1. 10-9

Aunque se han evaluado otros fsc, el más estudiado y del que existen
más datos en biocatálisis es el dióxido de carbono (CO2SC). La utilización
de este compuesto como fsc presenta ciertas ventajas de índole general:
• Reduce la cantidad de residuos orgánicos.

• La separación de productos es relativamente simple.
• El CO2SC es considerado gras.
• No presenta limitaciones de transporte de masas.
• Es relativamente barato como materia prima.
• Sus propiedades son ajustables con variaciones de la presión.
Su principal desventaja es el alto costo del instrumental necesario para

la presurización (figura 4). Como desventaja secundaria se ha informado
también la potencial formación de ácido carbónico y de carbamatos con
grupos amino de las cadenas laterales presentes en las enzimas.
En uno de los primeros trabajos que informaron acerca de la in-
fluencia de la presión en reacciones biocatalizadas con fsc se observó
un cambio continuo en la enantioselectividad de la esterificación cata-
lizada por lipasas de 1-(p-clorofenil)-2,2,2-trifluoroetanol en CO2SC.
Se comprobó que la enantioselectividad era mayor en condiciones de
presión y temperatura bajas (Matsuda et al., 2003a). Esta característica
de los fsc de producir variaciones en la enantioselectividad sin cambiar
la estructura molecular del solvente los diferencia de los otros medios
disponibles hasta el momento.
Se han publicado numerosos trabajos en los que se llevaron a cabo
reacciones biocatalizadas mediante distintos sistemas enzimáticos y
CO2SC, como lipasas, cutinasa, subtilisina y β-d-galactosidasa (Can-
tone et al., 2007).
En un estudio más reciente se analizó la acilación regioselectiva con
acetato de vinilo de metil 6-O-tritil β-d-glucopiranósido catalizada por
la lipasa de Candida rugosa (crl) en CO2SC. Manteniendo la tempera-
tura constante y modificando la presión del CO2 hasta 20 MPa durante
el proceso se obtuvo un único regioisómero, el derivado 3-O-acetilado,
con rendimientos de hasta el 91% (Palocci et al., 2008).
También se llevaron a cabo reacciones con células enteras en pre-
sencia de CO2SC.
Se usaron células quiescentes de Geotrichum candidum inmoviliza-
das para la reducción de cetonas en un proceso de flujo continuo en el
FIGURA 4. Esquema del equipo para reacciones con solventes supercríticos
Enfriador
Reciclador
Bombas Separador
Reactor
Productos
CO2 Sustratos
que se utilizó CO2SC. Se aplicó el mismo sistema a la reducción asi-

métrica de cetonas proquirales y se obtuvieron una estereoselectividad
excelente (ee > 99%) y un rendimiento espacio-tiempo superior al co-
rrespondiente al proceso en batch (Matsuda et al., 2003b).
Se emplearon células de Bacillus megaterium en la reacción de fija-
ción de CO2 catalizada por una descarboxilasa y, como cabía esperar,
los rendimientos obtenidos en condiciones supercríticas fueron supe-
riores a los obtenidos en condiciones de presión atmosférica (Matsuda
et al., 2001). Posteriormente, se aisló la enzima y se llevó a cabo la car-
boxilación del pirrol en un proceso de flujo continuo en CO2SC con
un rendimiento espacio-tiempo 25 veces mayor que el observado en la
reacción en batch (Matsuda et al., 2008).
Si bien el CO2SC es el fsc más utilizado hasta el momento, exis-
ten otros que permiten extender las posibilidades de estas estrategias
(cuadro 4). Entre los que han sido probados en biocatálisis pueden
mencionarse CH4, C2H6, C2H4, C3H8, CHF3 y SF6 (Kumar Karmee
et al., 2008).
En un trabajo se analizó la producción continua de ésteres etílicos de
ácidos grasos provenientes de la soja mediante el empleo de fsc como
CO2, propano y butano y Novozym 435 como biocatalizador. Los re-
sultados indicaron que la alcohólisis catalizada por cal b en propano
sc es una vía potencial para la obtención a escala de biodiesel, con al-
tas conversiones en condiciones suaves de reacción (70 ºC y 60 bar)
(Dalla Rosa et al., 2009).

CUADRO 4. Constantes críticas de fsc usados en biocatálisis
fsc Tc/K Pc/MPa
Butano 425.1 3,7960
co2 304,1 7,3773
Etano 305,3 4,8728
Etileno 282,3 5,0418
Fluoroformo 299,3 4,8320
Propano 369,8 4,2477
SF6 318,7 3,7545
Fluidos supercríticos combinados con líquidos iónicos
El uso combinado de solventes polares como los líquidos iónicos y de

no polares y volátiles como el CO2SC ha creado un nuevo sistema que
es único por sus propiedades (Keskin et al., 2007).
Se ha determinado que el CO2 es muy soluble en la mayoría de los
líquidos iónicos y que esos líquidos son prácticamente insolubles en
CO2SC. Dado que la mayoría de los compuestos orgánicos son solu-
bles en CO2SC, estos productos son transportados del líquido iónico
a la fase del fsc. Como se puede extraer una gran variedad de solutos
del líquido iónico mediante CO2SC con recuperaciones superiores al
95% (Blanchard y Brennecke, 2001), el uso combinado de estos dos
medios no convencionales aporta una solución al aislamiento de pro-
ductos de líquidos iónicos.
Por ejemplo, con la cal b disuelta en líquidos iónicos se obtuvo un
buen grado de actividad sintética, enantioselectividad y estabilidad ope-
racional en CO2SC tanto para la síntesis de butirato de butilo como
para la resolución cinética de 1-feniletanol (Lozano et al., 2002).
Otra ventaja es que el CO2SC reduce la temperatura de fusión del
líquido iónico, lo que permite utilizarlo a temperaturas aun más bajas.
Por ejemplo, se estudió el efecto de la presión sobre este descenso y se
determinó que a 70 bar el CO2 reduce el punto de fusión del 1-hexa-
decil-3-imidazoil [PF6] de 75 a 50 oC (Kazarian et al., 2002).
CONCLUSIONES
El uso de medios no convencionales en biocatálisis es relativamente

nuevo, pero además de ser motivo de numerosos estudios académicos
ya ha generado diversas aplicaciones.
En particular, los líquidos iónicos presentan características que los
hacen únicos y es posible que las más destacables sean su polaridad y
su potencialidad como solventes diseñados según necesidad. Si bien en
la actualidad la mayoría de los líquidos iónicos son relativamente ca-
ros y difíciles de obtener con la pureza adecuada, cabe esperar que en
el futuro cercano esto se revierta.
En cuanto a los solventes supercríticos, son medios extensamente
estudiados pese a que su aplicación en biocatálisis es más reciente.
Sus características intermedias entre líquidos y gases, su fácil eli-
minación del medio de reacción y la variación de sus propiedades
en función de la presión los tornan muy interesantes para su utili-
zación en sistemas enzimáticos. Su principal desventaja a nivel del
laboratorio es el equipamiento necesario para presurizar el sistema
de reacción.
La cantidad siempre creciente de trabajos que incluyen estas estra-
tegias permite suponer que en breve estos medios no convencionales
serán utilizados más ampliamente y abrirán nuevos caminos en los pro-
cesos biotecnológicos.
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CAPÍTULO 4
Aplicaciones de la biología
molecular en biocatálisis.
Técnicas de clonación,
sobreexpresión y evolución
dirigida
Paola Panizza y Sonia Rodríguez
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos han sido y siguen siendo la mayor fuente de

biocatalizadores, tanto en su forma de célula entera como en la forma
de enzimas aisladas de ellos. Tradicionalmente, la obtención de nuevos
biocatalizadores se ha basado en la búsqueda de microorganismos con
ciertas capacidades metabólicas. El mayor inconveniente asociado con esta
estrategia consiste en que muchas veces el producto de interés termina
siendo degradado, puesto que el microorganismo lo utiliza como fuente
de carbono y energía. Se ha observado que compuestos similares al
sustrato natural resultan parcialmente metabolizados y así dan lugar a
productos de interés. Los trabajos pioneros de Gibson y colaboradores
sobre la cepa de Pseudomonas putida que expresa la tolueno dioxigenasa
(tdo) constituyen un claro ejemplo de lo dicho. La cepa nativa metabo-
liza el tolueno a dióxido de carbono pero no análogos del sustrato como
cloro o bromo-benceno (Gibson et al., 1968), a partir de los cuales se
constató la acumulación de intermediarios y pudo dilucidarse la vía de
degradación. La generación de mutantes de la cepa nativa incapaces
| 95
de crecer en tolueno como única fuente de carbono y energía y con
capacidad de acumular alguno de los intermediarios llevó a la obtención
de la cepa de Pseudomonas putida 39D usada ampliamente en biocatálisis
para la producción de cis-dioles a partir de sustratos aromáticos (Gibson
et al., 1970; 1974).
Así fue como se llegó a los primeros microorganismos genéticamen-
te modificados de aplicación en biocatálisis. No obstante, la modifica-
ción no se conocía sino que se generaba al azar y no se caracterizaba.
El progreso en las áreas de biología molecular y de tecnologías del
ADN recombinante permitió avanzar hacia el desarrollo de mutantes
por mutagénesis dirigida, anulación de vías alternativas y sobreproduc-
ción de enzimas de interés. En este sentido, constituyen hitos relevan-
tes la expresión de la tdo de Pseudomonas en E. coli (Zylstra y Gibson,
1989) y la expresión posterior de la Bayer-Villiger monooxygenasa de
Acinetobacter sp. ncib 9871 en S. cerevisiae (Stewart et al., 1998). Ade-
más, la combinación de la deleción de enzimas que compiten por el
sustrato con la sobreexpresión de la enzima de interés resultó ser una
herramienta interesante en la construcción de cepas con alto grado de
estereoselectividad (Rodríguez et al., 2001).
En la última década, las herramientas de la biología molecular han
sido cada vez más útiles para el descubrimiento y el desarrollo de
nuevos biocatalizadores y también para viabilizar su uso (Steele et al.,
2009; Demain y Vaishnav, 2009; Stewart, 2006; Bornscheuer, 2005;
Kayser, 2009). El requerimiento de nuevas capacidades biocatalíticas
que amplíen el rango de sustratos, la estereoselectividad o la regioquí-
mica de determinada reacción y además la estabilidad o la tolerancia
a los solventes ha potenciado el trabajo en el área. Asimismo, surge la
necesidad de que los biocatalizadores o los procesos se modifiquen de
una forma que posibilite su empleo a escala industrial (Luetz et al.,
2008). En ese sentido, la expresión heteróloga de las enzimas ha sido
crucial en cuanto a su disponibilidad y su fácil utilización así como
en la provisión de sistemas que permitan la modificación posterior de
las propiedades de dichas enzimas. El desarrollo del concepto y de las
técnicas que han permitido la evolución in vitro de enzimas adecuadas
para una función determinada ha revolucionado el área (Bershtein y
Tawfik, 2008; Zhao, 2007; Otten y Quax, 2005). Al mismo tiempo, el
conocimiento creciente de genomas y la aparición de herramientas que
permiten estudiar metagenomas abren posibilidades de explorar la in-
96 | PAOLA PANIZZA Y SONIA RODRÍGUEZ

mensa diversidad de biocatalizadores presentes en la naturaleza (Steele
et al., 2009; Ferrer et al., 2005, 2009; Schmeisser et al., 2007; Sharma et
al., 2005; Streit et al., 2004).
Este capítulo pretende aportar una visión de la interfase biología
molecular-biocatálisis y su potencial y tiene como principal objetivo fa-
cilitar la incursión en el tema de los lectores que conocen de biocatá-
lisis pero son ajenos al área de la biología molecular. Se ha hecho más
hincapié en las técnicas disponibles y en el potencial que encierran que
en los resultados de la aplicación de esas técnicas en el área de la bio-
catálisis. Se incluyeron referencias fundamentales, tanto a metodologías
como a sus aplicaciones, para que puedan servir de base al lector que
decida aventurarse en el área.
CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DE ENZIMAS DE INTERÉS EN BIOCATÁLISIS.

DESARROLLO DE BIOCATALIZADORES RECOMBINANTES
La clonación y expresión de enzimas se ha utilizado tanto para aportar

una fuente de enzimas para su purificación posterior como para la cons-
trucción de biocatalizadores que expresen la enzima de interés en un
sistema sencillo de células enteras. El primer enfoque es el más utilizado
cuando se trata de enzimas que no requieren cofactores, por ejemplo de
hidrolasas. En este caso, la expresión de la enzima en un sistema adecua-
do permite su sobreproducción y su fácil purificación. En el caso de las
enzimas que requieren cofactores en general se ha buscado el desarrollo
de microorganismos recombinantes que sobreexpresen la actividad de-
seada pero que sean de utilidad en sistemas de células enteras. La gran
ventaja de este enfoque es que el aporte de cofactores es realizado por
el microorganismo y el aporte exógeno resulta innecesario.
Clonación del gen y selección del sistema de expresión
El tipo de biocatalizador, y su forma de uso, dictan en gran medida

la elección del sistema de expresión. Debe entenderse por sistema de
expresión el conjunto vector-hospedero. El vector es el vehículo en el
cual se transporta la información genética al microorganismo hospedero
y el microorganismo hospedero es el que aporta toda su maquinaria
celular para interpretar esa información y sintetizar la enzima de interés,
APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR EN BIOCATÁLISIS | 97

además de aportar los cofactores, de ser necesario. Si la enzima que se
va a expresar proviene de un organismo procarionte su expresión en E.
coli puede ser lo más conveniente; en cambio, si se trata de una enzi-
ma eucarionte con requerimientos de modificaciones postraduccionales
puede resultar mejor expresarla en levaduras. Si el biocatalizador se va a
utilizar en la forma de célula entera es conveniente analizar primero la
presencia de enzimas que puedan metabolizar el sustrato o el producto
en el microorganismo hospedero. Por ejemplo, la expresión de reductasas
resulta más conveniente en E. coli que en S. cerevisiae, que tiene más
de 50 reductasas propias (Rodríguez et al., 2000; Stewart et al., 2002).
La necesidad de aislar la enzima, en cambio, nos puede hacer optar por
un sistema como los basados en la levadura Pichia pastoris, caso en el
cual la expresión extracelular y el aislamiento son más sencillos. Las
diferencias en el uso preferencial de codones también pueden dictar
la selección del sistema que se va a utilizar porque muchas veces los
problemas de expresión se han asociado con la presencia insuficiente
de un determinado arn de transferencia, lo cual lleva a la síntesis de
proteínas truncadas. En este capítulo nos limitaremos a describir las
generalidades de la clonación y a la expresión en los sistemas más usa-
dos, los basados en E. coli, S. cerevisiae o P. pastoris.
Clonación
Si se conoce la secuencia del gen de elección se diseñan cebadores

que permitan su amplificación por pcr (reacción en cadena de la po-
limerasa). En los cebadores deben incluirse sitios diana para enzimas
de restricción que posibiliten su clonación posterior en el vector de
expresión. Es recomendable, aunque implique alargar el proceso, clonar
inicialmente el producto de la pcr en un vector de clonación del tipo
t/a. Esto permite verificar la secuencia del gen y la presencia de los
sitios de restricción adecuados y proporciona una base inagotable de
material genético de buena calidad para la construcción del vector
de expresión. En caso de genes eucariontes la presencia de intrones
requiere que se parta de arnm, se sintetice el ADNc y luego se am-
plifique esa secuencia para proceder según lo descrito anteriormente.
La posibilidad de sintetizar el gen, estrategia utilizada originalmente y
luego abandonada por las dificultades inherentes al proceso, constituye
una nueva alternativa hoy en día porque existen compañías que ofrecen

la síntesis de genes completos. Si bien el costo es elevado, se trata de
una alternativa interesante para la clonación y expresión de proteínas de
difícil expresión en E. coli. La síntesis química del gen permite utilizar
la combinación de codones adecuada para el hospedero y así evitar uno
de los problemas más comunes asociados con la expresión.
Sistemas de expresión en E. coli
E. coli es un microorganismo fácil de manejar y de cultivar. Sus caracte-

rísticas genéticas se conocen en profundidad y existe un gran número de
vectores de expresión y de cepas modificadas genéticamente que pueden
utilizarse para cubrir distintas necesidades. Estos factores determinan
que los sistemas de expresión basados en E. coli sean ampliamente uti-
lizados para la expresión heteróloga de proteínas (Demain y Vaishnav,
2009; Georgiou y Segatori, 2005). Sin embargo, no siempre es fácil
lograr que a partir de un gen clonado se produzca en gran cantidad una
enzima que mantenga su actividad biológica y que sea fácil de aislar y
purificar (Demain y Vaishnav, 2009; Baneyx, 1999).
La producción de enzimas en E. coli en general presenta mayor
rendimiento cuando la enzima es sobreproducida y acumulada en el
citoplasma (Demain y Vaishnav, 2009), aunque se han informado ex-
cepciones de esta regla (Georgiou y Segatori, 2005). Con frecuencia
la acumulación de altos niveles de una enzima en el citoplasma de
E. coli lleva a la formación de cuerpos de inclusión, que consisten en
grandes agregados de la proteína en forma inactiva. En algunos ca-
sos es posible aislar la enzima a partir de estos cuerpos de inclusión
en estado relativamente puro y recuperar su actividad mediante trata-
mientos que permitan su renaturalización (Demain y Vaishnav, 2009;
Kojima et al., 2003; Novagen, 2005). Sin embargo, si la pérdida de
actividad es irreversible o se desea utilizar la enzima en un sistema de
células enteras se torna necesario modificar el sistema para que no se
produzcan estos agregados. Una opción es bajar el nivel de expresión
mediante el uso de sistemas basados en promotores como lac o tac, en
lugar del más utilizado en la actualidad, el T7. Si el objetivo es obte-
ner la proteína aislada, es posible, mediante modificaciones genéticas,
fusionar la enzima de interés con proteína de unión a la maltosa (mbp)
(Kapust y Waugh, 1999) o con tiorredoxina (LaVallie et al., 1993), lo
que aumenta su solubilidad. Otra estrategia consiste en promover su

secreción al periplasma, donde las condiciones resultan más favorables
para el plegamiento correcto de muchas enzimas. Se dispone de vec-
tores de expresión que permiten que durante la clonación se agreguen
secuencias que luego serán traducidas en señales de secreción. La señal
de secreción es reconocida por proteínas específicas en la membrana
de E. coli, de manera que la proteína recombinante es secretada hacia
el espacio periplasmático, lo que evita su agregación. Un ejemplo de
este tipo de señales es el péptido señal pelB, presente en algunos vec-
tores pet (Novagen, 2005).
A pesar del amplio uso de E. coli en la producción de proteínas re-
combinantes, este sistema presenta desventajas que pueden impedir su
utilización en algunas aplicaciones. En los sistemas de E. coli la gran
mayoría de las proteínas secretadas se acumulan en el periplasma y para
lograr su liberación al medio de cultivo es necesario utilizar métodos
que alteren o rompan la pared celular y la membrana externa. Esto im-
plica que si bien la secreción al periplasma puede evitar la formación
de cuerpos de inclusión, no provee un sistema simple para la recupe-
ración de enzimas recombinantes. También se han explorado sistemas
de expresión y secreción en bacterias grampositivas, como por ejem-
plo Bacillus subtilis, que permitirían la secreción al medio de cultivo,
pero no han tenido aceptación general (Georgiou y Segatori, 2005).
Por otro lado, las proteínas provenientes de organismos eucariontes a
menudo presentan modificaciones postraduccionales necesarias para
su actividad, como por ejemplo glicosilaciones, metilaciones o acetila-
ciones. Los sistemas procariontes no son capaces de realizar estas mo-
dificaciones y esa incapacidad da lugar a enzimas inactivas cuando la
modificación es esencial para el plegamiento o la función.
Sistemas de expresión en levaduras
La levaduras se utilizan con frecuencia para la producción de enzimas

recombinantes cuya expresión en E. coli presenta dificultades (Glazer
y Nikaido, 1994). La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido utilizada
históricamente para la obtención de alcohol y el procesamiento de ali-
mentos, por lo que sus características han sido ampliamente estudiadas.
Las levaduras son fáciles de manipular, se encuentran bien caracterizadas
en términos genotípicos, en especial S. cerevisiae, y son capaces de reali-
zar algunas modificaciones postraduccionales, aunque ciertas proteínas

requieren la expresión en cultivos celulares de eucariontes superiores.
Las levaduras pueden secretar las proteínas recombinantes en el medio
de cultivo con una baja producción de proteínas extracelulares propias,
lo que facilita la purificación de las enzimas recombinantes. Diversas
levaduras distintas de S. cerevisiae, entre ellas P. pastoris y Kluyveromyces
lactis, han resultado más eficaces para la secreción de proteínas, presen-
tando mejores rendimientos en la producción de proteínas heterólogas
secretadas (Demain y Vaishnav, 2009; Müller et al., 1998).
Se utilizan distintos tipos de vectores para la expresión de proteínas
heterólogas en levaduras. Todos ellos poseen algún marcador para faci-
litar la selección de los clones que los contienen. Esto implica la utiliza-
ción de una cepa hospedera auxótrofa para un determinado aminoácido,
purina o pirimidina. El vector complementa la auxotrofia de la cepa
hospedera y eso permite el crecimiento en ausencia de dicha sustancia.
Además, la mayoría de los vectores utilizados también poseen un ori-
gen de replicación y un marcador de selección para E. coli. Los vectores
de este tipo, denominados shuttle vectors, permiten efectuar manipula-
ciones genéticas de manera simple en E. coli y una vez culminadas las
manipulaciones genéticas, ser incorporados a una cepa de levadura para
concretar la producción de la proteína recombinante.
Entre los vectores que se pueden utilizar para la expresión de proteí-
nas recombinantes en S. cerevisiae los más empleados para la producción
de grandes niveles de enzimas son los plásmidos episómicos. Estos plás-
midos poseen el origen de replicación del plásmido natural de 2 µm de
S. cerevisiae y se encuentran en alto número de copias (en general 30-50
copias por célula). En algunos casos en los que la proteína resulta tóxica
para la célula puede ser necesario utilizar vectores de otro tipo que se
encuentren en menor número de copias, como por ejemplo plásmidos
ars-cen o vectores integrativos. Los promotores pueden ser constitu-
tivos como el promotor de adh1 o inducibles como los promotores de
gal1, gal7 o gal10. Los promotores inducibles permiten la clonación
de enzimas que resultan tóxicas para la célula porque su expresión no
se induce hasta que se haya alcanzado una alta densidad de células en el
cultivo. En P. pastoris y K. lactis los sistemas más utilizados se basan en
vectores de integración, aunque existen excepciones (Hong et al., 2006;
Lee et al., 2005; 2007; Swinkels et al., 1993).
Al igual que en los procariontes, si se desea lograr la secreción de la
proteína recombinante en el medio de cultivo debe agregarse una señal

que dirija la proteína hacia el espacio extracelular. En el caso de las leva-
duras pueden utilizarse las señales de secreción de la invertasa secretada
(suc2), de la fosfatasa ácida secretada (pho5) o de la secreción del fac-
tor α. En todos los casos la proteína es ingresada en el aparato de Golgi
al ser traducida. Allí las condiciones son más favorables para el plega-
miento proteico correcto y es también en este espacio donde se produ-
cen las glicosilaciones y otras modificaciones postraduccionales. Después
de realizadas las modificaciones, las proteínas son secretadas en el me-
dio de cultivo.
Sistemas de purificación
Si se desea obtener una enzima para usarla en forma aislada, una vez
producida debe ser extraída, purificada y separada de las otras proteínas
que se producen en el sistema elegido (Waugh, 2005; Terpe, 2003). Si la
enzima se encuentra en el citoplasma de la célula va a estar acompañada
de un gran número de proteínas. Si se encuentra en el sobrenadante del
cultivo la cantidad de proteínas presentes en general será menor y la
purificación resultará más fácil. También puede suceder que la extracción
deba realizarse a partir de la fracción periplasmática o de los cuerpos de
inclusión.
En todos los casos la purificación puede facilitarse si se le agrega a
la proteína de interés una secuencia de aminoácidos exógena con alta
afinidad por un ligando químico o biológico específico (Arnau et al.,
2006). Estas secuencias, denominadas colas o “etiquetas” (tags en inglés),
se agregan en el momento de la clonación y son expresadas en forma de
fusión con la proteína clonada. Existen diversos tipos de colas disponi-
bles, que determinan el sistema cromatográfico que se va a utilizar. En
el cuadro 1 se muestran algunos de los sistemas empleados.
El sistema más utilizado consiste en la purificación mediante cro-
matografía de afinidad por unión a un metal inmovilizado (imac por
sus siglas en inglés). La histidina presenta gran afinidad por metales
de transición como Co2+, Ni2+, Cu2+ o Zn2+, por lo que se usan colas de
polihistidina. Como matriz de la cromatografía habitualmente se uti-
liza una resina del ácido nitriloacético (nta), la que forma un quelato
con el metal (con frecuencia Ni2+) y deja dos posiciones libres para la
formación de quelatos entre el ion metálico y la cola de histidinas. Al
ser pequeña la cola de histidinas por lo general no afecta la actividad

CUADRO 1. Producción de proteínas de fusión y sistemas de purificación
asociados
Nombre Nº de residuos Tamaño (KDa) Matriz
2-10
Poli-His 0,84 Ni2+-NTA, Co2+-CMA (Talon)
(generalmente 6)
FLAG 8 1,01 Anticuerpo monoclonal anti-FLAG
Strep-Tactin (estreptavidina
Strep-tag II 8 1,06
modificada)
S- 15 1,75 Fragmento S de la RNasa A
HAT- 19 2,31 Co2+-CMA (Talon)
Péptido de unión a la calmodulina 26 2,96 Calmodulina
27-189
Dominios de unión a la celulosa 3,00 - 20.000 Celulosa
(distintos tipos)
SBP 38 4,03 Estreptavidina
Dominio de unión a la quitina 51 5,59 Quitina
Glutatión-S-transferasa 211 26.000 Glutatión
Proteína de unión a la maltosa

396 40.000 Amilosa entrecruzada
(MBP)
de la enzima clonada, aunque esto debe ser comprobado en cada caso.

La cola de histidinas suele tener seis residuos y puede ubicarse en cual-
quiera de los extremos de la proteína.
Es posible que algunas colas cumplan más de una función. La fusión
de la proteína de interés con la mbp, además de aumentar la solubilidad de
la proteína recombinante resultante, permite su purificación mediante
cromatografía de afinidad con columnas de amilosa entrecruzada. En
este caso, una vez purificada la proteína de interés se torna necesario
eliminar la mbp mediante tratamientos con proteasas. Esto sucede con
todas las proteínas de fusión que por su tamaño o características fisi-
coquímicas alteren la actividad de la enzima recombinante.
En algunos casos se han desarrollado sistemas que permiten la au-
toeliminación de la cola fusionada mediante la utilización de inteínas,

que consisten en segmentos proteicos capaces de autoescindirse. El do-
minio de unión a la quitina ha sido combinado con una inteína y este
sistema puede ser fusionado con la enzima de interés. La proteína de
fusión resultante se purifica mediante el empleo de columnas de quitina
y luego se induce la escisión de la enzima por medio de la utilización
de tioles, sin necesidad de agregar proteasas1 (Sharma et al., 2006). La
fusión con inteínas también ha sido utilizada con sistemas de otros ti-
pos (Banki y Wood, 2005).
EVOLUCIÓN DIRIGIDA DE PROTEÍNAS
Aunque numerosas enzimas han sido identificadas como biocataliza-

dores interesantes, muchas veces existe la necesidad de “diseñar” un
biocatalizador mejor. La aplicación industrial de enzimas puede presen-
tar problemas asociados con inestabilidad enzimática y baja actividad
frente a sustratos no naturales o en medios de reacción o condiciones
fisicoquímicas particulares. La mutación sitio dirigida ha sido utilizada
como herramienta en la modificación de propiedades enzimáticas; puede
llevarse a cabo en forma sencilla y ha aportado biocatalizadores de inte-
rés (Bocola et al., 2005; Torres Pazmiño et al., 2007). No obstante, esta
herramienta requiere un conocimiento acabado del sistema, el sitio acti-
vo de la enzima y el mecanismo catalítico y además exige racionalizar o
modelar qué alteraciones mejorarían la propiedad deseada. Cuando no se
dispone de esa información la única manera de lograr un biocatalizador
mejor es en la forma en que lo hace la naturaleza, por evolución. La
evolución dirigida de proteínas emula el proceso de evolución natural en
el laboratorio pero a una velocidad mucho mayor y con un objetivo que
define el método de selección. Esta metodología ha permitido diseñar
variantes mejoradas de diferentes enzimas que incluyeron alteraciones
de la temperatura óptima, tolerancia a solventes, estabilidad, especifi-
cidad de sustrato, estereoselectividad y regioselectividad (Bornscheuer,
2005; Luetz et al., 2008; Otten y Quax, 2005; Boersma et al., 2007;
Bornscheuer y Bucholz, 2005). La base del proceso es la generación de
diversidad y la selección posterior de las mejores variantes para luego
1
Biolabs, N. E. Impact Kit. Disponible en <http://www.neb.com/nebecomm/products/
productE6901.asp>.

someterlas a un nuevo proceso de mutación y selección (figura 1). Se
construyen generaciones sucesivas de mutantes a partir de los mejores
candidatos de la generación anterior y con alternancia de los métodos
de generación de diversidad.
La mayor limitación en los procesos de evolución dirigida de pro-
teínas se asocia con la capacidad del método de rastreo o selección, o
sea con cuántos clones es posible analizar efectivamente con una téc-
nica dada. Las técnicas de selección tienen la ventaja de que permiten
trabajar con muestras más grandes (106 o mayores) porque los clones
que manifiestan la actividad deseada son los únicos que pueden sobre-
vivir. El requisito esencial para tener un método de selección es que la
actividad en estudio se vincule con una función que aporte una venta-
ja en la supervivencia, por ejemplo la capacidad de utilizar una fuente
determinada de carbono (Henne et al., 1999) o un mecanismo de resis-
tencia a un antibiótico o alguna sustancia tóxica, o complementar una
mutación presente en la cepa que se va a utilizar (Bornscheuer, 2005).
Desafortunadamente, muchas actividades enzimáticas no pueden co-
rrelacionarse con una actividad biológica básica que permita un méto-
do de selección y por lo tanto lo más frecuente es que se usen técnicas
de rastreo o screening. Cuando se diseña un método de rastreo se debe
buscar particularmente que refleje la propiedad que se desea estudiar.
Puede ocurrir que los mutantes que muestran superioridad en una
función deseada pierdan capacidad en alguna otra función y esto con-
dicione su aplicabilidad posterior (Zhao et al., 1999). Por ejemplo, si
se desea mejorar el exceso enantiomérico de una enzima hay que pro-
curar que no se vean afectados factores como la estabilidad, la tole-
rancia a los solventes y la actividad, todas propiedades que hacen a su
utilidad como biocatalizador. Por lo tanto, el método de rastreo debe
tener en cuenta todas esas propiedades para seleccionar aquellos con
mejoras en la capacidad deseada que a su vez mantengan el resto de
sus características. Esto a veces puede llevarse a cabo en un solo paso
y cuando no se puede se realiza un primer rastreo rápido de actividad y
en un segundo paso se analizan las demás variantes o se complementa
el ensayo inicial con datos como enantioselectividad o especificidad de
sustrato (Liebeton et al., 2000). La ventaja de los métodos de rastreo o
screening es su gran versatilidad; casi siempre es posible contar con un
método que permita medir la actividad deseada, pero las características
de los ensayos que se van a realizar limitan el tamaño de la colección

FIGURA 1. Esquema general de la evolución dirigida de proteínas. Sucesivas rondas
de mutación y selección llevan al mejoramiento de la propiedad deseada. El mejor
candidato de cada generación es sometido a una nueva ronda de mutación
2. Generación de diversidad
1. Selección de interés mediante mutaciones
3. Clonado de la genoteca
en un vector de expresión
La mejor variante se utiliza cada vez
como punto de partida para un nuevo
ciclo de generación de diversidad y
selección, hasta alcanzar el objetivo
deseado
4. Transformación de
la cepa hospedera
5. Selección de los
mejores mutantes
(distintos métodos)
de mutantes que se puede analizar. En general, es posible analizar 104

muestras, aunque el uso de técnicas robóticas puede incrementar el ta-
maño de la muestra hasta 106.
Como los métodos con los que se genera diversidad son los mis-
mos que la generan naturalmente, se han desarrollado varias técnicas
de laboratorio para emular esos procesos y algunas de ellas se analiza-
rán en detalle más adelante. La evolución natural se basa en dos gran-
des procesos: las mutaciones al azar que afectan una base, lo que puede
reflejarse o no en un cambio a nivel de la secuencia aminoacídica, y la
recombinación homóloga en la que se intercambian largos fragmentos
de ADN con alto grado de homología, lo que puede determinar varios
cambios a nivel de la proteína. Ambos procesos tienen importancia na-
tural y ambos también desempeñan su papel en los procesos de evolu-
ción dirigida. Un tercer proceso de importancia natural es la inserción

o deleción de pequeñas secuencias. Hace poco se desarrollaron formas
de emular estos procesos in vitro (Fujii et al., 2006) pero su utilidad
todavía no está clara (Bershtein y Tawfik, 2008).
Mutagénesis al azar
La mutagénesis al azar consiste en la generación de variantes del gen

por la introducción de errores durante los procesos de copia o replica-
ción del ADN. Esto puede hacerse in vitro mediante amplificación del
gen por pcr en condiciones en las que la fidelidad de la copia es baja o
con cepas que han sido mutadas en sus mecanismos de reparación del
ADN, como Epicurian coli XL1-Red, y por lo tanto introducen muta-
ciones durante la replicación (Greener et al., 1996). En la mutagénesis
al azar los factores que es más importante controlar son la frecuencia
de mutación y el sesgo del proceso. La frecuencia de mutación es el
número de mutaciones por gen (en general expresado como porcentaje)
y su nivel máximo está limitado por la capacidad del método de análisis
de los mutantes generados. La frecuencia de mutación se debe ajustar
en función del número de clones que se pueden analizar, de forma de
cubrir en el rastreo de la genoteca toda la diversidad que se genera. Un
nivel adecuado de mutación, aunque esto varía según las características
del método de selección y el tamaño del gen que se va a mutar, es de 0,2
a 0,5%, lo que para un tamaño promedio de gen de 1.000 pb equivale a
2-5 sustituciones en el total de la secuencia. Como muchas sustituciones
son silenciosas, no determinan un cambio de aminoácido; para un gen
de 1.000 pb se obtendría un cambio promedio de un aminoácido por
variante enzimática generada.
pcr proclive a errores
La pcr proclive a errores (eppcr por sus siglas en inglés) es el método

más utilizado en la generación de mutaciones al azar debido a su sim-
plicidad y su rapidez. La inclusión de Mn++ en el medio de reacción
disminuye la fidelidad de la ADN polimerasa y el resultado de ello es
la generación de mutantes. La gran ventaja de esta metodología es que la
frecuencia de mutación es fácil de controlar por la cantidad de manga-
neso presente en la mezcla de reacción (Shafikhani, 1997), que también
depende del número de ciclos de duplicación efectivos, los que pueden

ajustarse mediante la modificación del número de ciclos de pcr así como
de la relación de la concentración entre los cebadores y el molde.
Como la fidelidad de la polimerasa varía según las características
de la secuencia que se esté amplificando, se obtendrán diferentes fre-
cuencias para diferentes genes aunque se utilice el mismo protocolo.
Esto conduce a la necesidad de optimizar condiciones para cada ex-
perimento en particular. La mejor forma de evaluar la frecuencia de
mutación del proceso es secuenciar un pequeño número de clones to-
mados al azar. Otra forma utilizada a menudo consiste en ver el efecto
sobre la actividad de una muestra de la población. Las tasas mayores
de mutación llevarán a poblaciones con porcentajes altos de pérdida de
actividad por lo cual es deseable una pérdida de actividad intermedia
(Zhao et al., 1999).
La mayor desventaja de la eppcr es que no provoca sustituciones
totalmente azarosas sino que tiene un sesgo y las mutaciones en los
pares at son mucho mas frecuentes que en los pares gc. Además, a es
sustituida mayoritariamente por g. Se han desarrollado protocolos con
modificaciones que han logrado reducir este sesgo pero no eliminarlo
(Caldwell y Joyce, 1992).
Recombinación in vitro
La recombinación homóloga, el proceso que determina la mayor gene-

ración de diversidad en la naturaleza debido al intercambio de grandes
espacios de secuencia en los que puede haber varias sustituciones, de-
leciones o inserciones, en el laboratorio también es una herramienta
de gran utilidad para generar variantes nuevas. Su uso complementa la
generación de variantes al azar porque permite la mezcla de variantes
individuales y llega a detectar variantes mejoradas en las que se pro-
duce una sinergia de las mutaciones individuales. Con las técnicas de
recombinación es posible asociar variantes de una proteína generadas por
mutagénesis al azar así como variantes naturales.
dna shuffling
El primer método de recombinación utilizado en el laboratorio se cono-

ce como “shuffling” y fue desarrollado por Stemmer en 1994 (Stemmer,
1994a). La base del método es la degradación parcial con endonucleasas

de los genes que se van a mezclar y la realización posterior de una pcr
sin cebadores para el ensamblaje del gen completo (figura 2). La acción
de la dnasa genera fragmentos al azar que luego se desnaturalizan en
los ciclos de pcr. Al enfriar la mezcla de reacción los fragmentos con
homología se hibridan y dan lugar a superposiciones que son extendi-
das por la ADN polimerasa. La repetición de los ciclos determina que
ese proceso ocurra con fragmentos cada vez mayores y finalmente dé
lugar a genes completos construidos como copias de secuencias parciales
provenientes de genes diferentes y que por lo tanto combinarán varian-
tes presentes en las distintas secuencias parentales. En los protocolos
habituales esos ciclos se repiten 40 veces (Zhao et al., 1999; Zhao y
Arnold, 1997). Una vez finalizado el proceso de recombinación in vitro
se realiza una pcr con cebadores para amplificar las variantes generadas
y permitir su clonación en vectores de expresión con el fin de analizar
los cambios en la función diana.
St ep
La posibilidad de crear quimeras por recombinación in vitro de genes

con diferente grado de homología demostrada por Stemmer (Stem-
mer, 1994a) catalizó el desarrollo de otras metodologías que permiten
obtener resultados similares en forma más sencilla. Entre estos proce-
dimientos se pueden citar el método mejorado de Stemmer (Stemmer,
1994b), la rpr (random-priming recombination) (Shao et al., 1998) y el
step (Zhao et al., 1998). El método de recombinación por extensión
parcial de la secuencia conocido por sus siglas en inglés step (staggered
extension process) aporta una técnica más sencilla que permite evitar los
pasos consistentes en la digestión de los genes parentales, la purifica-
ción de los fragmentos y la amplificación final requerida en los demás
protocolos (Stemmer, 1994b; Shao et al., 1998). La recombinación
por step se basa en una pcr en la que el paso de extensión es extre-
madamente corto y a temperaturas subóptimas. Un protocolo habitual
consiste en 80 a 100 ciclos de 94 ºC (30 s) seguidos de ciclos de 55 ºC
(5 a 15 s) en los que se producen la hibridación y la extensión. De esta
forma, en el primer ciclo los cebadores (primers) se hibridan pero solo
logran una extensión parcial de la secuencia; luego se desnaturaliza el
ADN y los fragmentos extendidos vuelven a hibridarse con el molde,
lo que permite una segunda extensión parcial. Cada hibridación puede

FIGURA 2. Recombinación por “shuffling”. Los ADN parentales son digeridos
por endonucleasas y los fragmentos resultantes se someten a ciclos de pcr sin
cebadores; en los ciclos los mismos fragmentos actúan como cebadores y como
resultado se obtienen copias completas del gen en las que se han mezclado las
secuencias parentales
Digestión al azar
con DNAsaI
GENES PARENTALES Desnaturalización
Hibridación
PCR SIN CEBADORES
Extensión Desnaturalización
Producto resultante:
combinaciones de los
genes parentales
ocurrir con diferentes genes parentales y por lo tanto la repetición

de estos ciclos logra generar amplicones cuya secuencia combina en
diferentes formas los genes parentales (Zhao et al., 1998).2
2
Los protocolos de recombinación muchas veces utilizan polimerasas con actividad correc-
tora de prueba (Pfu y Vent) para evitar la inclusión de mutaciones puntuales no presentes
en los genes parentales. En el caso del step el uso de estas enzimas también permite incre-
mentar la frecuencia de recombinación porque estas polimerasas tienen menor velocidad
y procesividad. Una velocidad menor se asocia con menor extensión de cada fragmento y
por lo tanto con mayor frecuencia de cruzamiento ( Judo et al., 1998).

Diseño racional versus evolución dirigida de proteínas
La mayor ventaja demostrada de la evolución dirigida de proteínas en

relación con el diseño racional es que mapea alteraciones en toda la
secuencia proteica por lo que muchas veces se detectan cambios en sitios
jamás sospechados por el investigador. El diseño de proteínas basado en
métodos racionales se concentra en alterar el sitio activo de la proteína.
A partir de los resultados obtenidos con la evolución dirigida de proteí-
nas se observa que muchísimas veces las alteraciones presentes en ami-
noácidos que se encuentran lejos del sitio activo tienen mayor incidencia
en determinadas propiedades que los aminoácidos ubicados en el sitio
activo. Han surgido mezclas de ambas estrategias y es posible que ese
sea el camino futuro para combinar sus fortalezas. Se han desarrollado
varias técnicas que permiten realizar evolución al azar pero ya no sobre
todo el espacio proteico sino sobre algunos aminoácidos identificados
como cruciales en la regulación de la propiedad que se desea cambiar.
La identificación de los sitios de mayor importancia puede provenir
de datos aportados por la evolución dirigida de proteínas o de datos
conocidos a partir del estudio racional de la proteína en cuestión. La
generación de variantes se realiza al azar pero sobre ese espacio definido
y tratando de que sea exhaustiva, o sea que permita evaluar todas las
variantes posibles de cada uno de esos aminoácidos.
Mutagénesis por saturación
La mutagénesis por saturación, que en principio fue patentada y utiliza-

da por Diversa para generar todas las variantes posibles de una proteína
(Kretz et al., 1998), consiste en una metodología exhaustiva con la que
se exploran todas las mutaciones factibles en cada residuo aminoacídico
y se dejan todas las demás fijas. La técnica, que si se considera indepen-
dientemente cada aminoácido es similar a la utilizada para la mutación
dirigida por el sitio, se basa en la amplificación de todo el vector de
expresión que contiene el gen de interés a partir de cebadores que con-
tienen todas las secuencias posibles para el aminoácido que se quiere
sustituir. Con polimerasas de alta fidelidad y procesividad se logra copiar
el vector con todas las mutaciones posibles en esa posición. El proceso
se repite con oligonucleótidos adecuados para mutar cada uno de los
aminoácidos de la proteína en estudio. Esta metodología permite evaluar

toda la secuencia proteica y aporta información sobre qué residuos son
neutrales y cuáles son posiciones críticas para la actividad enzimática.
No obstante, se trata de una metodología costosa que implica el uso de
métodos de rastreo automático que permitan evaluar colecciones muy
grandes de mutantes (106 para una proteína de 300 aa). Sin embargo,
no hace mucho se la utilizó en combinación con metodologías clásicas
de la evolución dirigida de proteínas como el método de la eppcr. La
identificación de un residuo crítico por métodos de mutagénesis al
azar puede ser seguida por una estrategia de saturación en dicha po-
sición a fin de determinar qué sustitución es la más beneficiosa. Esta
estrategia fue aplicada por Reetz y colaboradores en la evolución de
la lipasa de Pseudomonas aeruginosa y duplicó la enantioselectividad al
realizar mutagénesis por saturación en aminoácidos detectados como
“sitios calientes” o sitios muy sensibles a la mutación (Reetz, 2004). Las
metodologías más utilizadas se basan en la realización de una pcr con
cebadores degenerados que introducen todas las mutaciones posibles,
para lo cual existen diferentes técnicas (Barettino et al., 1994; Ivancic
et al., 2007).
cncm
Una estrategia de suma utilidad vinculada con la anterior es la muta-

génesis combinatoria en casetes, conocida por su sigla en inglés cncm
(Combinatorial Multiple Cassette Mutagenesis). Con este método se rea-
liza la mutagénesis por saturación en dos residuos cercanos que han
sido identificados como críticos y entre los que se piensa o se sabe que
puede haber interacciones tanto beneficiosas como negativas. La técnica
utilizada consiste básicamente en una recombinación al azar en la que se
incluyen casetes con todas las combinaciones de aminoácidos posibles
en las posiciones elegidas. Estos casetes van a recombinarse con la se-
cuencia parental para dar lugar a una colección de clones con todas las
combinaciones aminoacídicas factibles en las posiciones seleccionadas
(Crameri y Stemmer, 1995; Reetz et al., 2001).
cast
Es indudable que la combinación de métodos de evolución dirigida

de proteínas y diseño racional ha aportado recientemente y seguirá

aportando la solución de muchos desafíos en el área de la biocatálisis.
Un ejemplo de ello es la metodología desarrollada por Reetz y cola-
boradores para ensayar mutagénesis combinatoria en pares de residuos
seleccionados del sitio activo. Esta estrategia, conocida por su sigla en
inglés cast (Complete Active Site Saturation Test), implica el análisis
de la estructura del sitio activo de la enzima unida a un sustrato y la
selección de pares de aminoácidos cercanos entre sí que puedan estar
involucrados en la interacción enzima-sustrato (Reetz et al., 2005). La
selección del par de residuos para combinar resulta crucial y tiene una
base racional, lo que no sucede con las sustituciones por realizar. Las
mutaciones se introducen en forma similar a la utilizada en la cncm
mencionada anteriormente y para cada par de mutaciones se generan
colecciones de mutantes de unos tres mil clones. Las genotecas gene-
radas se analizan en relación con la propiedad que se desea modificar.
El informe original demostró la efectividad de esta técnica para expan-
dir la especificidad de sustrato de la lipasa de Pseudomonas aeruginosa
(Reetz et al., 2005). Además, la observación de que las sustituciones
que aportaban los mejores resultados experimentales muchas veces no
eran las más racionales demostró el potencial de combinar estrategias
de evolución dirigida de proteínas y diseño racional. Otra técnica in-
formada recientemente, la mutagénesis de saturación iterativa (ism en
inglés), también ha demostrado la fortaleza de esta estrategia (Reetz y
Carballeira, 2007). En este caso también se trata de una técnica de evo-
lución dirigida de proteínas restringida a un espacio definido como de
particular importancia en la propiedad que se quiere mejorar. El diseño
racional justamente se aplica en la selección de los sitios diana que se
van a modificar, cada uno de los cuales puede estar compuesto por entre
uno y tres aminoácidos. La contribución sustancial de esta estrategia
es su carácter iterativo, que como tal reduce drásticamente el trabajo
de mutagénesis y evaluación de los mutantes. Se parte de genotecas
construidas para cada posición y luego sobre esos mutantes se analizan
variantes en las otras posiciones. En la segunda ronda se vuelve a hacer
lo mismo con los mejores mutantes dobles. Las iteraciones sucesivas
permiten optimizar la mejor combinación de variantes pero no en forma
exhaustiva sino por una aproximación continua al nivel óptimo.
En síntesis, la mutagénesis al azar determina la generación de va-
riantes que en sí mismas pueden constituir un buen resultado pero que
además aportan datos sobre sitios calientes de mutación y proporcio-

nan una base de variantes que pueden ser sometidas a recombinación,
a mutagénesis de saturación, a cncm, a ism o a una combinación de
esas técnicas. La combinación de técnicas ha demostrado ser de suma
utilidad en la obtención de las mejores variantes de una enzima para
una propiedad dada (Reetz, 2004).
DIVERSIDAD MICROBIANA Y NUEVOS BIOCATALIZADORES
Las estimaciones realizadas sobre la diversidad microbiana indican que

un gramo de suelo contiene más de 4.000 especies de bacterias y se
considera que en el laboratorio solo ha sido posible cultivar menos del
1% de ellas (Curtis y Sloan, 2004; Torsvik y Øvreås, 2002; Torsvik et
al., 2002). Esta es una clara indicación de la diversidad existente, que
representa un enorme potencial y un enorme desafío en el área de la
biocatálisis. La percepción del potencial que encierra esta diversidad ha
dirigido el interés de muchos investigadores hacia el rastreo de nuevos
genes de microorganismos aislados de hábitats naturales para encontrar
enzimas con comportamientos singulares y más estables en condiciones
de temperatura, pH o salinidad diversas así como para generar biocata-
lizadores capaces de transformar un amplio abanico de sustratos pero
manteniendo la estereoespecificidad y la regioespecificidad (Faber y
Kroutil, 2005).
Genomas y metagenomas
Para llegar a la biodiversidad no cultivable hay dos enfoques nuevos,

a saber, la estrategia denominada “genome mining” y el descubrimiento
a partir de metagenomas. La primera estrategia utiliza bases de datos
de genomas para el rastreo fundado en la existencia de homología con
enzimas ya caracterizadas, con lo que se restringe la posibilidad de
hallar capacidades biocatalíticas en enzimas sin relación filogenética.
No obstante, se trata de una herramienta que permite utilizar toda
la información ya acumulada y en constante crecimiento con poco
costo y poco esfuerzo y cuyo empleo permitió identificar 68 poten-
ciales Bayer-Villiger monooxigenasas a partir de la secuencia consenso
FXGXXXHXXXW(P/D) (Fraaije et al., 2002). Con el conocimiento
creciente de genomas este número se expandirá rápidamente (Ka-

merbeek et al., 2003) y la estrategia podrá ser aplicada a diversas
enzimas.
El rastreo de metagenomas, en cambio, se basa en la búsqueda de la
actividad y no en la homología con enzimas ya conocidas. Esta estra-
tegia implica la construcción de genotecas representativas de una co-
munidad microbiana por extracción directa del ADN de una muestra
de ambiente y clonación en un hospedero adecuado (Schemeisser et al.,
2007). La actividad enzimática en general es identificada por pruebas
de actividad. Este enfoque ha permitido encontrar nuevas subclases de
enzimas con amplia diversidad filogenética y por lo tanto la posibili-
dad de hallar biocatalizadores con propiedades novedosas se incrementa
ampliamente (Steele et al., 2009; Ferrer et al., 2009). Robertson y co-
laboradores describieron 137 nitrilasas nuevas, en comparación con 20
que se conocían previamente, y entre ellas se pudieron obtener nitrila-
sas con diferente estereoespecificidad (DeSantis et al., 2002).
Construcción de una genoteca
Las genotecas son colecciones de clones que en conjunto representan

el genoma de un microorganismo o el metagenoma de un hábitat. El
paso inicial en la construcción de una genoteca es la extracción de
ADN del microorganismo o de la comunidad que se quiere estudiar.
Las extracciones de ADN para el análisis del metagenoma de un hábitat
ponen particular cuidado en la representatividad del ADN extraído. Los
diferentes tipos de microorganismos tienen un comportamiento dife-
rente frente a los tratamientos de lisis celular y esto puede determinar
que una muestra de ADN no sea representativa de la comunidad. En
estudios recientes se han usado diversos protocolos que optimizan la
extracción y reducen el sesgo debido a la lisis diferencial de los miem-
bros de cada comunidad microbiana (Frostegard y Courtois, 1999; Krsek
y Wellington, 1999; Miller et al., 1999; Uchiyama y Watanabe, 2008).
Otras consideraciones de importancia que se deben tener en cuenta al
seleccionar un método de extracción son la obtención de ADN de alto
peso molecular y la reducción al mínimo de la presencia de contaminan-
tes. En las extracciones a partir de suelos o de lodos la contaminación
por ácidos húmicos resulta un problema porque se los extrae junto con
el ADN. La inclusión de ctab en el buffer de extracción es fundamental,
pero aun así el problema persiste. Se han probado diferentes técnicas de

purificación, entre ellas purificación en sílice, agarosa y sephadex 200,
y los mejores resultados se obtuvieron con esta última (Miller et al.,
1999). En nuestro laboratorio hemos probado con bastante buen resul-
tado la purificación por concentradores de proteína con filtro de corte
10 mil nmwl. Algunos autores incluyen un paso de precultivo anterior
a la extracción de ADN de la comunidad como una forma de evitar o
disminuir la incidencia de contaminantes. Obviamente este paso altera
y reduce la biodiversidad existente en la muestra pero es una estrategia
por considerar según el objetivo de cada estudio (Daniel, 2005).
Clonación
Una vez extraído el ADN se lo digiere parcialmente para obtener los

fragmentos del tamaño deseado. Este paso implica una optimización
de la digestión con Sau3AI para la muestra en cuestión, seguida por la
digestión en mayor escala y la purificación del ADN digerido (Uchiyama
y Watanabe, 2008). El tamaño de los fragmentos y el tipo de vector que
se va a utilizar dependen de si se quieren detectar genes individuales,
operones o clusters de genes. En el primer caso se pueden utilizar vectores
de clonación que porten fragmentos de 4 a 8 kb sin inconveniente (Hen-
ne et al., 1999; 2000) mientras que en los otros casos se debe recurrir a
la clonación en cósmidos o fósmidos (Entcheva et al., 2001). Los frag-
mentos se clonan en el vector adecuado con técnicas convencionales y se
transforma la cepa hospedera, generalmente E. coli. Es importante cuidar
la eficiencia del método de transformación para obtener un número de
clones representativo del metagenoma en estudio. Según nuestra expe-
riencia la mejor eficiencia se obtiene cuando se utiliza arnt de levadura
y se transforma por electroporación (Zhu y Dean, 1999).
Rastreo o selección de clones positivos
Los métodos de rastreo o selección suelen basarse en la expresión de la

enzima en el microorganismo hospedero. El factor limitante es que los
genes del metagenoma tienen que expresarse en ese microorganismo,
que debe reconocer los promotores y las secuencias reguladoras presentes
en ellos. Varios estudios recientes indican que E. coli, el microorganismo
más utilizado como hospedero, expresa un promedio del 40% de los
genes presentes en una genoteca (Gabor et al., 2004). Se han estudiado

hospederos alternativos (Streptomyces lividans y Pseudomonas putida),
que pueden ser útiles para el estudio completo del metagenoma de un
hábitat (Martínez et al., 2004).
Como en el caso del rastreo de las genotecas producidas en estudios
de evolución dirigida de proteínas, los métodos de selección son me-
jores y permiten analizar más clones que los métodos de rastreo, aun-
que no siempre es posible diseñar métodos de ese tipo. Lo más común
es que se utilicen métodos de rastreo que puedan aplicarse como parte
del propio medio de cultivo. De esta forma, al construir la genoteca y
transformar al hospedero adecuado la selección de transformantes ya
se realiza en un medio diferencial que posibilita la visualización de la
actividad deseada. Se han desarrollado metodologías que permiten vi-
sualizar de esta forma una gran diversidad de actividades enzimáticas
que trascienden el objetivo de este capítulo y con respecto a las cuales
el lector puede consultar excelentes revisiones del tema (Steele y Streit,
2005; Steele et al., 2009; Bershtein y Tawfik, 2008; Ferrer et al., 2009;
Schmeisser et al., 2007; Sharma et al., 2005).
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CAPÍTULO 5
Aplicaciones del modelado

molecular a la biocatálisis
José María Sánchez Montero
y Andrés R. Alcántara León
INTRODUCCIÓN
Al igual que la química orgánica, que ha evolucionado a partir de una

descripción empírica hasta una disciplina basada en el mecanismo y
una ciencia basada en la estructura, la biocatálisis está evolucionando
hacia un diseño racional de la ciencia basada en la estructura. El co-
mienzo de la biocatálisis también estuvo marcado por aproximaciones
empíricas, como el cribado de muestras (conocido con el nombre de
screening) o simples extrapolaciones a partir de sustratos conocidos.
Independientemente de que las técnicas de screening sigan siendo he-
rramientas válidas en biocatálisis, los últimos avances logrados en el
conocimiento de las estructuras tridimensionales de las enzimas abren la
posibilidad de realizar un diseño racional de nuevas reacciones y nuevos
catalizadores. En ese sentido, el modelado molecular puede ayudar a
responder las importantes preguntas que se plantean al llevar a cabo un
proceso biocatalizado (Kazlauskas, 2000), porque se puede 1) explicar a
nivel molecular el comportamiento (en muchos casos conocido) de una
enzima, 2) sugerir cómo cambiaría la selectividad de una reacción por
modificación del sustrato, la enzima o las condiciones de reacción y
3) predecir en forma cuantitativa el grado de estereoselectividad de una
reacción catalizada por una enzima.
Las distintas técnicas computacionales que se han ido desarrollando
en los últimos años lo han hecho en función del conocimiento de la es-
| 125
tructura tridimensional tanto del ligando como del receptor (cuadro 1).
Por ejemplo, las dos estrategias seguidas habitualmente en modelado,
cuando se pretende diseñar un nuevo fármaco que actúe sobre deter-
minado receptor (perfectamente extrapolables a la interacción sustrato-
enzima), se denominan directa e indirecta. En la primera se requiere el
conocimiento de las características tridimensionales de un receptor y
se interpreta la actividad o la inactividad de las moléculas en términos
de complementariedad con el receptor. Esto es lo que se conoce por el
término docking (que podría traducirse como atraque, aplicado a un bar-
co que entrara en un puerto, aunque generalmente se emplea el término
inglés) o estudios de interacción entre el fármaco y el receptor.
La segunda estrategia, en la que la estructura tridimensional del re-
ceptor biológico no se conoce, se basa en el análisis comparativo de las
características estructurales de sustancias conocidas, activas o inactivas,
con el fin de definir un farmacóforo apropiado para la actividad bioló-
gica estudiada, cuya aplicación más destacada se conoce como método
qsar 3d (three-dimensional quantitative structure-activity relationships o
relaciones cuantitativas estructura-actividad en tres dimensiones). Estos
avances en ciencias computacionales nos permiten describir en detalle
la maquinaria del biocatalizador.
No obstante, la predicción cuantitativa in silico de la actividad en-
zimática y la selectividad sigue siendo un objetivo de gran interés en
biocatálisis. Así, los estudios de las dos últimas décadas han demostrado
cómo pueden utilizarse adecuadamente las enzimas, tanto en disolución
acuosa como en entornos no convencionales, lo que permite nuevas me-
todologías por desarrollar, incluso en condiciones experimentales más
extremas (Klibanov, 2001).
Estos avances han beneficiado en gran medida el modelado mole-
cular, al simular algunos de los fenómenos que tienen lugar a nivel de
las moléculas durante la biocatálisis y de ese modo proporcionar la base
para el diseño de estrategias racionales en la experimentación. Las si-
mulaciones moleculares ayudan a la construcción de modelos virtuales
de sistemas químicos. El principal interés del modelado molecular en
biocatálisis es el conocimiento de las interacciones enzima-sustrato a
nivel molecular y en general, como se comentó anteriormente, con el
propósito de predecir la actividad y la selectividad. Hay distintos algo-
ritmos que sirven para predecir el docking de un sustrato en el centro
activo de una enzima así como para calcular su energía de interacción y
126 | JOSÉ MARÍA SÁNCHEZ MONTERO Y ANDRÉS R. ALCÁNTARA LEÓN

CUADRO 1. Evolución de las técnicas computacionales en función del conocimiento
del receptor
Estructura Estructura del receptor

del ligando
Conocida Desconocida
Conocida Interacciones ligando-receptor Modelos de farmacóforos
Dinámica molecular y técnicas de docking Búsquedas 3d basadas

en el ligando/farmacóforo
qsar 2d y 3d
Desconocida Diseño de novo Generar estructuras en 3d
Búsquedas 3d basadas en el diseño Medidas de similitud y diversidad molecular
Química combinatoria
para la simulación de su energía de solvatación. La aplicación de estos

métodos a la biocatálisis se basa en el cálculo de la energía libre de la
reacción, que a su vez deriva de la simulación del estado de transición,
como veremos más adelante.
Cuando los fenómenos son demasiado complejos para ser simu-
lados se puede recurrir a otros métodos de cálculo, por ejemplo a la
quimiometría, porque son capaces de extraer información relevante
a partir de datos experimentales y, finalmente, permiten la construc-
ción de modelos de predicción del comportamiento de la enzima. La
quimiometría, que definimos como la ciencia de las mediciones reali-
zadas sobre un sistema o proceso químico por aplicación de métodos
matemáticos o estadísticos, consta de una serie de técnicas heterogé-
neas entre las cuales el diseño estadístico de experimentos y el análisis
estadístico multivariante son los más importantes para la aplicación
en biocatálisis.
Debemos señalar que con los métodos quimiométricos y el mode-
lado molecular se utilizan enfoques radicalmente opuestos a la hora de
construir modelos predictivos; así, mientras que los primeros estable-
cen relaciones empíricas entre los parámetros operacionales y la varia-
ble medida (actividad, estereoselectividad, estabilidad…), sin ninguna
presunción de modelos, el modelado molecular utiliza bases teóricas
APLICACIONES DEL MODELADO MOLECULAR A LA BIOCATÁLISIS | 127

previas antes de establecer sus predicciones. No obstante, estas dos
estrategias no son excluyentes sino complementarias (Braiuca et al.,
2006a), como veremos luego.
A continuación procederemos a exponer de manera algo más deta-
llada algunos aspectos en los que el modelado molecular ha contribui-
do al desarrollo de la biocatálisis.
1. RECONOCIMIENTO ENZIMA-SUSTRATO Y SELECTIVIDAD DE LA ENZIMA
Las técnicas de modelado molecular se han convertido en herramientas

de rutina en la descripción de las interacciones enzima-sustrato. Otros
temas de interés, tales como el mejoramiento de la estabilidad de la
enzima o la interpretación racional del efecto del disolvente sobre las
reacciones biocatalizadas, se han investigado en menor proporción. En
el primer caso esto se debe a que la estabilización de la enzima se con-
sigue más a menudo a través de diferentes vías (por ejemplo, mediante
evolución dirigida). El problema del efecto del disolvente sin duda
merece una atención especial, por lo que se comentará más adelante
(véase apartado 6).
La mayor parte de los estudios computacionales realizados en el
campo de la biocatálisis se concentran en la predicción de la selectivi-
dad de la enzima. Esto implica el cálculo de la constante de especifi-
cidad (kcat/KM), que depende de la energía libre del estado de transición
de la reacción. En este sentido, los denominados métodos ab initio de
la mecánica cuántica (qm) son capaces de reproducir los datos expe-
rimentales sin emplear parámetros empíricos. La calidad de un cálcu-
lo ab initio depende de la base mínima usada para el cálculo, y por su
parte, la decisión sobre qué tipo de base debe aplicarse dependerá del
objetivo del cálculo y del tipo de molécula por estudiar. Conviene re-
saltar que la utilización de bases de cálculo muy sofisticadas no siempre
garantiza una buena concordancia con los datos experimentales. Aun-
que los métodos ab initio de la qm proporcionan tanto la precisión más
alta para la simulación molecular como la posibilidad de contemplar
efectos electrónicos, la complejidad del cálculo restringe sus aplicacio-
nes a dianas químicas a nivel de unas pocas decenas de átomos. Por lo
tanto, la complejidad de un sistema biocatalítico limita drásticamen-
te la posibilidad de aplicar métodos de qm, lo que obliga a que en la

química computacional se usen métodos de mecánica molecular (mm)
clásica, basados en un conjunto de ecuaciones y parámetros denomi-
nados campos de fuerza.
Así, la mm considera los átomos de una molécula como un conjun-
to de masas que interaccionan a través de fuerzas armónicas o elásti-
cas. En este sentido, los átomos son tratados como bolas de diferentes
tamaños (según el tipo de átomo) y los enlaces se consideran mue-
lles. Esto permite la simulación de macromoléculas, es decir proteínas;
no obstante, la naturaleza empírica de los campos de fuerza, que de-
ben ser correctamente parametrizados, determina que el tratamiento
de cualquier efecto electrónico sea inviable. Así, los campos de fuer-
za más utilizados son mm2 (o sus versiones posteriores mm3 y mm4)
para moléculas pequeñas (Nevins y Allinger, 1996), Amber (Case et
al., 2005) para las proteínas (mejor opción, puesto que contempla las
interacciones electrostáticas de una forma más adecuada) o charmm
(Brooks et al., 1983).
Finalmente, los métodos híbridos de qm-mm tratan la parte reactiva
de los sistemas biocatalíticos, relativamente pequeña, a nivel de qm, y
todo lo demás por mm, lo que ofrece una buena alternativa de cálculo.
A ese respecto en la figura 1 se representan los resultados obtenidos en
el docking de los confórmeros de mínima energía del S-ketoprofeno
en el centro activo de la lipasa de C. rugosa, enantiómero preferente-
mente reconocido en la hidrólisis estereoselectiva a partir de la mezcla
racémica (Sánchez-Montero, 2009).
2. SIMULACIÓN DE ANÁLOGOS DEL ESTADO DE TRANSICIÓN
La cinética de las reacciones biocatalizadas depende de la energía libre

de sus estados de transición, en los que las especies químicas no son
estables, y como los métodos de mm solo pueden usarse cuando las
estructuras son estables y además carecen de la capacidad de simular
los procesos de ruptura y formación de enlaces, la estrategia más común
para modelar in silico las interacciones entre las enzimas hidrolíticas
[las más empleadas en biotransformaciones (Bornscheuer y Kazlauskas,
2006)] y sus sustratos, a nivel de mm, es la simulación del intermedio
tetraédrico, una especie química estable en la que un dador de acilo se
encuentra unido en forma covalente al residuo catalítico de la proteína

FIGURA 1. Confórmeros de mínima energía del S-ketoprofeno en el centro activo
de la lipasa de C. rugosa (Sánchez-Montero, 2008)

y que mimetiza el estado de transición de la reacción (Pleiss et al.,
2000; Mittal et al., 2005). Un ejemplo típico consiste en el empleo de
fosfonatos como análogos que mimetizan el estado de transición en la
hidrólisis de los ésteres (Gascoyne et al., 2001; Luic et al., 2008). No
obstante, existe el problema de que estos análogos solo se aproximan
al verdadero estado de transición. Para tratar de resolver este problema,
los métodos mixtos (qm-mm) suelen emplear en primer lugar qm para
modelar el estado de transición en fase gaseosa y después trasladar
este modelo al interior de la enzima y efectuar el resto de los cálculos
mediante mm (Zuegg et al., 1997). Sin embargo, hoy en día, con los
avances en la capacidad de cálculo de los ordenadores actuales es posible
utilizar qm para calcular los estados de transición, no en fase gaseosa,
sino directamente en el centro activo (Colombo et al.,1999; Otte et al.,
2009). Con esta opción, la distribución de las cargas parciales cambia
mucho, de manera que los cálculos posteriores permiten una descripción
más adecuada de los resultados experimentales.
3. DESCRIPCIÓN GRID DE LA NATURALEZA QUÍMICA DEL CENTRO ACTIVO
La descripción grid de la capacidad de unión del centro activo pro-

porciona una información valiosa que complementa la simulación de
análogos del estado de transición mencionada anteriormente. El progra-
ma grid es un protocolo computacional desarrollado por Goodford en
1985 (Goodford, 1985) para detectar sitios de unión energéticamente
favorables entre moléculas de estructura tridimensional conocida, en
función de la estimación de las energías de interacción entre grupos
químicos pequeños (llamados sondas) y una zona determinada de la
enzima, por lo general el centro activo. El enfoque grid permite una
descripción más precisa de la interacción enzima-sustrato y fue apli-
cado por Gardossi y colaboradores (Basso et al., 2002a; 2002b) en el
estudio de la selectividad de la penicilina G amidasa (pga). Además
de proporcionar directrices para el acoplamiento de los sustratos en el
centro activo de la enzima, la visualización de los campos de interacción
molecular (molecular interaction fields o mif ) generados por diferentes
sondas (hidrófobas, dadores y aceptores de enlaces de hidrógeno y gru-
pos cargados) permitió una exploración fácil y rápida de la naturaleza
química del centro activo, con lo que se consiguió un esquema completo

de los requerimientos estructurales del sustrato para su reconocimien-
to óptimo. Además, el estudio estableció las normas generales para
la enantiodiscriminación e ilustró las diferentes interacciones de los
enantiómeros con dos zonas químicamente distintas del centro activo
(Basso et al., 2002b). Las velocidades de acilación determinadas ex-
perimentalmente fueron utilizadas a posteriori para validar el modelo,
que solo proporciona una predicción cualitativa del reconocimiento
diferencial de los enantiómeros. No obstante, un tiempo después este
modelo se aplicó para estudiar la optimización de la resolución enzi-
mática a partir de una mezcla multicomponentes de sustratos en un
proceso Diels-Alder, lo que posibilitó el desarrollo de una estrategia
de ingeniería del sustrato y la predicción de los sustituyentes en el
anillo de ciclohexeno que conduce a la más alta enantiodiscriminación
(E > 200) (Strübing et al., 2004).
Aunque en los estudios comentados hasta ahora se alcanzaron bue-
nos resultados en la racionalización de las estrategias experimentales,
todos fallaron en la predicción cuantitativa de la selectividad de la en-
zima, incluso cuando el análisis grid se combinó con aproximaciones
del análogo al estado de transición. Esta limitación se debe a que to-
dos los enfoques descritos se basan en varias aproximaciones signifi-
cativas (Kazlauskas, 2000); así, por ejemplo, el primer problema puede
ser atribuido a la naturaleza simplificada de los cálculos del campo de
fuerza empleado y el segundo gran problema radica en el hecho de que
las pequeñas diferencias de energía originan variaciones de importan-
cia en la selectividad, las que pueden ser enmascaradas por las grandes
fluctuaciones causadas por el movimiento normal de las proteínas. Esta
cuestión ha sido contemplada en los estudios en los que Hult y cola-
boradores (Raza et al., 2001) intentaron explicar la enantioselectividad
de la lipasa B de Candida antarctica.
Otras limitaciones de la aproximación del análogo al estado de
transición derivan de la dificultad de evaluar la contribución entró-
pica a la energía libre de las reacciones. Se ha demostrado que la en-
tropía puede desempeñar un papel principal en la selectividad de la
enzima, en particular cuando los intermedios tetraédricos de los dos
enantiómeros difieren en rigidez estructural y en el tipo de interac-
ción con el disolvente, aunque la relación de compensación de los
mecanismos entropía-entalpía no ha sido aclarada del todo (Ottos-
son et al., 2002).

4. PREDICCIÓN DE LA ENANTIOSELECTIVIDAD
DE LA ENZIMA CON MÉTODOS DE MECÁNICA
CUÁNTICA O MECÁNICA MOLECULAR
Para tener en cuenta todas las contribuciones a la energía libre de las

reacciones biocatalizadas deben emplearse enfoques más sofisticados.
En el primer estudio (y el más clásico) sobre la predicción cuantitativa
de la diferencia de energía libre entre los dos intermedios tetraédricos
(véase apartado 3) de dos enantiómeros Colombo y colaboradores (Co-
lombo et al., 1999) describieron la resolución de una mezcla racémica
de 1-feniletanol por acilación catalizada por subtilisina. El enfoque
utilizado consistió en un modelo con todos los átomos con solva-
tación explícita completa, energía libre de perturbación (free energy
perturbation o fep), simulaciones de dinámica molecular (dm) y cargas
atómicas derivadas de metodologías de qm o mm. Es probable que
los resultados obtenidos en ese estudio de 1999 representen la mejor
predicción cuantitativa de la enantioselectividad descrita hasta ahora
en la bibliografía, pero a pesar de ello la tasa de error todavía puede
considerarse elevada.
En otros estudios se han utilizado métodos ab initio de qm y de di-
námica molecular-energía libre de perturbación (md-fep) para inten-
tar la cuantificación de la enantioselectividad de la α-quimotripsina en
procesos de hidrólisis (Felluga et al., 2003). En este enfoque los cálculos
ab initio para la parte reactiva del complejo enzima-sustrato se com-
binaron con el tratamiento clásico de la interacción de la energía libre
entre el sistema mecanocuántico y el entorno de mecánica molecular. El
estudio presenta una descripción detallada del enantiorreconocimiento
enzimático y del efecto de solvatación en la catálisis enzimática, pero
solo a nivel cualitativo.
Sin duda la principal dificultad a la hora de llevar a cabo una pre-
dicción cuantitativa adecuada de la enantioselectividad deriva del hecho
de que, aunque se pueda establecer de una forma muy precisa cuál es la
energía libre del estado de transición del enantiómero preferentemente
reconocido dentro del centro activo (véase apartado 2), el otro enantió-
mero puede tener tipos de orientaciones diferentes que impliquen inte-
racciones distintas con diferentes zonas del centro activo (Kazlauskas,
2000, 2001; Park et al., 2009).

5. CORRELACIÓN ENTRE LA SELECTIVIDAD
DE LA ENZIMA Y DESCRIPTORES MOLECULARES
Dado que el cálculo preciso de la energía libre de una reacción bioca-

talizada sigue siendo una tarea difícil, el desarrollo de las alternativas
más simples y directas es un área de investigación activa. Cabe seña-
lar que para que una herramienta de predicción sea atractiva debe ser
competitiva con respecto al tiempo empleado en el laboratorio para
realizar un experimento. En general, no hay motivos para esperar dos
meses hasta la predicción de una medida que pueda ser determinada
experimentalmente en dos semanas (Braiuca et al., 2006a).
A este respecto, es probable que los métodos de md, fep y qm no
sean los más apropiados para el desarrollo de modelos de predicción,
al menos a la luz de los instrumentos de cálculo de los que se dispone
habitualmente. Como consecuencia de ello se han desarrollado varias
estrategias alternativas destinadas a simplificar cálculos y a evitar la de-
terminación de la energía del estado de transición de la reacción.
Estas ideas se aplicaron en el estudio del enantiorreconocimiento de
alcoholes terciarios por carboxilesterasas (Henke et al., 2003) y permi-
tieron demostrar la posibilidad de formular una predicción cuantitativa
de la enantioselectividad sin recurrir al cálculo de la energía libre del
estado de transición. En este sentido el análisis geométrico de los in-
termedios tetraédricos, construido por docking manual y simulaciones
de md, puso de manifiesto la correlación cuantitativa entre la enantio-
selectividad y un descriptor geométrico único, definido como la dis-
tancia entre el nitrógeno de la histidina catalítica y uno de los átomos
de oxígeno del sustrato. Aunque la validez de este tipo de descripto-
res no se puede aceptar como general, la identificación de correlaciones
similares en diferentes sistemas biocatalíticos representa una vía ori-
ginal y sencilla para llegar a la predicción de la enantioselectividad en
un plazo razonable.
Como ejemplo de la investigación realizada por nuestro grupo co-
mentaremos el estudio llevado a cabo para explicar la regioselectividad
y la estereoselectividad encontradas en la acilación de diferentes (1,n)-
alcanodioles con la lipasa del páncreas porcino (Borreguero et al., 1999,
2001). Después de la realización de un docking manual de los distin-
tos sustratos en la estructura descrita del centro activo, ilustrado en la
figura 2 para el 2-fenil-1,3-propanodiol, se postuló la posibilidad de

FIGURA 2. Docking manual del 2-fenil-1,3-propanodiol (gris) en el centro
activo de la lipasa del páncreas porcino (ppl) (Borreguero et al., 1999; 2001),
con simulación del estado de transición. Residuos implicados: Ser153 (azul),
His264 (verde) y Phe216 (rojo)
que el residuo Phe216 desempeñara un papel importante en el reco-

nocimiento correcto del sustrato, con un ajuste de las dimensiones de
los sustratos a un triángulo de dimensiones coincidentes con los resi-
duos Ser153, His264 (correspondientes a la tríada catalítica) y la men-
cionada Phe216.
Esa hipótesis fue confirmada en un estudio más refinado de docking
(Sánchez-Montero, 2009) en el que se corroboraron las distancias pre-
vistas y las interacciones propuestas (figura 3).
6. ESTUDIO DEL EFECTO DE LOS DISOLVENTES
Como ya se mencionó, es muy importante considerar que puesto que

el modelado molecular debe tratar de interpretar y predecir resultados
experimentales los procesos biocatalíticos se llevan a cabo en presencia
de disolventes y por ende hay que estudiar el efecto de la solvatación.

FIGURA 3. Docking automático del 1-fenil-1,2-etanodiol en el centro activo de
la lipasa del páncreas porcino (ppl) (Sánchez-Montero, 2008), realizado con
el software ArgusLab
Inicialmente la mayoría de los cálculos de modelado incluyen las

moléculas de agua que se encuentran en la estructura de cristal pero no
las moléculas de agua adicionales del disolvente, cuyo efecto en general
se simula utilizando un parámetro dieléctrico dependiente para tratar
de imitar la solvatación (Kazlauskas, 2000). Ke y colaboradores (Ke et
al., 1998) usaron un método mejorado para simular el agua disolvente,
un modelo electrostático continuo, pero los resultados fueron similares
a los obtenidos con el modelo más simple. Es evidente que este tra-
tamiento incompleto de solvatación es una aproximación y está claro
que el disolvente puede cambiar la selectividad de la enzima, aunque
todavía no hay consenso con respecto al por qué.
Una de las posibles explicaciones propuestas atribuye la capacidad
de estereodiscriminación a la diferente solvatación de los complejos

diastereoisoméricos enzima-sustrato. Por ejemplo, Ke y Klibanov (Ke y
Klibanov, 1998) estudiaron la enantioselectividad de la α-quimotripsina
en la acilación de un diol proquiral y hallaron que el estado de transi-
ción que conducía a la acilación en el hidroxilo pro-R colocaba un re-
siduo de 3,5-dimetoxifenilo en un bolsillo de la enzima mientras que
el estado de transición que conducía a la acilación en el hidroxilo pro-S
dejaba este residuo arilo expuesto al disolvente. Estos autores correla-
cionaron la enantioselectividad observada con los coeficientes de acti-
vidad termodinámica de la zona aromática expuesta, pero no como una
predicción cuantitativa, sino como una correlación directa en el sentido
de que cuanto mejor era la solvatación de las partes expuestas, mayor
resultaba la enantioselectividad. Sin embargo, este método no pudo ser
extrapolado a otros sustratos.
También debe considerarse que, para complicar aún más la situa-
ción, ciertos aminoácidos que no están en contacto directo con el sus-
trato pueden influir de manera decisiva en la selectividad, como sucede
con el residuo 225 en la trombina, que nunca entra en contacto con
el sustrato pero ejerce su influencia sobre la forma y la disposición del
canal de agua que se localiza en la proximidad del centro activo (Guin-
to et al., 1999).
La capacidad de ciertas enzimas para trabajar de manera eficiente en
medios no acuosos es ampliamente conocida. Entre esos medios no con-
vencionales podemos considerar disolventes orgánicos (Klibanov, 2001;
Adlercreutz, 2008), líquidos iónicos (Itoh y Tomoko, 2007) o fluidos
supercríticos (Matsuda et al., 2005). En ese sentido las lipasas son enzi-
mas de interés particular (Reetz, 2002) debido a su excepcional actividad
en disolventes orgánicos, por lo que el estudio de su comportamiento en
dichos medios mediante modelado molecular constituye un campo de
trabajo muy frecuentado. Un tema especialmente estudiado ha sido el
movimiento de la tapadera, una hélice α de carácter anfipático próxi-
ma al centro activo; cuando la enzima está en conformación cerrada
la tapadera cubre por completo el centro activo, mientras que cuando
se activa la enzima, en un proceso denominado activación superficial,
la tapadera se mueve y deja el centro activo expuesto al sustrato (Sch-
mid y Verger, 1998; Miled et al., 2001), por lo que su influencia sobre la
actividad catalítica es considerable (Overbeeke et al., 2000; Secundo et
al., 2004; 2006). La conformación cerrada predomina en medio acuoso,
mientras que en medio orgánico o en presencia de interfase agua/lípi-

do prevalece la conformación abierta. Existen muchos trabajos que han
abordado el estudio del movimiento de la tapadera mediante técnicas de
dinámica molecular con el objetivo de comprender los cambios confor-
macionales asociados con dicho movimiento y las posibles influencias
sobre él (disolvente, pH, temperatura, etc.) (Peters et al., 1996; Jaaske-
lainen et al., 1998; Peters y Bywater, 1999; 2001; 2002; Jensen et al.,
2002; Tejo et al., 2004; Cherukuvada et al., 2005; James et al., 2007).
No obstante, la mayor parte de los trabajos que han abordado ese tema
se han concentrado en las propiedades dinámicas de los dos estados del
equilibrio (lipasa cerrada y lipasa abierta) y han usado simulaciones de
md de tiempo corto (< 10 ns) para tratar de establecer cuáles son los
principales átomos y residuos involucrados en el movimiento. En ese
sentido Guieysse y colaboradores, que siguieron unos estudios previos
(Guieysse et al., 2004; 2008), abordaron muy recientemente (Barbe et
al., 2009), y en forma exhaustiva, el movimiento de la tapadera de la
lipasa de Burkholderia cepacia, tanto en medio acuoso como en tolueno.
Sobre la base de simulaciones de md de tiempos largos, estos autores
describen modificaciones conformacionales importantes en la enzima,
que efectivamente expone o protege su centro activo frente al sustra-
to con dependencia del entorno disolvente (agua, octano, interfaz de
agua/octano). Así, la interconversión de la conformación abierta en la
cerrada en agua, y de esta última en la primera en octano, se observa
espontáneamente en simulaciones de md de 20 ns, lo que indica que
las barreras de energía entre ambos estados deben reducirse por efecto
del disolvente. De manera más precisa, se observa un desplazamiento de
aproximadamente 13 Å de la tapadera, la cual abarca unos 40 residuos y
está compuesta por dos hélices α separadas por un bucle corto.
7. MODELADO MOLECULAR E INGENIERÍA RACIONAL DE ENZIMAS
Algunos de los logros más relevantes de las técnicas computacionales en

biocatálisis provienen de la ingeniería racional de enzimas, término por
el que se entiende la mutación selectiva de algunos aminoácidos en la
estructura de la proteína para lograr un efecto determinado (aumento de
actividad, estereoselectividad, estabilidad, etc.) (Cedrone et al., 2000).
Como ejemplo clásico de esta metodología citaremos el trabajo de
Scheib y colaboradores (Scheib et al., 1998) en el que con el modelado

molecular se pudo predecir que la sustitución del residuo Leu258 en la
lipasa de Rhizopus oryzae (rol) por una fenilalanina permitiría el (al fi-
nal comprobado experimentalmente) aumento de la enantioselectividad
en la hidrólisis de triglicéridos. En otro ejemplo, el modelado molecular
permitió predecir la mutagénesis de tres aminoácidos en la apolipopro-
teína c-iii (apoc-iii) y así alterar la unión de esa proteína a diferentes
lípidos (Liu et al., 2000) o a la lipoproteinlipasa (lpl) (Razzaghi et al.,
2000). Por otra parte, Botta y colaboradores (Manetti et al., 2001) uti-
lizaron técnicas de modelado molecular para estudiar la importancia de
los residuos Phe344 y Phe345 en el reconocimiento del éster metílico
del ketoprofeno en su hidrólisis enantioselectiva por parte de la lipasa
de Candida rugosa. Por último citaremos el estudio publicado por los
grupos de Jaeger y Thiel (Funke et al., 2005), en el cual se utilizaron
técnicas de modelado que simulaban la estrategia del escaneo de alani-
na (“Ala-scan”, consistente en la sustitución sistemática de una serie de
aminoácidos por alanina para que, mediante la variación observada en
una determinada propiedad del mutante, se pueda deducir la mayor o
la menor importancia del aminoácido sustituido) y que apuntaban a la
importancia vital del residuo His76 en la actividad de la lipasa de Baci-
llus subtilis. A posteriori, al construir la biblioteca de mutantes, este hecho
quedó plenamente confirmado. También nos parece interesante comentar
que en el estudio del movimiento de apertura de la tapadera de la lipa-
sa de Burkholderia cepacia mencionado en el apartado anterior (Barbe et
al., 2009) la mutación in silico de dos aminoácidos presentes en dicha
tapadera (Val138 y Phe142), expuestos inicialmente al disolvente y que
terminaron enterrados en el interior cuando la lipasa se cerró, permitió
comprobar su papel clave en el equilibrio entre conformaciones, dado
que la mutación de Val138 a Ala o Ser impidió por completo el cierre de
la tapadera y el cambio de la Phe142 por serina determinó que la lipasa
adoptara una conformación intermedia entre abierta y cerrada.
No obstante, este enfoque de la evolución del biocatalizador a veces
se ve como una suerte de competencia con la metodología de evolución
dirigida ( Jaeger y Eggert, 2004). Evidentemente, aunque el modelado
molecular es muy adecuado tanto para optimizar las posibles interac-
ciones enzima-sustrato como para dilucidar el mecanismo catalítico de
la enzima, debemos reconocer que en general es mucho menos eficiente
para la identificación de los efectos de las mutaciones alejadas del cen-
tro activo, que pueden alterar la estructura de la proteína y modificar

su comportamiento (Bolon et al., 2002; Morley y Kazlauskas, 2005).
En este contexto, la evolución dirigida puede ofrecer una solución más
eficiente del problema.
Por otro lado, el modelado molecular también puede ser empleado
para racionalizar las bases de la “promiscuidad” de las enzimas (Mü-
ller, 2004; Kazlauskas, 2005; Khersonsky et al., 2006; Hult y Berglund,
2007), concepto que según Hult y Berglund (Hult y Berglund, 2007)
alude a la capacidad de algunas de ellas de trabajar en condiciones ex-
perimentales diferentes de las naturales que les son propias (medios no
acuosos, valores extremos de temperatura o pH, etc.), a la capacidad
de reconocer un amplio abanico de sustratos de diferente estructura o
bien a su capacidad de catalizar diferentes reacciones químicas con di-
ferentes estados de transición. Estos mismos autores definen estas tres
habilidades como promiscuidad de condición, de sustrato o catalítica,
respectivamente. Así, por ejemplo, Branneby y colaboradores (Branne-
by et al., 2003), mediante el empleo de técnicas de modelado molecular
(cálculos de mecánica cuántica sobre análogos del estado de transición,
véase apartado 2) fueron capaces de explicar de manera eficiente la razón
por la cual la mutación Ser105Ala en la lipasa B de Candida antarctica
convierte esta enzima de una hidrolasa en una aldolasa con capacidad
de catalizar la condensación aldólica entre aldehídos. Esa misma mu-
tación, anticipada por cálculos mecanocuánticos, estudios de docking y
simulaciones de mecánica molecular, permite que esa misma lipasa ca-
talice adiciones conjugadas de tioles y aminas a compuestos carboníli-
cos α,β-insaturados (Carlqvist et al., 2005). Estos dos ejemplos ilustran
perfectamente los tres tipos de promiscuidad: una lipasa que funciona en
procesos que no son los naturales habituales (promiscuidad catalítica),
que actúa sobre aldehídos o aminas y tioles (promiscuidad de sustrato)
y que opera en disolventes orgánicos (promiscuidad de condición).
8. MODELADO MOLECULAR COMBINADO CON QUIMIOMETRÍA:

QSAR 3D PARA LA PREDICCIÓN DE LA ENANTIOSELECTIVIDAD
Los métodos qsar 3d (relaciones cuantitativas estructura-actividad

en tres dimensiones) utilizan los datos provenientes de simulaciones
moleculares como entrada para el análisis estadístico multivariante y
representan la fusión entre el modelado molecular y la quimiometría.

Aunque el uso de qsar 3d está bien establecido en el diseño de fár-
macos, su aplicación en biocatálisis comenzó hace pocos años. Los
trabajos pioneros de Tomic y colaboradores (Tomic et al., 2001; 2004;
Tomic y Kojic-Prodic, 2002) representan un ejemplo de la viabilidad de
las predicciones cuantitativas de kcat/KM a través de un enfoque qsar
3d, que correlaciona los descriptores del sistema químico con los datos
mensurables experimentalmente. La predicción cuantitativa de la enan-
tioselectividad de la lipasa de Burkholderia cepacia se logró mediante el
desarrollo de un método en el que la energía libre de unión se calcula
de manera aproximada a través de una combinación lineal de la energía
de interacción del complejo enzima-sustrato y la superficie polar y no
polar accesible al disolvente. El peso de cada parámetro se calculó por
análisis pls y el alto coeficiente de correlación de predicción (Q2=0,84)
confirmó la validez de la aproximación. Posteriormente, estos autores
disminuyeron el tiempo de cálculo mediante la adopción del método
Monte Carlo de análisis conformacional, de manera que lograron bue-
nos resultados en la predicción cuantitativa de los valores de enantio-
selectividad de una nueva serie de sustratos (Tomic et al., 2004).
Por otra parte, Braiuca y colaboradores (Braiuca et al., 2006b) des-
cribieron la aplicación de la técnica de qsar 3d para la predicción cuan-
titativa de la selectividad enzimática de la penicilina G acilasa con dos
métodos qsar derivados de grid [grind (Pastor et al., 2000) y Volsurf
(Cruciani et al., 2000)]. Los valores de kcat/KM medidos experimental-
mente fueron utilizados como variable respuesta para la construcción
de un modelo de regresión múltiple basado en descriptores moleculares
puramente geométricos calculados por el método de grind y Volsurf.
La gran ventaja de este enfoque es que una vez que se dispone de un
conjunto de datos experimentales se puede construir un modelo com-
pleto de predicción en unas pocas horas. Muy recientemente los mismos
autores (Braiuca et al., 2009) describieron el uso de la metodología de
qsar 3d para diseñar un modelo predictivo que describe la enantiose-
lectividad de la lipasa B de Candida antarctica en la resolución de alco-
holes y aminas quirales. En este caso el descriptor molecular utilizado,
también basado en grid y denominado dimfs (acrónimo en inglés de
campos diferenciales de interacción molecular), permitió la creación de un
modelo predictivo fiable y robusto.
Además, en biocatálisis el método qsar 3d también puede emplear-
se en sistemas en los que no se conoce la estructura tridimensional

del biocatalizador, mediante el empleo de estudios de comfa (acróni-
mo de Comparative Molecular Field Analysis; Carballeira et al., 2004).
Con la aplicación de esta metodología se pudo predecir la estructura
del sustrato modelo en la biorreducción de diferentes cetonas median-
te el empleo de células enteras de G. candidum y S. octosporus (véase la
figura 4) (Sánchez-Montero y Sinisterra, 2007). El código de colores
es el que sigue: 1) las zonas de bajo impedimento estérico (verde) son zo-
nas en las que la presencia de restos químicos del sustrato favorece la
interacción entre este y la enzima, 2) las zonas de alto impedimento es-
térico (amarillo) son zonas en las cuales la presencia de grupos en el
sustrato disminuye la afinidad de la adh por el sustrato y 3) las zonas
electrostáticas, son zonas que presentan una elevada densidad electróni-
ca que favorece la interacción (rojas) y zonas con una elevada densidad
de carga negativa que la desfavorece (azules). La principal ventaja de
esta metodología para modelar el centro activo de una enzima desco-
nocida es que se trata de un método puramente químico que permite
formular predicciones sin conocer la estructura primaria de la enzima
y sin siquiera haberla aislado.
FIGURA 4. Metodología qsar-3d/comfa utilizada con el fin de predecir los

requerimientos que presentarán diferentes sustratos para ser reducidos mediante
el empleo de células de G. candidum (izquierda) y S. octosporus (derecha). Véase
código de colores en el texto

CONCLUSIÓN Y PROGNOSIS
A partir de todo lo expuesto hasta ahora el lector puede llegar a la

conclusión final de que el modelado molecular constituye una herra-
mienta de gran utilidad para la biocatálisis aplicada porque permite
interpretar de manera racional el proceso de interacción entre una en-
zima y su sustrato y proporciona datos fiables que permiten predecir
el comportamiento del sistema. Sin duda, los grandes avances logrados
en el campo de la bioinformática, asociados con el empleo de medios
computacionales cada vez más sofisticados, auguran que en poco tiempo
habrá un aumento considerable de nuestra capacidad de extraer con-
clusiones racionales de los procesos biocatalizados; por lo tanto, nuestra
modesta opinión es que en los próximos años en esta área de investigación
se observará una cantidad considerablemente mayor de estudios y que
la calidad de esos estudios también aumentará.
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CAPÍTULO 6
Biocatálisis enzimática
industrial
Andrés Illanes
POTENCIALIDADES Y LIMITACIONES DE LAS ENZIMAS

COMO CATALIZADORES INDUSTRIALES
Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteica altamente evo-

lucionados para cumplir una función fisiológica de la que dependen
todas las formas de vida. Todas y cada una de las reacciones químicas
del metabolismo celular requieren de una enzima, de modo que no
es sorprendente que exista una gran cantidad de reacciones químicas
susceptibles de ser catalizadas por enzimas. Puede postularse que para
cualquier reacción de química orgánica descrita existirá una enzima
capaz de catalizarla. En efecto, la cantidad de secuencias primarias
de una proteína es prácticamente ilimitada: si se considera una mo-
lécula enzimática constituida por “n” residuos aminoacídicos existirán
20n secuencias primarias posibles, lo que aun para una proteína muy
pequeña representa un número enorme de secuencias factibles. Por lo
tanto, obtener la enzima adecuada es un problema de búsqueda en el
inagotable reservorio de la naturaleza, un desafío muy estimulante si
se considera que solo se ha aislado y caracterizado una fracción muy
pequeña de las formas de vida de existencia natural. A ello se agrega
que en la actualidad el uso de la metagenómica permite obtener ADN
de organismos no cultivables y clonarlo en un hospedero adecuado
para su expresión (Lorenz y Eck, 2005) y que es posible remodelar
los genes estructurales mediante mutagénesis sitio dirigida (Abián et
al., 2004).
| 151
Las enzimas han sido diseñadas naturalmente para actuar en condi-
ciones fisiológicas y exhiben propiedades notables como catalizadores
en cuanto a especificidad y reactividad en condiciones moderadas. Sin
embargo, la biocatálisis se refiere al uso de enzimas como catalizadores
de procesos en condiciones artificiales (in vitro) y el gran desafío de la
biocatálisis enzimática es poder transformar esos catalizadores fisioló-
gicos, sin perder sus buenas propiedades de reactividad y especificidad,
en catalizadores robustos capaces de actuar en condiciones de proceso
rigurosas. Las enzimas presentan propiedades muy diferentes de las de
los catalizadores químicos, lo que en gran medida se debe a su compleja
estructura molecular. En el cuadro 1 se resumen sus potencialidades y
sus limitaciones como catalizadores de procesos.
Las enzimas son catalizadores altamente deseables cuando la espe-
cificidad de la reacción es un aspecto clave del proceso, como ocurre
en sus múltiples aplicaciones en síntesis orgánica para la producción de
fármacos (Woodley, 2008) y productos químicos (García-Junceda et al.,
2004) y también cuando la reacción debe llevarse a cabo en condiciones
moderadas, sea debido a la inestabilidad de los sustratos o productos de
la reacción, sea para minimizar reacciones secundarias indeseables. Las
crecientes regulaciones ambientales representan un nicho de oportuni-
dad para los procesos enzimáticos frente a tecnologías alternativas por
su menor impacto ambiental y por ser catalogados como tecnologías
compatibles con el ambiente (Bommarius y Riebel, 2004). Sin embargo,
las enzimas son estructuras moleculares complejas, lábiles y de produc-
ción costosa, lo que representa el principal escollo para su aplicación a
nivel industrial (Ó’ Fágáin, 1997). La baja estabilidad operacional de
las enzimas es su principal desventaja, por lo que el desarrollo de tec-
nologías para incrementarla constituye un aspecto central de la bioca-
tálisis (Illanes, 1999). Se han propuesto diversas estrategias, entre las
que cabe destacar la modificación química de la estructura enzimática
(Mislovičová et al., 2006; Rodrigues et al., 2009), la inmovilización en
soportes y nanoestructuras (Mateo et al., 2005; Kim et al., 2006; Wang,
2008) y la autoinmovilización mediante cristalización (Roy y Abraham,
2006) y agregación (Wilson et al., 2006; Illanes et al., 2006; Sheldon et
al., 2007), las que se complementan con modernas técnicas de ingeniería
de proteínas como la mutagénesis dirigida y la evolución acelerada (Ar-
nold, 2001; Adamczak y Hari Krishna, 2004; Bardy et al., 2005; Morley
y Kazlauskas, 2005; Boersma et al., 2007). La búsqueda de enzimas con
152 | ANDRÉS ILLANES

CUADRO 1. Potencialidades y limitaciones de las enzimas como catalizadores de
procesos
Potencialidades Limitaciones
Elevada especificidad Elevada complejidad molecular
Elevada reactividad en condiciones moderadas Fragilidad intrínseca
Elevado número de rotación Elevado costo de producción
Alta biodegradabilidad Sensibilidad a la inhibición por productos de la reacción
Consideradas generalmente como productos naturales
estabilidad intrínseca provenientes de microorganismos y de metage-

nomas extremófilos también es una estrategia muy importante y esos
genes han sido clonados y expresados en hospederos adecuados para la
producción de enzimas de relevancia industrial (Haki y Rakshit, 2003;
Zeikus et al., 2004). Por otra parte, la tecnología de producción de en-
zimas ha tenido un notable desarrollo que se ha traducido en menores
costos de producción (Illanes, 2008), como se verá más adelante.
Puede apreciarse que las buenas propiedades de las enzimas, como
su especificidad, su reactividad y su compatibilidad ambiental, les con-
fieren un gran potencial como catalizadores industriales. Tales ventajas
serán perdurables, mientras que las limitaciones derivadas de su esca-
sa estabilidad y el alto costo de su producción están siendo resueltas a
través de diversas estrategias, muchas de ellas complementarias.
Las enzimas no son catalizadores de procesos ideales pero su gran es-
pecificidad, su elevada reactividad en condiciones moderadas y su com-
patibilidad ambiental les confieren un gran potencial que cada día es más
apreciado por diversos sectores industriales. A los sectores de usuarios de
enzimas en gran escala tradicionales, como la industria de los alimentos
(Hultin, 1983) y la de los detergentes (Maurer, 2004), se ha ido suman-
do paulatinamente en las dos últimas décadas la industria de la síntesis
orgánica para la producción de fármacos, agroquímicos y otros productos
químicos (Thomas et al., 2002; Bruggink et al., 2003; Ran et al., 2008).
El desarrollo de la biocatálisis permite augurar un impacto creciente
en la industria de procesos, en especial en aquellos de alto valor agrega-
do en los que la especificidad de las enzimas es de alta relevancia.
BIOCATÁLISIS ENZIMÁTICA INDUSTRIAL | 153

CLASES DE ENZIMAS Y SU SIGNIFICACIÓN TECNOLÓGICA
Según las normativas del Comité de Nomenclatura de la Unión In-

ternacional de Bioquímica y Biología Molecular (International Union
of Biochemistry and Molecular Biology o iubmb), de acuerdo con el
tipo de reacción catalizada las enzimas se clasifican en seis familias,
a saber, oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas
y ligasas.1
Las oxidorreductasas catalizan reacciones que involucran la transfe-
rencia de electrones, de átomos de hidrógeno y de oxígeno. Son enzi-
mas que intervienen en el metabolismo central de la célula, requieren
coenzimas y son estrictamente intracelulares. Las transferasas catalizan
reacciones de transferencia de grupos y desempeñan un papel crucial
en el metabolismo celular; al igual que las oxidorreductasas, la mayo-
ría de ellas requieren coenzimas y son de naturaleza intracelular. Las
hidrolasas son enzimas que catalizan reacciones de ruptura de enlaces
por acción del agua y cumplen una función esencial en el catabolismo
celular. Las hidrolasas no requieren coenzimas pero algunas necesitan
cofactores inorgánicos; muchas de ellas son extracelulares, en particular
las depolimerasas, cuya función es degradar moléculas de gran tama-
ño que no pueden ser incorporadas a la célula y que de ese modo pue-
den ser asimiladas y usadas como nutrientes; la mayoría de las enzimas
empleadas a nivel industrial pertenecen a esta categoría. Las liasas son
enzimas que catalizan reacciones de ruptura no hidrolítica de enlaces y
cumplen diversas funciones no solo en el catabolismo celular sino tam-
bién en biosíntesis, puesto que pueden catalizar la reacción en ambos
sentidos según las necesidades metabólicas de la célula. La mayor parte
de las liasas son intracelulares pero por lo general no requieren coen-
zimas. Las isomerasas son enzimas que catalizan reacciones de isome-
rización, esto es la conversión entre moléculas con el mismo número
y tipo de átomos, y de acuerdo con el tipo de isomería se subclasifican
en racemasas y epimerasas, cis-trans-isomerasas, oxidorreductasas in-
tramoleculares, transferasas (mutasas) y liasas intramoleculares. La ma-
yoría de las isomerasas son intracelulares y algunas de ellas requieren
cofactores inorgánicos pero no coenzimas. Las ligasas son las enzimas
responsables de la fase anabólica y catalizan las reacciones cruciales de
1
<http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/>.

biosíntesis celular (se las denomina genéricamente sintetasas). Las li-
gasas tienen una estructura molecular compleja, son estrictamente in-
tracelulares y requieren coenzimas. Su acción suele estar acoplada con
reacciones de hidrólisis de compuestos ricos en energía.
Esta clasificación adquiere mucho sentido en relación con el poten-
cial de las enzimas como catalizadores de procesos. Uno de los aspec-
tos de mayor relevancia tecnológica es el requerimiento de coenzimas,
entendidas estas como moléculas orgánicas de bajo peso molecular
que se unen en forma reversible a la enzima, toman parte activa en
la catálisis y son de naturaleza estequiométrica respecto del sustrato
transformado (Kula, 2002). Las coenzimas usualmente funcionan como
portadores de electrones, átomos específicos o grupos funcionales y
después de actuar se disocian de la enzima. A veces estas coenzimas
se denominan cofactores disociables o cofactores estequiométricos. El uso de
estas enzimas como catalizadores de procesos supone un alto grado
de complejidad tecnológica pues la coenzima debe ser regenerada para
cerrar el ciclo catalítico, lo que en la práctica exige un sistema auxiliar
que involucra una segunda enzima y un segundo sustrato, con el solo
objeto de reconvertir la coenzima (Schmid et al., 2001; Woodyer et al.,
2006). Desde una perspectiva tecnológica el uso de células enteras con
capacidad intrínseca de regenerar cofactores puede ser un alternati-
va viable en este caso pese a los inconvenientes asociados con la pér-
dida de especificidad y los eventuales problemas de transferencia de
masa hacia el interior de la célula y de allí al exterior (Guisán, 2006).
No obstante, las enzimas que no requieren coenzimas pueden reque-
rir cofactores para la expresión de su funcionalidad; estos cofactores
por lo general son iones metálicos que intervienen en el mecanismo
catalítico y que se unen fuertemente a la estructura enzimática sin
disociarse como consecuencia de la catálisis. Estos cofactores suelen
denominarse cofactores ligados o cofactores catalíticos. A diferencia del
caso anterior, el requerimiento de cofactores de este tipo no supone
una mayor complejidad tecnológica porque al no disociarse el cofactor
de la enzima su función es de carácter igualmente catalítico. Por ende,
las enzimas pueden clasificarse en enzimas sin requerimiento de nin-
gún tipo de cofactor, enzimas con requerimiento de cofactores ligados
(de naturaleza catalítica) y enzimas con requerimiento de coenzimas
(cofactores disociables de naturaleza estequiométrica), lo que se ilus-
tra en la figura 1.

FIGURA 1. Representación esquemática de la catálisis enzimática. 1, enzima sin
requerimiento de cofactores; 2, enzima con requerimiento de cofactores ligados
(catalíticos) y 3, enzima con requerimiento de coenzimas (cofactores disociables
o estequiométricos)
S P
1 E E
CoE
S
2 E E - CoE
P
CoE
3 E E E - CoE
CoE’
P S
Otro aspecto de relevancia tecnológica es la condición de la enzima

en relación con la célula en la que se origina. Desde esta perspectiva
las enzimas pueden catalogarse en extracelulares y asociadas con células.
Las primeras son excretadas por la célula y por lo general consisten en
proteínas de estructura relativamente simple, robustas y sin requerimientos
de coenzimas, características particularmente atractivas para su uso como
biocatalizadores de procesos. Las enzimas asociadas con células pueden
ser de naturaleza periplasmática, citoplasmática o asociada con estruc-
turas celulares como membranas u orgánulos. Por lo general se trata de
moléculas de mayor complejidad estructural, lábiles y con requerimiento
de cofactores disociables, lo que en principio dificulta su empleo como
catalizadores de procesos. A ello debe agregarse el mayor costo que re-
presenta su producción, como se explicará más adelante.
Es fácil advertir la relación que existe entre la clasificación de las en-
zimas y su potencial tecnológico. De las seis familias, solo las hidrolasas
tienen alta relevancia tecnológica y por sus características están particu-

larmente dotadas para actuar como catalizadores de procesos, además de
la mayor simplicidad de su producción. Por otra parte, no solo pueden
catalizar reacciones de hidrólisis sino que además, en condiciones apro-
piadas, también pueden actuar en ambos sentidos y catalizar reacciones de
síntesis, lo que les confiere un gran potencial tecnológico (Bornscheuer y
Kazlauskas, 1999). De las enzimas restantes algunas liasas (Yamada y Ko-
bayashi, 1996; Thomas et al., 2002) y ciertas isomerasas (Crabb y Shetty,
1999) han sido usadas en gran escala como catalizadores industriales;
lo mismo ha sucedido más recientemente con algunas oxidorreducta-
sas, pese a la mayor complejidad ya destacada (Leuchtenberger et al.,
2005). Si bien ha habido notables avances en el uso de enzimas no hi-
drolíticas, lo que permite prever un significativo aumento del espectro
actual de usos (García-Junceda et al., 2004; Pollard y Woodley, 2006;
Thayer, 2006), las hidrolasas, robustas y accesibles a bajo costo, conti-
nuarán siendo las más relevantes no solo para procesos convencionales
de hidrólisis sino también en reacciones de síntesis orgánica (actuan-
do en ambos sentidos) y en medios no convencionales. A continuación
se presenta un análisis pormenorizado de las aplicaciones industriales
de las enzimas.
APLICACIONES DE LAS ENZIMAS:

ENZIMAS COMO CATALIZADORES DE PROCESOS
Más del 80% del mercado de las enzimas está dirigido a su uso industrial
como catalizadores de procesos. No obstante, su impacto tecnológico no
se circunscribe al ámbito industrial y existen importantes aplicaciones
en campos como el análisis químico y clínico, la biomedicina y la inves-
tigación experimental. El alto grado de especificidad y sensibilidad de
las enzimas las hace atractivas en análisis porque mediante su acción es
posible detectar analitos (sustrato o coenzima que la acción enzimática
convierte en una señal detectable) en muy bajas concentraciones con un
mínimo de interferencias. El problema asociado con la baja estabilidad
de las enzimas ha sido resuelto mediante el uso de enzimas inmoviliza-
das que incrementan la vida útil del dispositivo. Así se han desarrollado
electrodos enzimáticos muy robustos en los que el analito es converti-
do por la enzima inmovilizada dentro del dispositivo (usualmente en
la forma de una membrana) y el producto formado es detectado por

un electrodo convencional (de pH, de oxígeno disuelto) o específico
para iones. Esos electrodos se emplean en sectores como la industria
alimentaria (Richter, 1993) y de fermentaciones (Schügerl, 2001). El
desarrollo de sistemas enzimáticos de análisis ha sido paralelo al de la
inmovilización de las enzimas de modo que actualmente se dispone de
sistemas muy compactos y de microsensores (Hanbin et al., 2002; Xu
et al., 2007). Para el futuro se esperan grandes avances asociados con
el desarrollo de la nanobiocatálisis (Trojanowicz, 2006; Wang, 2008).
El uso de enzimas en análisis clínico, en kits de diagnóstico y como
reveladores en inmunoensayos también es muy relevante (Christensen
et al., 1990; Yamamoto et al., 2000; Yakovleva et al., 2002). Las enzimas
tienen un gran potencial de aplicación en el tratamiento de trastornos o
deficiencias del metabolismo; a modo de ejemplo puede mencionarse el
uso de fenilalanina amonio liasa en pacientes fenilcetonúricos (Ikeda et
al., 2005), de asparaginasa en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer
(Duval et al., 2002; Verma et al., 2007), de estreptoquinasa y uroqui-
nasa en el tratamiento de la trombosis coronaria (Hoffmeister et al.,
1998; Ouriel et al., 1998) y de ureasa y uricasa como coadyuvantes del
proceso de hemodiálisis en pacientes con disfunción renal (Ayhan et
al., 2002; Qin y Cabral, 2002; Wortmann, 2005). Las enzimas también
son herramientas fundamentales en diversas áreas de la biotecnología,
con una relevancia especial en ingeniería genética y biología molecular.
Las endonucleasas de restricción son esenciales en el procesamiento de
genes y junto con otras enzimas, como las ligasas, representan la base
de las técnicas del ADN recombinante (Pingoud, 2004); a su vez, las
ADN polimerasas termoestables son esenciales para la amplificación
de material genético mediante pcr, herramienta fundamental en la
biología molecular y su proyección biotecnológica (Bartlett y Stirling,
2003). Las enzimas empleadas en investigación, aunque producidas en
pequeña escala, generalmente se obtienen con un alto grado de pureza
a precios elevados y representan una fracción significativa del mercado
de enzimas.
El uso industrial de enzimas representa más del 80% del mercado
mundial; en la industria las enzimas se emplean en procesos en los que
la reacción enzimática es el paso clave en la elaboración del producto
deseado y en procesos en los que la enzima se utiliza en calidad de adi-
tivo para mejorar alguna propiedad funcional del producto. En el pri-
mer caso las enzimas se usan en condiciones optimizadas respecto de

su potencial catalítico mientras que en el segundo las condiciones del
proceso están determinadas por el producto en cuya elaboración inter-
vienen las enzimas, lo que por lo general implica condiciones no opti-
mizadas y muchas veces no controladas respecto de ellas. Un ejemplo
del primer tipo de proceso es la elaboración de jarabes de alto conte-
nido de fructosa a partir del almidón, un proceso en el que intervienen
en secuencia tres enzimas: la α-amilasa que degrada el almidón a dex-
trinas mediante una acción hidrolítica aleatoria sobre enlaces α-1-4,
la glucoamilasa que hidroliza secuencialmente los enlaces α-1-4 des-
de un extremo de la molécula de dextrina para producir glucosa como
principal producto de hidrólisis y, finalmente, la glucosa isomerasa que
isomeriza la glucosa a fructosa. Las dos primeras enzimas por lo ge-
neral se usan disueltas en el medio de reacción mientras que la tercera
se emplea en forma inmovilizada en reactores de operación continua
(Cheetham, 1994; Crabb y Mitchinson, 1997). Otros procesos indus-
triales de gran escala en los que se emplean enzimas en condiciones
optimizadas y altamente controladas son la producción de acrilamida
mediante nitrilo hidratasa (Miller y Nagarajan, 2000), la producción de
ácido 6-amino penicilánico mediante penicilina acilasa (Illanes y Wil-
son, 2006) y la producción de ácido l-aspártico mediante aspartato-
amonio liasa (Gill et al., 1996).
A pesar de los grandes avances logrados en la biocatálisis enzimáti-
ca, la mayor parte de las aplicaciones industriales de las enzimas toda-
vía se limitan al uso convencional de hidrolasas como catalizadores de
procesos o aditivos para la industria de los alimentos, la de los deter-
gentes, la textil y la del cuero, como puede apreciarse en el cuadro 2. La
industria alimentaria es la que más enzimas consume aunque es pro-
bable que sea el rubro industrial de menor tasa de crecimiento (Illanes,
2000; Whitehurst y Law, 2002). En el cuadro 3 se presenta una lista
de las enzimas no hidrolíticas de relevancia industrial; los casos más
notables son los de la glucosa isomerasa (Olsen, 2002) y la nitrilo hi-
dratasa (Liese et al., 2006), ambas tecnologías asociadas con el uso de
biocatalizadores inmovilizados. Recientemente se publicó un análisis
más detallado de las aplicaciones convencionales de las enzimas como
catalizadores de procesos (Illanes, 2009).
El mercado mundial de enzimas para uso industrial ha tenido una
notable evolución en las últimas décadas: en 1970 se estimaba un valor
de ventas de alrededor de 50 millones de dólares, en 1988 esa cifra había

aumentado en más de un orden de magnitud a un valor estimado de 570
millones de la misma moneda (Uhlig, 1998), en 1995 el valor calculado
se hallaba entre los 800 y los 1.000 millones y en 2004 las ventas ha-
bían subido por encima de los 2.000 millones con un valor proyectado
a 2009 de 2.400 millones. El 52% de ese mercado corresponde al uso
masivo de enzimas en detergentes, textiles y curtiembre, el 37% al ru-
bro de la alimentación humana y el 11% al de la alimentación animal;
la mayor parte corresponde a enzimas hidrolíticas empleadas de forma
convencional (Hasan et al., 2006). Sin embargo, existe un mercado in-
cipiente pero ya significativo para nuevas aplicaciones de enzimas en
la industria farmacéutica y de síntesis química fina (Bornscheuer y Ka-
zlauskas, 1999; Schmid et al., 2001). Las cifras señaladas no reflejan el
verdadero potencial de las enzimas industriales por cuanto productores
de importancia como China, Corea y la India no están registrados en
ellas y además por la existencia de un mercado cautivo de gran magni-
tud en el que los usuarios de las enzimas son sus propios productores
o lo son en consorcio con otras empresas. Las cifras indicadas pueden
duplicarse si se atienden estas consideraciones.
Las enzimas se están utilizando de una manera todavía no significa-
tiva pero creciente en el manejo ambiental y el tratamiento de residuos.
Se las emplea para la remoción de compuestos químicos recalcitrantes
presentes en efluentes industriales (López et al., 2004) o como agentes
de pulido en el tratamiento de efluentes municipales a fin de reforzar el
potencial hidrolítico de la población microbiana (Cammarota y Freire,
2006) y cumplir con los requerimientos de vertido (Aitken, 1993).
La inmovilización de las enzimas permite elaborar biocatalizadores
con excelentes propiedades de modo que su empleo ha ido aumen-
tando en forma continua. A los procesos de gran escala más relevan-
tes ya señalados puede agregarse un número creciente de aplicaciones
en reacciones de síntesis orgánica tanto en medios acuosos como en
medios no convencionales (Guisán, 2006). El desarrollo reciente de
la nanobiotecnología abre nuevas opciones para el uso de enzimas
como catalizadores de proceso porque permite obtener catalizado-
res tan estables como mediante la inmovilización en soportes, con la
ventaja adicional de que están esencialmente libres de restricciones di-
fusionales (Wang, 2006; Kim et al., 2008), lo que puede repercutir de
un modo muy favorable sobre la eficiencia de uso del biocatalizador
(Illanes et al., 2008a).

CUADRO 2. Enzimas hidrolíticas de relevancia industrial
Enzima Origen Aplicación

Carbohidrasas
α-amilasa Mohos, bacterias Panadería, confitería, hidrólisis del almidón,
detergentes, desgomado de telas
β-amilasa y pululanasa Plantas, bacterias Jarabe de glucosa
Pectinasa Mohos Extracción y clarificación de jugos, vinificación
Celulasa Mohos Extracción y clarificación de jugos; gastado de
telas, detergentes, ayuda-digestivos, bioetanol
Fitasa Bacterias Nutrición animal
β-glucanasa Mohos Nutrición animal, cervecería
Glucoamilasa Mohos Jarabe de glucosa
Hemicelulasa Mohos, bacterias Panadería, blanqueo de pulpa de madera
Invertasa Levaduras, mohos Confitería
Lactasa Levaduras, mohos, Leche y lácteos deslactosados, valoración de
suero de quesería
Naringinasa Mohos Eliminación del amargor en jugos
Proteasas
Aminopeptidasa Mohos, bacterias Eliminación del amargor en hidrolizados
proteicos
Bromelina Piña Antiinflamatorio; tratamiento de quemaduras,
coadyuvante farmacéutico
Papaína Papaya Extractos de levadura y carne; clarificación
de cerveza, ablandamiento de carne, curtido
de cueros, nutrición animal, ayuda-digestivo,
antiinflamatorio
Pepsina Animal Quesería
Proteasa neutra Mohos, bacterias Panadería, hidrolizados proteicos
Proteasa alcalina Bacterias Detergentes, recuperación de agua de cola
Renina Animal, levaduras y mohos Quesería
recombinantes
Otras hidrolasas
Aminoacilasa Mohos Suplementos nutricionales
Lipasa Animal, bacterias, Saborizante en productos lácteos y cárnicos,
levaduras, mohos detergentes, grasas especiales
Pancreatina Animal Ayuda-digestivo, curtiembre
Penicilina acilasa Bacterias, mohos Precursores de antibióticos β-lactámicos
Ureasa Bacterias Eliminación de urea en bebidas alcohólicas

CUADRO 3. Enzimas no hidrolíticas de relevancia industrial
Enzima Origen Aplicación
Aspartato-amonio liasa Bacterias Producción de ácido l-aspártico
Catalasa Bacterias Preservación de alimentos,

remoción de peróxido en la leche
Glucosa isomerasa Bacterias, actinomicetos Jarabe de fructosa
Glucosa oxidasa Mohos Preservación de alimentos
Lactamasa -α-amino-ε- Bacterias Producción de l-lisina

caprolactama racemasa
Nitrilo hidratasa Bacterias Acrilamida
PRODUCCIÓN DE BIOCATALIZADORES ENZIMÁTICOS PARA USO INDUSTRIAL
En la producción de enzimas se consideran procesos de muy diversa

naturaleza y envergadura que pueden incluirse dentro de un espectro
que abarca desde procesos de gran escala orientados a producir enzimas
de un nivel de pureza y un costo relativamente bajos hasta procesos de
pequeña escala en los que usualmente se emplean enzimas de alto grado
de pureza y elevado costo unitario (Headon y Walsh, 1994; Hodgson,
1994; Thomas et al., 2002). El proceso de producción está definido en
gran medida por esas características y por la fuente y la localización de
la enzima respecto de la célula que la produce. Las enzimas de origen
vegetal o animal simplemente se extraen de los respectivos tejidos o se
recuperan de los líquidos o exudados correspondientes mientras que
las de origen microbiano se producen por fermentación y se recuperan
del caldo de fermentación, si son extracelulares, o se extraen de la pasta
celular mediante ruptura o permeabilización celular si son intracelula-
res (Aehle, 2003). En la figura 2 se muestra un esquema general de la
producción de enzimas en el que pueden identificarse cuatro etapas:
la de síntesis, que considera la propagación del cultivo celular que la
produce; la de recuperación, que se refiere a la extracción de la enzima
del sistema celular y que considera etapas de separación sólido-líquido
y de extracción celular o concentración; la de purificación, cuyo propó-

FIGURA 2. Esquema de producción de enzimas. F: fermentación; S: separación
sólido-líquido; C: concentración; E: extracción; Pi: operaciones de purificación;
D: desecado; F i: operaciones de formulación
C
F
P1 P2 Pn D
F1 F2
E S
sito es eliminar contaminantes –principalmente otras proteínas–; y la

de formulación, que incluye un conjunto de operaciones de acabado y
normalización cuya finalidad es dar al producto enzimático su presen-
tación final, es decir la que tendrá cuando sea distribuido y utilizado.
La mayor parte de las enzimas de uso industrial son producidas por
fermentación microbiana. En la actualidad la fermentación sumergida
es una tecnología altamente desarrollada y automatizada que se emplea
en la producción de casi todas las enzimas utilizadas en la industria
(El-Mansi et al., 2007), incluidas las propias del genoma microbiano
y también las producidas mediante la expresión de genes foráneos en
calidad de proteínas recombinantes (Barredo, 2005). No obstante, la
fermentación en estado sólido es una buena alternativa en el caso de
los microorganismos de tipo filamentoso y hay varias enzimas hidro-
líticas de importancia industrial que se producen con esta tecnología
(Mitchell et al., 2006). La fermentación sumergida puede llevarse a
cabo con diferentes modalidades de operación. La más tradicional es

la fermentación por lotes (batch), en la que el proceso se detiene en el
punto de mayor nivel de producción de la enzima y se recuperan las
células o el caldo fermentado según se trate de enzimas intracelulares
o extracelulares, respectivamente. La fermentación por lote alimenta-
do (fed-batch) es una variante en la que en cierto punto del cultivo el
reactor comienza a ser alimentado con medio de cultivo fresco hasta
determinado volumen final, una vez alcanzado el cual se procede como
en el caso anterior. Esta modalidad de cultivo es muy atractiva para la
producción de enzimas porque permite controlar la respuesta metabó-
lica de las células y su operación es simple (Acevedo y Gentina, 1996;
Cereghino et al., 2002). Otra modalidad de cultivo muy empleada a es-
cala de laboratorio es la fermentación continua, en la que el medio de
cultivo es alimentado en forma continua al reactor mientras que el cal-
do fermentado se retira a la misma velocidad de modo que el volumen
existente en el fermentador permanece constante. Aunque esta moda-
lidad ofrece claras ventajas en cuanto a mayor productividad y control
del estado fisiológico de las células, su aplicación industrial es escasa
debido al alto riesgo de contaminación y mutación que puede producir
el lavado de la cepa productora del cultivo (Acevedo et al., 2004). La
localización de la enzima es un aspecto muy importante; en principio
es deseable que sea excretada al medio durante la fermentación por-
que eso facilitará las operaciones posteriores. De hecho, un porcentaje
considerable de las enzimas de importancia industrial son de naturale-
za extracelular y actualmente es posible lograr esa condición mediante
la manipulación genética de la cepa productora (Becerra et al., 1997;
Hatti-Kaul y Mattiasson, 2003).
La actividad específica (unidades de actividad enzimática produci-
das por unidad de masa celular) es un parámetro de gran relevancia por
lo que se ha destinado mucho esfuerzo a incrementarla mediante ma-
nipulaciones tanto genéticas como ambientales. Su incremento reduce
los costos de la fermentación y también de las operaciones posteriores
de recuperación y purificación. La actividad específica puede ser incre-
mentada sustancialmente mediante manipulación ambiental a través del
diseño del medio de cultivo y la optimización de variables operacionales
claves como la temperatura, el pH y el nivel de aireación y agitación.
El diseño del medio de cultivo es esencial por cuanto la síntesis enzi-
mática está sujeta a diferentes tipos de control (inducción, represión
catabólica, retrorrepresión) que pueden ser adecuadamente manipula-

dos incorporando u omitiendo las señales que activan tales mecanismos
de control. La cepa productora debe ser considerada segura en relación
con el uso de la enzima; por ejemplo, en el caso de las enzimas para uso
alimentario o farmacéutico se requiere un sello de calidad como el se-
llo gras, que es otorgado por la fda (Food and Drug Administration)
de los Estados Unidos de Norteamérica. Obtener ese sello de calidad
puede resultar muy caro y sumamente engorroso por lo que una buena
opción para producir la enzima es clonar el gen respectivo en una cepa
productora que ya lo posea (Domínguez et al., 1998).
Después de la etapa de síntesis la enzima debe ser recuperada del
sistema celular, lo que implica la separación de las células del cal-
do fermentado. Esta operación puede realizarse por centrifugación
o (micro) filtración, lo que depende de la naturaleza del organismo
productor (Medronho, 2003). Si la enzima es extracelular se remueve
la pasta celular y el caldo clarificado se somete a concentración antes
de su eventual purificación. Existen diversas opciones para la con-
centración del caldo clarificado pero hoy en día se prefiere emplear
la ultrafiltración porque es menos desnaturalizante y se trata de un
sistema modular fácilmente escalable (Ulbert et al., 2003). Esta ope-
ración representa la principal dificultad en la producción de enzimas
extracelulares porque aun en el caso de los cultivos celulares densos
la concentración de proteína excretada rara vez sobrepasa unos pocos
gramos por litro y es necesario concentrar en al menos un orden de
magnitud, lo que puede resultar muy costoso (Liu et al., 2000). En
contrapartida, el caldo concentrado contiene poco material contami-
nante porque la propia membrana celular provee una alta selectividad
de manera que es usual que no se requiera mayor purificación y que
en muchos casos ese caldo, clarificado y concentrado, pueda ser so-
metido directamente a las operaciones de acabado y formulación. Si
la enzima es intracelular o permanece asociada con la célula debe ser
extraída y existen diversas operaciones que consideran la disrupción
de los envoltorios celulares o la permeabilización celular. La disrup-
ción celular es particularmente difícil en el caso de los microorganis-
mos debido a la naturaleza resiliente de sus envoltorios celulares. Las
enzimas periplasmáticas constituyen una excepción porque pueden
ser extraídas por procedimientos muy suaves, como el golpe osmóti-
co, que producen una liberación selectiva que favorece las operacio-
nes posteriores de purificación por cuanto la mayoría de las proteínas

CUADRO 4. Métodos de extracción de enzimas intracelulares
Métodos Principio Aplicación en Referencia

gran escala
Disrupción celular
Prensado Compresión, esfuerzo de corte Moderada Foster, 1995
Homogeneización Esfuerzo de corte, cavitación Factible Kleinig y Middelberg,

1998
Molienda Compresión, esfuerzo de corte Factible Singh et al., 2005
Sonicación Cavitación Moderada Aehle, 2003
Descompresión Descompresión explosiva Moderada
Congelación-descongelación Esfuerzo de corte Escasa
Dispersión en agua Golpe osmótico Escasa
Termólisis Ruptura de la pared celular Escasa Ren et al., 2007
Permeabilización celular
Tratamiento alcalino Digestión de la pared celular Escasa Wiseman, 1995
Tratamiento con solvente Digestión de la membrana Moderada Panesar et al., 2007
Lisis enzimática Digestión de la pared celular, Factible Salazar y Asenjo, 2007

golpe osmótico
Autólisis Digestión de la pared celular, Factible Illanes y Gorgollón, 1983

golpe osmótico
intracelulares permanecen asociadas con la célula (Fonseca y Cabral,

2002). En el cuadro 4 se mencionan los métodos más relevantes para
la extracción de enzimas intracelulares y se destaca la factibilidad de
su aplicación industrial.
La disrupción celular es una operación clave en la producción de
enzimas intracelulares debido a su elevado costo y dificultad de esca-
lamiento. El sistema debe ser optimizado en términos de las variables
operacionales claves, de modo de maximizar la cantidad de enzima
activa recuperada, lo que implica resolver de manera óptima el com-
promiso entre disrupción celular e inactivación enzimática. Para ello

es necesario disponer de expresiones para la cinética de liberación de
proteína y de inactivación de la proteína enzimática liberada, explí-
citas respecto de variables operacionales claves, como la temperatu-
ra. En diversas publicaciones se ha analizado en profundidad el tema
de la extracción de enzimas intracelulares (Cumming y Iceton, 2001;
Illanes, 2008).
El extracto crudo clarificado (luego de remover los fragmentos ce-
lulares) que contiene la enzima intracelular (o el caldo concentrado
con la enzima extracelular) se somete a purificación con el propósi-
to principal de remover las proteínas contaminantes que puedan in-
terferir sobre el uso posterior de la enzima. La purificación también
puede tener por objeto aumentar la actividad específica del prepara-
do enzimático, un factor importante si la enzima va a ser empleada
en forma inmovilizada. La purificación resulta bastante más compleja en
el caso de las enzimas intracelulares, en las que por lo general será
necesario remover una gran cantidad de proteínas y otros materiales
del interior de la célula. La purificación enzimática se concibe como
una serie de operaciones de fraccionamiento proteico en las que las
proteínas contaminantes van siendo removidas en forma progresiva.
Existe una relación entre el grado de pureza que se desea lograr y el
rendimiento de la recuperación enzimática porque cada operación de
purificación incrementa la actividad específica pero produce cierto
nivel de pérdida de actividad. Se dispone de numerosas técnicas de
fraccionamiento pero son difíciles de escalar y de alto costo por lo
que en el caso de las enzimas de uso industrial el criterio de purifi-
cación es el mínimo compatible con el uso de la enzima. En lo que se
refiere a las enzimas empleadas en análisis o biomedicina el criterio
es completamente diferente porque en este caso no se puede sacrifi-
car el nivel de pureza requerido por consideraciones de rendimiento
(Ladisch et al., 1998). A gran escala, además del factor de purificación
y el rendimiento deben considerarse la capacidad de procesamiento y
la velocidad de operación al seleccionar el protocolo de purificación
más adecuado. Los métodos de purificación pueden dividirse en los
basados en precipitación diferencial (mediante adición de sales, sol-
ventes o polímeros) y los basados en la retención selectiva en una
matriz (cromatografía). Los primeros tienen un potencial de purifi-
cación modesto pero son operaciones simples y de fácil escalamiento.
Por el contrario las cromatografías, basadas en interacciones de tipo

fisicoquímico (cromatografía de exclusión molecular, de intercambio
iónico, de adsorción, hidrófoba) o biológico (cromatografía de afini-
dad), tienen un potencial de purificación mayor pero son operaciones
costosas y difíciles de escalar. La mayoría de los protocolos de purifi-
cación reportados a escala de laboratorio son poco aplicables a escala
productiva porque involucran varias operaciones de alto costo y solo
permiten obtener rendimientos muy bajos de recuperación enzimáti-
ca y productividades también muy bajas (Sian et al., 2005; Patel et al.,
2006). Existen algunos criterios orientadores para diseñar una estra-
tegia de purificación: se recomienda que se seleccionen operaciones
basadas en propiedades fisicoquímicas o biológicas en las que exista
una marcada diferencia entre la enzima por purificar y las proteínas
contaminantes y que las operaciones más simples se empleen como
etapas iniciales para reducir el volumen del proceso y las más costo-
sas y selectivas se dejen para etapas posteriores, cuando el volumen
por procesar se haya reducido (Watanabe et al., 1994). Se dispone de
estrategias racionales de purificación enzimática basadas en sistemas
experto que permiten optimizar la secuencia de operaciones (Vásquez-
Álvarez et al., 2001; Simeonidis et al., 2005). En los últimos años se
han publicado revisiones muy completas sobre purificación enzimá-
tica (Roe, 2001; Rosenberg, 2004).
Una vez purificada la enzima hasta el nivel requerido, el prepara-
do debe ser formulado de acuerdo con su uso. Aunque no se le presta
mayor atención en la literatura científica, la formulación es una etapa
crucial porque, en particular en el caso de las enzimas de uso indus-
trial, es la que confiere al producto enzimático su presentación final y
sus cualidades como biocatalizador; por lo tanto, representa un aspecto
clave en cuanto a la competitividad del producto en el mercado (Chaplin
y Bucke, 1990); por ese motivo los productores de enzimas mantienen
esas operaciones en secreto o las revelan a los usuarios bajo acuerdos de
confidencialidad. La etapa de formulación incluye operaciones de aca-
bado y de normalización. El acabado comprende operaciones de remo-
ción de sales y ajuste de pH y operaciones de secado en el caso de la
formulación de preparados enzimáticos sólidos. La formulación como
sólido o líquido concentrado está determinada en gran medida por
el uso posterior de la enzima y existen ventajas y desventajas en cada
tipo de formulación: la producción como sólido tiene la ventaja de su
mayor estabilidad de almacenamiento y su facilidad de transporte pero

el manejo del producto es más riesgoso debido a la formación de aero-
soles y además puede dificultar su uso y dosificación. El secado al va-
cío y el secado por atomización son las operaciones usuales de secado
(Fickers et al., 2006), aunque en algunos casos la liofilización también
se utiliza, pese a su alto costo, cuando la enzima va a ser empleada
en reacciones de síntesis en medios no convencionales (Gupta y Roy,
2004). El producto enzimático debe ser estabilizado para que tenga
una vida útil de almacenamiento adecuado. Eso se logra mediante el
empleo de agentes estabilizantes, los que suelen emplearse en calidad
de excipiente para normalizar el producto enzimático en cuanto a su
actividad específica (unidades de actividad por unidad de volumen o
masa de producto) y estabilidad de almacenamiento (tiempo de vida
media). La información sobre la composición del producto enzimático
y el tipo de excipiente utilizado en su normalización usualmente no
es proporcionada por el productor de la enzima, aunque es muy rele-
vante para el usuario, que por lo general debe acondicionar la enzima
antes de su empleo. Todos los productos enzimáticos deben satisfacer
requerimientos de calidad y seguridad en relación con su uso, lo que
debe ser garantizado por las correspondientes agencias reguladoras. La
producción debe efectuarse de acuerdo con buenas prácticas de manu-
factura (good manufacturing practices o gmp) y muchos productores de
enzimas tienen sus procesos debidamente certificados de acuerdo con
normas iso. Hace poco se publicó un análisis pormenorizado de las
operaciones de formulación de preparados enzimáticos (Illanes, 2008).
Las enzimas pueden ser comercializadas en forma inmovilizada y en
ese caso la inmovilización no es una mera operación de acabado para
incrementar la estabilidad de almacenamiento del preparado sino que
representa un tipo de biocatalizador con eficiencia de uso incremen-
tada, lo que influirá en gran medida sobre el proceso de utilización
de la enzima. La inmovilización de enzimas, como ya se ha señalado,
representa uno de los grandes avances tecnológicos en biocatálisis y
hay un número creciente de procesos industriales que utilizan las en-
zimas en forma inmovilizada y un vigoroso desarrollo tecnológico en
la elaboración de enzimas inmovilizadas mediante el diseño racional
de soportes y protocolos de inmovilización (Guisán, 2006). Las di-
versas estrategias de inmovilización de enzimas han sido analizadas
recientemente en relación con la elaboración de biocatalizadores para
uso industrial (Illanes et al., 2008a).

PROCESOS ENZIMÁTICOS PARA REACCIONES DE HIDRÓLISIS Y SÍNTESIS
Las aplicaciones industriales de las enzimas consisten en su mayor parte

en el uso de hidrolasas en reacciones de hidrólisis en medio acuoso para
la degradación de moléculas complejas (con frecuencia poliméricas) en
moléculas más simples con un valor agregado potencial modesto, como
se describió anteriormente (Neidelman, 1991). Las razones son eviden-
tes puesto que se trata de enzimas robustas, por lo general extracelulares
y sin requerimientos de cofactores, propiedades que las tornan ideales
como catalizadores de procesos.
No obstante, la tendencia actual consiste en usarlas en procesos
de síntesis orgánica con un valor agregado potencial mucho mayor.
El empleo de enzimas en procesos de este tipo, a pesar de su gran
potencialidad, ha sido difícil porque se trata de sistemas más com-
plejos, y de incursionar en una clase de industria no habituada al
uso de insumos de tipo biológico. En este contexto, las enzimas han
sido consideradas demasiado costosas, inestables, con capacidad de
actuar solo sobre sus sustratos naturales en ambientes acuosos, con
una especificidad muy estrecha y en muchos casos con requerimien-
tos de coenzimas de alto costo (Bommarius y Riebel, 2004). Muchas
de estas apreciaciones pueden ser refutadas mientras que otras están
siendo resueltas a través de avances tecnológicos muy significativos.
Los avances en ingeniería genética e ingeniería de proteínas y el des-
cubrimiento de nuevas cepas y genes mediante modernas técnicas de
selección y metagenómica han ampliado considerablemente el rango
de enzimas disponibles y han reducido sus costos. Aunque es cierto
que las enzimas son catalizadores inestables, los avances en estabi-
lización enzimática también son notables (Illanes, 1999; Ó’Fágáin,
2003). Por otra parte, las enzimas ya no pueden ser consideradas solo
como catalizadores aptos en medios acuosos por cuanto existe una
gran cantidad de información que da cuenta de los éxitos logrados
en catálisis enzimática en medios no convencionales (Ballesteros et
al., 1995; Hari Krishna, 2002), entre los que se destacan los medios
orgánicos con cosolventes (Torres y Castro, 2004) y solventes hi-
drófobos (Clark, 2004; Hudson et al., 2005) y, más recientemente,
los líquidos iónicos (Park y Kazlauskas, 2003; van Rantwijk et al.,
2003). El reemplazo del agua por un solvente orgánico como medio
de reacción ofrece ventajas potenciales como la opción de catalizar

reacciones con una termodinámica desfavorable y el uso de sustratos
poco solubles en agua; no obstante, pese a exhibir una actividad re-
lativamente baja las enzimas pueden ser muy estables en estos me-
dios, los riesgos de contaminación son menores, la recuperación del
producto y del biocatalizador puede ser más simple que en un medio
acuoso y es posible reducir los efectos de inhibición por producto
trabajando en sistemas bifásicos (Gupta y Roy, 2004). En cuanto a
los líquidos iónicos, estos muestran propiedades interesantes como
medios de reacción porque además de ser solventes menos agresivos
son compatibles con el ambiente y en ocasiones las enzimas son muy
estables (Ulbert et al., 2005) y más enantioselectivas en ellos que en
otros medios de reacción (Durand et al., 2007).
Pese a sus limitaciones, en la actualidad las enzimas se consideran
catalizadores muy atractivos para reacciones de síntesis orgánica por-
que satisfacen los principios fundamentales de la química verde y el
desarrollo sostenible (Bommarius y Riebel, 2004). Además, debido a
su alto grado de regioselectividad y enantioselectividad son particu-
larmente atractivas para la producción de fármacos y otros productos
bioactivos (García-Junceda et al., 2004).
Las enzimas cuya función metabólica es la catálisis de reacciones
de síntesis son proteínas complejas, lábiles y con requerimientos de
coenzimas, lo que plantea complejos desafíos tecnológicos respecto
de su empleo como catalizadores de procesos porque deben ser esta-
bilizadas y las coenzimas retenidas y recicladas. Aunque su impacto
tecnológico todavía es escaso, ya existen procesos industriales de este
tipo, como lo ilustra el caso de la síntesis de ter-leucina, que es un
precursor de la síntesis de fármacos. En este caso, la enzima leucina
deshidrogenasa cataliza la aminación reductora de trimetilpiruvato
en un reactor de membrana que contiene la enzima y la coenzima,
nadh, que ha sido derivatizada con polietilenglicol; como reacción
de regeneración de la coenzima se emplea un sistema enzimático
auxiliar en el que la enzima formiato deshidrogenasa cataliza la oxi-
dación de ácido fórmico a dióxido de carbono, la coenzima vuelve
a su forma reducida y así se cierra el ciclo catalítico (Adlercreutz et
al., 1994).
De mayor relevancia tecnológica es el uso de hidrolasas como cata-
lizadores de reacciones de síntesis, actuando en la dirección contraria
a la hidrólisis. En efecto, las hidrolasas que catalizan la ruptura de

un tipo determinado de enlace en condiciones ambientales adecua-
das pueden catalizar la formación del mismo tipo de enlace: de este
modo, las proteasas pueden catalizar reacciones de síntesis de pépti-
dos (Kumar y Bhalla, 2005; Guzmán et al., 2007), las carbohidrasas
la síntesis de oligosacáridos y glicósidos (Bucke, 1996; Chockchai-
sawasdee et al., 2005), las lipasas reacciones de interesterificación y
transesterificación (Hasan et al., 2006; Petkar et al., 2006; Illanes et
al., 2008b) y las acilasas reacciones de síntesis de compuestos bio-
activos (Illanes y Wilson, 2006). Esta estrategia tiene una gran im-
portancia tecnológica porque las hidrolasas son biocatalizadores de
procesos ideales debido a que poseen una estructura robusta, no re-
quieren coenzimas, tienen una especificidad relativamente amplia res-
pecto de los sustratos y están disponibles a bajo costo (Bornscheuer
y Kazlauskas, 1999). Para explotar ese potencial es preciso deprimir
las reacciones de hidrólisis, lo que puede lograrse mediante la inge-
niería del medio de reacción empleando sistemas no convenciona-
les (no acuosos), entre los que se destacan los solventes orgánicos
(Klibanov, 2001; Ru et al., 2002), los líquidos iónicos (Durand et al.,
2007; Moniruzzaman et al., 2008) y los sistemas semisólidos (Erbel-
dinger et al., Youshko y Švedas, 2002; Basso et al., 2006). Entre ellos
los solventes orgánicos son los de mayor relevancia y la biocatálisis
enzimática en medio orgánico es uno de los temas más investigados
en los últimos veinte años (Koskinen y Klibanov, 1996; Gupta y Roy,
2004; Gotor et al., 2008).
La biocatálisis enzimática ha evolucionado desde procesos conven-
cionales en medio acuoso, donde los sustratos (y con frecuencia la enzi-
ma) se encuentran disueltos, a procesos de síntesis con diferentes tipos
de biocatalizadores en diferentes tipos de medios de reacción. Como
consecuencia, hay un amplio espectro de reacciones de relevancia en
síntesis química que hoy se están desarrollando mediante biocatálisis.
En el año 2000 se informó que cerca de 100 procesos de síntesis orgá-
nica habían alcanzado la etapa de desarrollo industrial, sobre todo para
la producción de precursores de fármacos y agroquímicos (Wandrey et
al., 2000), y que en tres de ellos la escala de producción era superior a
las 100 ton/año (Powell et al., 2001). Se anticipa que en las próximas
décadas llegarán nuevos productos de síntesis enzimática al mercado
y un número muy elevado de aplicaciones novedosas habrá logrado su
concreción a nivel industrial.

PRINCIPIOS DE DISEÑO DE REACTORES ENZIMÁTICOS
PARA CATÁLISIS EN FASE HOMOGÉNEA Y HETEROGÉNEA
Se entiende por reactor enzimático la unidad de proceso en la que la

enzima efectúa la conversión del sustrato escogido como materia prima
en el producto deseado. Los reactores enzimáticos pueden operar de
manera discontinua (por lotes o batch) o en forma continua. La prime-
ra modalidad emplea usualmente reactores de tipo agitado y se aplica
tanto a enzimas disueltas en el medio de reacción como a enzimas
insolubilizadas (inmovilizadas). En el caso de las enzimas disueltas el
catalizador se emplea una sola vez y su recuperación en general es difícil
y no justificable; en el caso de las enzimas inmovilizadas el biocataliza-
dor será recuperado de modo que el reactor operará en la modalidad de
lotes repetidos. Los procesos continuos se circunscriben a las enzimas
inmovilizadas, caso en el cual el biocatalizador puede ser retenido dentro
del reactor mientras la corriente de sustrato es alimentada al reactor y la
corriente de producto se remueve. La mayor limitación tecnológica para
el desarrollo de procesos enzimáticos radica en la labilidad intrínseca
de las enzimas en condiciones de proceso de modo que el estudio de
la estabilidad y la estabilización de dichas enzimas es un aspecto clave
para su desarrollo (Illanes y Wilson, 2004). En el caso de las enzimas
inmovilizadas el potencial catalítico de la enzima puede verse condi-
cionado por fenómenos de transferencia de masa que den origen a una
catálisis de tipo heterogéneo (Engasser y Horvath, 1976).
En la figura 3 se presenta un esquema de la construcción de un
modelo para el diseño y la evaluación del comportamiento de los reac-
tores. Los dos componentes básicos del modelo son la expresión ciné-
tica, que describe la reacción catalizada por la enzima, y el balance de
materia del proceso, que refleja la magnitud de la tarea productiva y el
modo de operación del reactor. El diseño básico de un reactor enzimá-
tico considera estos dos componentes y da origen a una ecuación de
comportamiento que establece una relación entre las variables funda-
mentales del proceso [carga enzimática (E), concentración de sustra-
to inicial o de ingreso (si), grado de conversión del sustrato en producto
(X) y tiempo de operación (t) en el caso de una operación por lotes o
flujo de alimentación de sustrato (F) en caso de operación continua].
Sin embargo, es preciso tener en cuenta otros componentes. La inac-
tivación enzimática durante la operación del reactor debe considerarse

independientemente de cuán estable sea la enzima puesto que la opera-
ción del reactor se conducirá necesariamente hasta un punto en el que
la enzima haya perdido una parte significativa de su actividad (Illanes y
Wilson, 2003). El componente de inactivación requiere que se disponga
de un modelo de inactivación que dé cuenta de la pérdida de actividad
en el tiempo; dicho modelo contiene constantes cinéticas de inacti-
vación que dependen fuertemente de la temperatura. En el caso de las
enzimas inmovilizadas la condición heterogénea de la catálisis requerirá
que se considere el impacto de la transferencia de masa como limitante
del proceso catalítico. Para ello será necesario disponer de un modelo
que dé cuenta del fenómeno de restricción difusional tanto en la vecin-
dad del soporte (restricciones difusionales externas) como dentro de la
estructura del biocatalizador (restricciones difusionales internas). Dicho
modelo se expresa en función de un módulo de efectividad (η) que re-
presenta la fracción del potencial catalítico de la enzima que se expresa
cuando hay restricciones difusionales y que a su vez es función de un
módulo (módulo de Damkoehler o α en el caso de las restricciones di-
fusionales externas y módulo de Thièle o Φ en el caso de las restriccio-
nes difusionales internas).
Un diseño básico implica que se disponga de una expresión cinética y
del balance de materia del proceso. La ecuación genérica que describe
el comportamiento de un reactor por lotes es:
FIGURA 3. Esquema de diseño y evaluación del comportamiento de los reactores
Modelo cinético
Balance materia
v = f (E, X)
Modelo de inactivación Restricciones difusionales

E = f (t, T) η = f (s0, Φ)
Modelo de comportamiento
η k ∙ E (t) = f (s1, X)
F ∙K

x t
∫ dX =∫ dt
0 v(e,X) 0 si Ec. 1
en donde X es el grado de conversión de sustrato en producto,
X = si - s
si
v es la velocidad de la reacción, que depende de la concentración de en-

zima (e) y del grado de conversión (X), s es la concentración de sustrato
en cualquier instante t y si es la concentración de sustrato inicial.
A modo de ejemplo, en el caso de una enzima que cataliza una re-
acción de acuerdo con una cinética simple de Michaelis-Menten
v = k∙e∙s
K + s Ec. 2
para un reactor que opere en la modalidad por lotes se obtiene la si-

guiente expresión:
si X - 1n(1 - X) = k ∙ e t
K K Ec. 3
en donde K es la constante de Michaelis del sustrato y k es la constante

de velocidad de la reacción. La ecuación 3 permite reducir en uno los
grados de libertad del sistema al establecer una relación necesaria entre
tiempo de operación, carga enzimática y grado de conversión. Así, po-
dría lograrse un mismo grado de conversión con diferentes combinacio-
nes de carga enzimática y tiempo de operación. Por lo tanto, el sistema
no queda completamente definido y persisten grados de libertad que
pueden emplearse para optimizar el proceso. Es posible obtener ecua-
ciones de comportamiento de reactores similares a la ecuación 3 para
diferentes modelos cinéticos (inhibición por productos, inhibición por
sustrato, reacciones con dos sustratos) y allí la expresión del miembro
izquierdo de la ecuación variará de acuerdo con el modelo cinético. La
ecuación 3 puede utilizarse para evaluar el comportamiento del reactor
(evolución del grado de conversión en el tiempo para una determinada

carga enzimática) o para el diseño del reactor (determinación del volu-
men requerido para obtener determinado grado de conversión al cabo
de un tiempo definido).
Para evaluar el comportamiento de un reactor enzimático o para
diseñarlo siempre debe tenerse en cuenta la pérdida de actividad en-
zimática que se produce durante la operación del reactor. Para ello es
necesario disponer de un modelo que describa la cinética de inactiva-
ción. Un modelo simple pero muy empleado es el basado en un meca-
nismo de primer orden:
- de = kD ∙ t
dt Ec. 4
con el que se obtiene por integración:
e = e0 ∙ exp(-kD) Ec. 5
en donde kD es la constante cinética de inactivación de primer or-

den, e es la actividad enzimática remanente luego de un tiempo t
de operación y e0 es la actividad enzimática inicial. La constante k D
depende fuertemente de la temperatura, en general de acuerdo con
una relación de tipo Arrhenius, pero también puede verse afectada por
la presencia de sustratos y productos de la reacción, lo que introduce
una complejidad mayor en el desarrollo de la ecuación de comporta-
miento del reactor (Illanes et al., 2001). Por cierto, existen mecanismos
más complejos de inactivación (multifásicos en serie y paralelo) que
derivan en modelos matemáticos que contienen un mayor número de
parámetros que deben ser determinados experimentalmente (Henley
y Sadana, 1986). Si se considera la inactivación enzimática de acuerdo
con la ecuación 5 la expresión que describe el comportamiento del
reactor es:
si X - 1n(1 - X) = k ∙ e0 [1 - exp(-kD ∙ t)]

K K ∙ kD Ec. 6
El impacto de la inactivación enzimática puede advertirse claramente

en la figura 4.

En el caso de las enzimas inmovilizadas las restricciones difusio-
nales pueden condicionar el potencial catalítico de la enzima, sea que
esta se encuentre unida a la superficie del soporte, en cuyo caso el sus-
trato deberá difundirse a través de la película estancada que rodea ese
soporte, sea que se encuentre alojada en el interior de la estructura del
soporte, en cuyo caso el sustrato deberá difundir dentro de la propia
matriz. En el primer caso la magnitud de las restricciones difusiona-
les (externas) puede expresarse en función del módulo de Damkoehler
(α) mientras que en el segundo la magnitud de las restricciones difu-
sionales (internas) se puede expresar en función del módulo de Thièle
(Φ), definidos como:
a= V
h∙K
√
Φ = L eq V
D∙K
en donde V es la velocidad máxima de la reacción (V = k ∙ e), h es el

coeficiente de transporte de película del sustrato, D es el coeficiente de
difusión del sustrato dentro de la matriz y L eq es el largo equivalente
(cociente entre volumen y área superficial) de la partícula catalítica.
Ambos módulos son susceptibles de ser cuantificados experimental-
mente.
La magnitud de las restricciones difusionales puede expresarse con-
venientemente sobre la base del factor de efectividad (η) definido como
el cociente entre la velocidad efectiva y la velocidad intrínseca (la ob-
servable en ausencia de restricciones difusionales). El valor de η puede
ser estimado en función del módulo correspondiente y la concentra-
ción (adimensional) de sustrato en el medio de reacción. La ecuación
genérica que describe el comportamiento de un reactor por lotes sujeto
a restricciones difusionales es:

∫ v dX
efectiva
= ∫ v (e, X)
dX
∙ η(X)
= t
si Ec. 7

A modo de ejemplo, en el caso de una enzima que cataliza una reac-
ción de acuerdo con una cinética simple de Michaelis-Menten sujeta
a restricciones difusionales externas se obtiene:
[1 + β0, i (1 - X)] ∙ [1 + α + β0, i (1 - X) - √Q ]

η(X) =
2 ∙ α ∙ β0, i (1 - X)
Q = β0, i ∙ X2 + 2 ∙ β0, i ∙ X(α - 1 - β0, i) + β0, i(β0, i - 2 ∙ α + 2) + α(α + 2) + 1
Ec. 8
FIGURA 4. Comportamiento del reactor por lotes con cinética de Michaelis-Menten

y consideración de la inactivación enzimática de acuerdo con un mecanismo
de primer orden. El reactor fue diseñado para obtener una conversión del 90%
al cabo de 10 horas en condiciones ideales (sin inactivación): kd: constante
cinética de inactivación de primer orden en h-1
1 .0
kd = 0
0 .9
0 .8
0 .7
k d = 0.1
0 .6
Conversión
0 .5 k d = 0.2
0 .4
k d = 0.3
0 .3
0 .2
0 .1
0 .0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo, horas

en donde β0,i es la concentración de sustrato adimensional inicial en
el medio de reacción (b0, i = s 0, i ). Si se reemplaza la ecuación 8 en la
K
ecuación 7 se obtiene la ecuación de comportamiento del reactor enzi-
mático bajo restricciones difusionales:

∫ 1 + a +2b∙ a(1∙ b- X) - √Q =
0,i
0,i k∙e ∙t
K Ec. 9
El análisis puede extenderse a cinéticas más complejas y al caso de las

restricciones difusionales internas.
También puede describirse el comportamiento de reactores enzimá-
ticos en condiciones de inactivación térmica y restricciones difusionales
simultáneas con la consideración de que en este caso tanto α como Φ
serán función del tiempo porque ambos contienen el parámetro V de-
pendiente de la concentración de enzima activa, que en este caso será
variable. El lector puede hallar un análisis pormenorizado del diseño
de reactores enzimáticos en condiciones de inactivación y restricciones
difusionales en las referencias indicadas (Illanes y Wilson, 2003; Illa-
nes y Altamirano, 2008).
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CAPÍTULO 7
Procesos industriales
biocatalizados
Pablo Domínguez de María
PROCESOS INDUSTRIALES BIOCATALIZADOS: MOTIVACIÓN Y REQUISITOS
En las industrias química y farmacéutica de hoy existe una tendencia

importante a la búsqueda de procesos más selectivos y comprometidos
con el medioambiente que permitan lograr una reducción significativa
de las enormes cantidades de residuos que se producen y de la conta-
minación causada fundamentalmente por el consumo de combustibles
fósiles sin que por ello se pierda capacidad sintética selectiva. En ese
contexto, dado que las enzimas son catalizadores selectivos y naturales
–esto es, verdes y biodegradables– es lógico que la industria se interese
en explorar su uso en muchos procesos químicos (Woodley, 2008; Patel,
2008; Akoh et al., 2008; Schoemaker et al., 2003).
Los aspectos (ventajosos) que pueden mencionarse a la hora de pensar

en un proceso químico catalizado por enzimas son los siguientes:
Selectividad. Las enzimas son (bio)catalizadores sumamente evoluciona-

dos en lo que se refiere a reacciones específicas, de modo que su gran se-
lectividad puede usarse en reacciones químicas que exijan ese grado de
selectividad, un grado al que muchas veces otros catalizadores químicos
no pueden acceder. Las selectividades buscadas en procesos industriales
biocatalizados pueden ser la enantioselectividad –formación/resolución
de centros quirales– o la regioselectividad –reactividad sobre un grupo
funcional en presencia de otros grupos funcionales análogos.
| 191
Consumo energético. En la industria muchos procesos químicos se lle-
van a cabo en severas condiciones de reacción, a presiones altas y con
temperaturas elevadas. El empleo de enzimas –que cumplen su función
vital en condiciones de reacción mucho más suaves– puede contribuir
de manera significativa a esa reducción con el consiguiente ahorro de
energía y una menor contaminación.
Reducción de residuos. Uno de los problemas más acuciantes de la industria

química actual es la enorme cantidad de residuos que produce. Dichos
residuos deben tratarse –con el consiguiente costo económico añadido– y
a pesar de ese tratamiento en muchos casos representan un gran proble-
ma ambiental y de percepción social. Como los procesos enzimáticos son
sumamente específicos es obvio que en muchos casos es posible diseñar
un proceso industrial con un enfoque ambiental mejor, sostenible y que
no por ello implique un compromiso en el aspecto económico.
Nuevas moléculas/mercados. Como resultado de la tendencia actual a

buscar procesos sostenibles se están desarrollando nuevas legislaciones
que en ciertos sectores pueden llevar a que la comercialización de los
productos solo sea posible si presentan garantías de fabricación de
que no comprometerán el ambiente (p. ej., los productos con etiqueta
“verde”). Por lo tanto, el desarrollo (pionero) de un proceso enzimático
puede permitir el acceso de una industria a nuevos mercados emergen-
tes –así como a una situación de propiedad intelectual favorable–, lo
que obviamente es un valor añadido al uso de enzimas y células como
biocatalizadores.
Formación de una menor proporción de productos secundarios. Al operar

sobre condiciones de reacción más suaves que los procesos químicos
convencionales los procesos biocatalíticos, además de su mayor selec-
tividad, en muchos casos generan una menor cantidad de productos
secundarios. Esos productos pueden representar un serio problema en
la industria química, por ejemplo por la formación de un color no de-
seado, por la pérdida de sustrato o bien por la necesidad de tratarlos
antes de la comercialización, lo que lleva a un incremento significativo
de los costos del proceso.
Sin embargo, como es obvio, el costo subyacente es un aspecto cru-
cial en la implementación de los procesos industriales catalizados por
192 | PABLO DOMÍNGUEZ DE MARÍA

enzimas. Resulta evidente que a la hora de su implementación a escala
práctica solo tendrán éxito los bioprocesos que presenten una ventaja
económica –o cuando menos igualdad económica de condiciones– en
relación con el proceso que se quiera sustituir. En ese largo camino,
para convertir una capacidad enzimática determinada en un proceso
industrial competitivo en la actualidad existen varias estrategias/téc-
nicas que permiten adaptar un catalizador natural al exigente interés
industrial. Esas estrategias han sido ampliamente descritas en otros
capítulos de este libro, pero dada su importancia capital en este (bio-
catálisis industrial) consideramos que vale la pena volver a describir-
las someramente:
Clonación y sobreexpresión de catalizadores. La primera premisa es dis-

poner de la cantidad necesaria del catalizador de interés y a un coste
competitivo. La naturaleza no suele producir enzimas en esas propor-
ciones porque no existe la necesidad natural de dicha biosíntesis. Como
solución, hoy en día las técnicas de biología molecular permiten la
clonación de los genes de interés en ciertos huéspedes microbianos
–sean bacterias o levaduras– y su posterior sobreexpresión y escalado.
Con dicha sobreexpresión la producción de la enzima de interés resulta
competitiva, en términos de cantidad y de precio.
Promiscuidad enzimática. Los procesos naturales catalizados por enzimas

son enormemente específicos. Desde esa óptica sería inimaginable pensar
en su uso industrial para sintetizar moléculas diferentes de las natura-
les. Sin embargo, hay una serie de enzimas que –dentro de su enorme
selectividad– son capaces de aceptar un gran número de sustratos, o
incluso de catalizar reacciones enzimáticas “no naturales”. Ese fenó-
meno se conoce como promiscuidad enzimática y es de gran utilidad
en procesos industriales. Un ejemplo claro de esa promiscuidad enzi-
mática es el de las hidrolasas, un grupo de enzimas que por su diseño
natural solo pueden hidrolizar ésteres o amidas de ácidos orgánicos, de
cadena más o menos larga. Sin embargo, debido a su promiscuidad,
a esa primera misión natural estas enzimas son capaces de añadir la
catálisis de reacciones en medio orgánico para realizar esterificaciones,
amidaciones, formación de perácidos e incluso condensaciones aldólicas
(formación de enlaces C-C) (Hult y Berglund, 2007; Bornscheuer y
Kazlauskas, 2004).
PROCESOS INDUSTRIALES BIOCATALIZADOS | 193

Metagenómica. No todas las enzimas son válidas para procesos industria-
les. No siempre es fácil encontrar un catalizador natural que reúna en sí
mismo las características mínimas de actividad, selectividad, estabilidad,
fácil acceso y clonación. Por si fuera poco, de la inmensa biodiversi-
dad existente en la Tierra la proporción cultivable en el laboratorio se
corresponde con menos del 1%. Para paliar este aspecto, y así ampliar
enormemente la búsqueda y el cribado de nuevos (bio)catalizadores, la
metagenómica permite acceder a genes de organismos no cultivables.
De esta forma es posible estudiar enormes cantidades de material ge-
nético en procesos de cribado frente a reacciones/sustratos específicos
y así encontrar biocatalizadores nuevos y competitivos (Beloqui et al.,
2008; Gabor et al., 2007).
Evolución dirigida. En condiciones normales, un catalizador natural

(wild-type) carece de la selectividad, la actividad y la estabilidad sufi-
cientes para acometer con garantías (económicas) un proceso industrial.
Para adaptarlo a las necesidades de cada proceso industrial se requiere la
evolución del catalizador en el laboratorio, lo que hoy en día es perfec-
tamente factible gracias al abanico de técnicas genéticas conocidas como
evolución dirigida. Mediante este enfoque el gen de una enzima de inte-
rés es sometido a una mutación ad hoc para desarrollar un mutante de la
enzima específicamente acoplado al proceso de interés (Reetz, 2004).
Por lo tanto, resumiendo los conceptos puede decirse que el proceso

industrial biocatalizado surge en primera instancia del interés en las
ventajas que a escala práctica pueden brindar las enzimas como cata-
lizadores (menor consumo energético, selectividad, etc.). A ese interés
primario se une el enorme desarrollo que han experimentado reciente-
mente muchas técnicas de biología molecular para tornar económicamen-
te competitivos la búsqueda, la clonación y mejoramiento genético y la
producción de biocatalizadores a los niveles exigidos. En los siguientes
apartados de este capítulo se expondrán en detalle varios ejemplos ac-
tuales de biotransformaciones industriales y en cada caso se analizarán
el desarrollo del proceso, los aspectos cruciales y la forma en que se ha
llegado a un proceso industrial rentable y sostenible a partir de una mera
capacidad enzimática. Más que presentar una simple compilación o lista
de ejemplos –disponibles ampliamente en otras fuentes bibliográfi-
cas– (Woodley, 2008; Patel, 2008; Akoh et al., 2008; Schoemaker et

al., 2003), la idea de este capítulo es entender cuáles son las causas que
llevan a implementar una biotransformación industrial de una forma
concreta y no de otra manera.
PROCESOS INDUSTRIALES CATALIZADOS POR ENZIMAS,

LIBRES E INMOVILIZADAS
Los procesos industriales biocatalizados más sencillos son aquellos en

los que no se usan células sino directamente enzimas. Estas enzimas
pueden usarse en forma libre o bien ser inmovilizadas en el reactor para
su reutilización. El factor de inmovilización es claramente importante
en función del costo de la producción del biocatalizador así como del
precio de mercado del producto que se va a sintetizar. En aplicaciones
para la síntesis de productos de (muy) alto valor añadido el coste de
inmovilizar normalmente no está justificado porque un simple uso
de la enzima es suficiente para competir con garantías en términos de
costes económicos. En los casos en los que los productos tienen menos
valor añadido la reutilización del biocatalizador es un factor claramente
crucial para la aplicación práctica exitosa.
Entre los procesos industriales con enzimas libres las hidrolasas ocu-
pan un lugar de enorme relevancia en virtud de su capacidad de fun-
cionar sin necesidad de cofactores, su intensa actividad en medios no
convencionales y su enorme promiscuidad enzimática (Hult y Ber-
glund, 2007; Bornscheuer y Kazlauskas, 2004; Carboni-Oerlemans et
al., 2006), tanto en relación con el rango de sustratos como en función
del amplio número de reacciones que son capaces de catalizar. Como
ejemplo del uso de hidrolasas Evonik AG ha desarrollado varios pro-
cesos enzimáticos de hidrólisis enantioselectiva para la síntesis de di-
ferentes β-aminoácidos. Dichos β-aminoácidos son compuestos de alto
valor añadido (figura 1) (Gröger et al., 2006a).
El proceso descrito comenzó con una simple hidrólisis en medio
acuoso a la que posteriormente se fueron incorporando diferentes op-
timizaciones a nivel de ingeniería del medio (esto es, la aplicación de un
sistema bifásico para lograr un aumento significativo de la concentración
del sustrato). Por último, el desarrollo de miniemulsiones del sustrato
condujo a una productividad de 200-400 g (casi) enantioméricamente
puros (según el sustrato) de β-aminoácido quiral/L/día. Otro aspecto

FIGURA 1. Síntesis de β-aminoácidos mediante el empleo de lipasas como
catalizadores, con alto grado de rendimiento y productividad (Gröger et al.,
2006a)
NH2 O NH2 O
Lipasa de P. cepacia
O OH
Mini-emulsión ("Nanorreactor")
Rendimiento: 200-400 g/Ld

(rac)-Sustratos: 500-800 g/L
ee.: 94 - > 99%
O O
Lipasa de páncreas porcino
O OH
NH2 Mini-emulsión ("Nanorreactor") NH 2
relevante en este ejemplo es la simplicidad: la enzima no está inmovi-

lizada, una sola reutilización es económicamente competitiva y la pro-
ducción del sustrato de partida (éster racémico del β-aminoácido) es
perfectamente asequible a partir de sustratos disponibles y baratos (vale
decir, ácido malónico y benzaldehído). Es interesante destacar que en
este ejemplo solo puede alcanzarse el 50% de conversión (resolución
cinética) y en consecuencia el 50% remanente debe separarse, racemi-
zarse y reutilizarse posteriormente en el mismo proceso. En conjunto,
detrás de un proceso simple hay sustratos baratos, enzimas comerciales
y un producto de alto valor añadido. A eso se suman la innovación y
técnicas modernas de ingeniería del medio para dar lugar a una biotrans-
formación competitiva y eficiente. Como puede verse, la biotransforma-
ción industrial es un compendio multidisciplinario de factores que en
conjunto llevan a un costo aceptable para su implementación.
Dentro de este campo de las hidrolasas (enzimas libres) otro ejem-
plo paradigmático de la forma en que las biotransformaciones se abren
camino en la industria es el representado por la esterasa de hígado de
cerdo (ple, siglas que en inglés corresponden a la expresión pig liver
esterase). Como su nombre lo indica, esta hidrolasa se aisló por extrac-
ción orgánica del hígado del cerdo. Durante el siglo xx una amplísima
investigación académica puso de manifiesto su empleo como potente

biocatalizador, sobre todo en reacciones enantioselectivas de hidrólisis
y en desimetrizaciones de sustratos proquirales (estas últimas muy ven-
tajosas porque teóricamente pueden alcanzar un rendimiento del 100%,
por el 50% al que, por definición, se encuentran acotadas las resolucio-
nes racémicas) (figura 2) (Domínguez de María et al., 2007).
Sin embargo, a pesar del enorme potencial de este biocatalizador, su
salto industrial quedó relegado por varios motivos importantes entre los
que figuraba su falta de disponibilidad en gran escala puesto que al ser
un producto derivado de la extracción orgánica de hígados de cerdo las
cantidades obtenidas (así como su precio) no eran suficientes para ge-
nerar su atractivo industrial. Otro motivo relacionado era la existencia
de diferentes isoenzimas –con diferentes enantioselectividades–, lo que
indudablemente llevaba a resultados con variaciones inaceptables. Por
último, había connotaciones sanitarias y sociales porque al ser un deri-
vado de un animal superior (el cerdo) su uso quedaba excluido de de-
terminadas sociedades (motivos religiosos) y además terminantemente
prohibido en mercados farmacéuticos porque podía ser una fuente de
transmisión de virus. La solución de estos problemas fue aportada por
la biología molecular, que ofreció la posibilidad de clonar el gen de la
esterasa de hígado de cerdo y sobreexpresarlo en huéspedes microbia-
nos. Tras muchos esfuerzos para convertir la sobreexpresión microbiana
de un gen de proteína animal en un proceso competitivo en los últimos
años se ha logrado disponer de varios clones de esa esterasa de hígado
porcino. Como ejemplo industrial, la empresa dsm patentó y publicó
recientemente un proceso para la producción de ple recombinante a
escala de toneladas y su posterior uso en la síntesis enantioselectiva del
precursor de un fármaco (Böttcher et al., 2007; Hermann et al., 2008).
Con este otro ejemplo queda claro una vez más que los procesos indus-
triales biocatalizados no constituyen una unidad sino que se necesitan
enfoques multidisciplinarios e innovadores para acoplar los enormes
potenciales catalíticos de la naturaleza con determinados procesos quí-
micos de una forma económicamente competitiva.
Dos importantes campos de aplicación de las hidrolasas libres son
el campo de la industria de los detergentes textiles y el del blanqueo
de pasta de papel (Mauer, 2004). Gracias a su amplia promiscuidad
enzimática las lipasas se usan como catalizadores capaces de formar in
situ diferentes perácidos orgánicos a partir de peróxido de hidrógeno y
en medios acuosos (donde se produce la limpieza). Los perácidos or-

FIGURA 2. Potencial de la esterasa de hígado de cerdo como catalizador en relación
con el tipo de sustrato y de proceso (Domínguez de María et al., 2007)
O
OH O
OH
P CO2 Me
O
OH O
CO2 Me COOH
CH 3 Esterasa hígado de cerdo
HOOC CO2 Me
Me
N O
Br
H NH
CO2 Me N O
O O HO O OR
H HOOC N
COOMe OH
gánicos no son estables y su transporte en general es difícil y no reco-

mendable, por aspectos de seguridad. Por consiguiente, esa capacidad
de algunas lipasas de formarlos in situ representa una ventaja crucial
para su uso como oxidantes en procesos de limpieza. Sin embargo, no
todas las lipasas poseen la capacidad de catalizar esa reacción o bien
son lo suficientemente estables para resistir las exigencias de esas con-
diciones. De todas maneras, es importante destacar que los procesos se
desarrollan en medios acuosos. Hay que tener en cuenta que la forma-
ción de perácido catalizada por una lipasa es una reacción nucleofílica
(ácido carboxílico + peróxido de hidrógeno) que compite con la hidró-
lisis del perácido, también nucleofílica, favorecida en términos termo-
dinámicos por la mayor presencia de agua en relación con peróxido de
hidrógeno (figura 3).
De esta forma, es importante considerar el parámetro perhidrólisis/
hidrólisis (p/h) para cada catalizador. En condiciones normales, las li-
pasas microbianas presentan relaciones p/h inaceptables desde el punto
de vista práctico, esto es, se prioriza la hidrólisis en relación con la per-

FIGURA 3. Competencia entre hidrólisis y perhidrólisis con lipasas como
biocatalizadores en medios acuosos (Carboni-Oerlemans et al., 2006)
O H2 O 2 O
Lipasa
R OH R OOH
H2O
hidrólisis. Como excepción, la lipasa wild-type de Pseudomonas putida

mostró una relación p/h de 0,25. Una mutación de dos aminoácidos en
la estructura llevó a una nueva lipasa con una relación p/h de 1, con lo
que el proceso comenzó a ser competitivo desde el punto de vista in-
dustrial. Más recientemente, la separación académica entre hidrolasas y
perhidrolasas proporcionó más conocimientos acerca de los mecanismos
enzimáticos y como resultado de ello no hace mucho la empresa Genen-
cor patentó el uso práctico de la perhidrolasa de Mycobacterium smegmatis.
Dicha enzima, tras varios ciclos de mejoramiento por evolución dirigida,
rindió una relación p/h de 5, lo que asegura su potencialidad industrial
dentro de los campos de los detergentes y del blanqueo de pasta de pa-
pel (Carboni-Oerlemans et al., 2006). Otras enzimas que tienen cier-
to uso como enzimas libres en la industria del papel son las xilanasas
y las lacasas (Kunamneni et al., 2008; Shatalov et al., 2008; Gamelas et
al., 2007). Sin embargo, debido a la necesidad de mediadores orgánicos
(normalmente caros) y al bajo valor añadido que poseen los productos
del papel es difícil asegurar un futuro uso práctico de estas enzimas. De
igual forma, muchas de las aplicaciones de este campo obligan a un solo
uso del biocatalizador –su inmovilización no es práctica– lo que dificul-
ta la búsqueda de enzimas capaces de competir económicamente en ese
sector. En este campo se requiere más investigación básica encaminada
a mejorar los catalizadores así como a producirlos (sobreexpresarlos) en
gran escala en busca de una reducción de costos en su precio. Actual-
mente se alcanzan producciones de estas enzimas de hasta 25 g/L en
fermentaciones, lo que en cualquier caso asegura su uso industrial en al-
gunos nichos, si bien no en todos aquellos en los que el uso de enzimas
rendiría procesos más sostenibles y suaves (Mauer, 2004).
Las proteasas también representan un excelente ejemplo de enzi-
mas libres usadas en la industria de los detergentes. La empresa Novo

Nordisk A/S produce tres tipos de proteasas (Alcalasa, Esperasa y
Savinasa) generadas por diferentes cepas de Bacillus. Estas enzimas
son útiles como detergentes textiles porque permiten una reducción
significativa de la temperatura de lavado –con el consiguiente ahorro
energético y el cuidado de las fibras textiles– así como condiciones de
pH cercanas a la neutralidad. Las subtilisinas merecen una mención
especial porque son proteasas que se han usado como aditivos en de-
tergentes durante décadas y que han sido mejoradas genéticamente
mediante las técnicas de biología molecular. En la actualidad se las
usa en lavandería y limpieza automática de platos. Su misión con-
siste en eliminar de superficies sólidas los residuos de sangre, leche,
huevos y salsas, entre otros elementos. En este caso no solo es impor-
tante la enzima como tal; también la forma física (granulada, líquida,
etc.) cobra una importancia primordial en su capacidad de limpieza y,
por ende, en el costo. Así se demuestra una vez más que la aplicación
práctica de un proceso biocatalizado no se circunscribe al desarrollo
de una reacción enzimática. Hay muchos otros aspectos intrínsecos y
de acoplamiento con un determinado proceso que normalmente son
cruciales para el éxito de su implementación (Mauer, 2004).
La empresa Henkel AG también ha utilizado la metagenómica para
aislar y clonar hidrolasas (esterasas) capaces de hidrolizar selectivamen-
te varios tipos de diésteres ftálicos y formar monoésteres. Estas estruc-
turas son componentes comunes de muchos plásticos de modo que el
nuevo biocatalizador –en este caso obtenido de muestras no cultiva-
bles– puede ofrecer importantes aplicaciones futuras tanto en la con-
fección de bioplásticos como en la degradación de polímeros basados
en petróleo. Evidentemente, la combinación de una necesidad indus-
trial con el desarrollo de tecnologías sostenibles aumentará en futuros
procesos industriales. Otra vez se combinan técnicas modernas de bio-
logía molecular con el sólido conocimiento del que se dispone actual-
mente en el campo de las hidrolasas como biocatalizadores (figura 4)
(Michels et al., 2007).
Cambiando de industria, sin abandonar el apartado de las enzimas
libres pero dejando atrás las hidrolasas, otras enzimas con una enorme
utilidad a nivel industrial son las hidroxinitrilo liasas. Estas enzimas
son esenciales en las plantas –donde parecen desempeñar una misión
natural defensiva– y su uso práctico ha sido posible, una vez más, gra-
cias a una eficiente clonación en huéspedes microbianos y a un ade-

FIGURA 4. Ejemplo de una esterasa (aislada con técnicas de metagenómica) capaz
de hidrolizar diferentes diésteres ftálicos (Michels et al., 2007)
O O
O Esterasa (Metagenómica) OH
O O
O O
H 3C OH
O O
O Esterasa (Metagenómica) O
O OH
O O
H3 C OH
cuado mejoramiento genético de los catalizadores mediante evolución

dirigida (figura 5) (Purkarthofer et al., 2007).
Como se ve, después de clonar, sobreexpresar y mejorar la genética
de los biocatalizadores se obtienen rendimientos y enantioselectivi-
dades de una competitividad tremenda (además de la drástica reduc-
ción de los residuos). Aparte de estas ventajas, ya comentadas, en los
procesos biocatalizados por hidroxinitrilo liasas es importante destacar
otros dos aspectos, el primero de los cuales es el precio de mercado
de los compuestos químicos producidos (quirales, alto valor añadido),
que permite un simple uso de las enzimas, sin necesidad de inmovili-
zarlas. El segundo aspecto es el desarrollo de técnicas adecuadas para
el manejo de hcn a nivel industrial, que ha posibilitado que hoy por
hoy estos procesos sean sostenibles y seguros. En este campo de las
hidroxinitrilo liasas también es importante destacar el aspecto de la
promiscuidad enzimática. Como se expuso en el primer apartado de
este capítulo, esa promiscuidad tiene gran importancia a la hora de
la implementación de nuevos procesos biocatalizados. En ese sentido
hace poco se demostró que algunas de estas hidroxinitrilo liasas son
catalizadores selectivos en la reacción de Henry –adición electrofílica
de aldehídos a posiciones en alfa de grupos nitro, ligeramente ácidos–,
lo que obviamente puede llevar a nuevos procesos industriales en un

FIGURA 5. Proceso industrial catalizado por hidroxinitrilo liasas y ejemplos de
moléculas y productividades obtenidas una vez optimizados los procesos
(Purkarthofer et al., 2007)
O HO CN
Hidroxinitrilo Liasa
+ HCN
R1 R2 R1 R2
OH OH
O
CN CN
Rendimiento: 95,5% Rendimiento: 90%

Productividad: 1000 g/L/d Productividad: 400 g/L/d
ee.: 98,5% ee.: > 99%
OH OH
CN CN
O
Rendimiento: 90% Rendimiento: 90%

Productividad: 200 g/L/d ee.: > 99%
ee.: > 99%
plazo corto. Aunque las conversiones/velocidades enzimáticas de esos

procesos todavía están lejos de ser aplicables a nivel industrial, en este
caso las mejoras genéticas mediante evolución dirigida también po-
drían contribuir a su aplicación práctica en un futuro próximo. Una
vez más, el bajo coste y la amplia disponibilidad de los sustratos de
partida (nitroalcanos, aldehídos y cetonas), unidos al enorme interés
(alto precio) del producto sintetizado como building block, asegurarían
un simple uso del catalizador para esta nueva aplicación. Otro aspecto
importante es que en esta reacción se generarían dos centros quirales
dentro de un único proceso, a partir de sustratos no asimétricos, eviden-
temente un nuevo valor añadido que las enzimas pueden aportar como
catalizadores (figura 6).

FIGURA 6. La reacción de Henry catalizada por algunas hidroxinitrilo liasas
(Purkarthofer et al., 2007)
O OH
H Hidroxinitrilo Liasa
+ NO 2
NO 2
Rendimiento: 67%
ee.: 95 % (anti/syn 9/1)
El mercado de los fármacos y sus precursores constituye un mer-

cado potencial para el desarrollo de procesos biocatalíticos. La obvia
necesidad de un alto grado de selectividad y pureza de esos fármacos
incrementa el valor añadido y si se combina la utilización de enzimas
selectivas con esas necesidades resultan claras la enorme aplicación
y la potencialidad futura que pueden tener los procesos biocatalizados
en la industria farmacéutica. Un grupo relevante de enzimas que hace
poco comenzaron a usarse a nivel industrial como simples biocataliza-
dores es el compuesto por las halohidrina deshalogenasas. La empre-
sa Codexis ha desarrollado un interesante proceso para la producción
de un precursor del Lipitor, fármaco que actualmente se comercializa
a nivel mundial por su eficaz actividad en la reducción del nivel de co-
lesterol ldl (figura 7) (Fox et al., 2007).
Es importante destacar una vez más que la aplicación práctica de
este proceso requirió la implementación de una serie de pasos para la
optimización correcta del biocatalizador wild-type. De esta forma, la en-
zima natural fue mejorada unas 4.000 veces en términos de producti-
vidad por medio de técnicas de evolución dirigida, lo que se logró con
35 mutaciones del gen de partida (Fox et al., 2007). Estos datos, con-
cluyentes por sí mismos, hablan de la complejidad que subyace tras un
proceso biocatalítico simple pero también del enorme poder que tienen
las modernas técnicas de biología molecular para la adecuada imple-
mentación de esos procesos biocatalíticos.
Finalmente, en la actualidad la química de los carbohidratos tam-
bién goza de una gran cantidad de procesos biocatalizados por enzi-
mas libres tales como α-amilasas, glucoamilasas, glucosa isomerasas, etc.
(Buchholz y Seibel, 2008). Muchas de esas enzimas son termoestables,

FIGURA 7. Enfoque biocatalítico para la formación de precursores de la
atorvastatina (Fox et al., 2007)
OH O Halohidrina dehalogenasa O Halohidrina dehalogenasa OH O

O NC
Cl OEt OEt OEt
pH 7.3 HCN
NH
OH OH
O N
O
OH
Lipitor
F (Atorvast atina)
lo que facilita enormemente su inclusión en los procesos complejos de

tratamiento de polisacáridos, como por ejemplo formación de melazas,
gelatinizaciones y pretratamientos, entre otros. Cabe destacar que en
este caso la decisión de inmovilizar-no inmovilizar la enzima también
está determinada por el coste final del producto. Cuando el producto
final consiste en sustratos de bajo valor añadido (es decir, simples glu-
cosas) se requieren la inmovilización y la reutilización del biocatalizador
para sentar las bases de un proyecto económicamente competitivo. Por
el contrario, cuando se necesita cierta regioselectividad –aspecto muy
común, por otra parte, en la química de los carbohidratos–, en muchas
ocasiones el uso único de una enzima es suficiente para permitir la no
inmovilización del biocatalizador.
PROCESOS INDUSTRIALES CATALIZADOS POR CÉLULAS ENTERAS
Oxidorreductasas
El uso de enzimas –libres o inmovilizadas– como biocatalizadores nor-

malmente es aplicable cuando la catálisis se produce sin necesidad de
cofactores. Sin embargo, no todas las enzimas son capaces de realizar
su función sin recurrir a esos cofactores. Cuando se utilizan enzimas

que sí los precisan es necesario pensar que también deben adicionarse o
regenerarse in situ. Evidentemente, tanto el costo intrínseco del cofactor
como su disponibilidad comercial y la eventual aplicación de técnicas
para su regeneración deben ser capaces de ofrecer un costo adicional
competitivo, un aspecto no muy fácil de conseguir en la mayoría de las
enzimas dependientes de cofactores.
Para solventar este problema, y utilizar enzimas dependientes de co-
factores en procesos industriales, normalmente se recurre al uso de la
célula entera como biocatalizador. En este campo hay un ejemplo pa-
radigmático que consiste en el uso de oxidorreductasas, enzimas muy
útiles en la síntesis de diferentes sintones quirales. Estas enzimas pre-
cisan cofactores como nad(p) o fad y su regeneración es crucial para
asegurar un proceso competitivo. Hace muy poco la empresa Evonik
AG propuso la doble clonación y sobreexpresión de dos oxidorreduc-
tasas dentro de una misma célula (o designer bug) para que una de esas
enzimas catalizara la oxidación o la reducción del sustrato deseado
mientras la otra enzima, clonada y sobreexpresada (una glucosa deshi-
drogenasa), regeneraba el cofactor mediante la oxidación de la glucosa.
Notablemente, en función del producto deseado las enzimas pueden
intercambiar su función y así serán accesibles ambos enantiómeros de
una misma molécula (figura 8) (Gröger et al., 2006b).
Debe destacarse que no solo la doble clonación y la sobreexpresión
son importantes. Para alcanzar una alta productividad en términos de
concentración del producto y tiempos de reacción competitivos tam-
bién se necesita una adecuada selección de términos relacionados con
la ingeniería del medio (dosificación del sustrato, sistemas bifásicos, etc.).
Una vez más queda claro que cada proceso biocatalizado tiene sus pro-
pias consideraciones y se requiere una evaluación individual para selec-
cionar adecuadamente los parámetros de la reacción.
Liasas, transaminasas y nitrilasas
Además de las oxidorreductasas mencionadas en el apartado anterior

existen otras enzimas que precisan cofactores orgánicos para desempeñar
su función. Una vez más, si se analizan los costes y la disponibilidad de
los cofactores se llega a la conclusión de que el desarrollo de células en-
teras como biocatalizadores es casi la única vía mediante la cual pueden
usarse estas enzimas en procesos industriales con garantías económicas.

FIGURA 8. Propuesta competitiva para el uso de enzimas redox a nivel industrial
mediante la sobreexpresión en la célula entera de dos catalizadores, uno para
el proceso en sí y el otro para asegurar la correcta regeneración del cofactor
(Gröger et al., 2006b)
O
Glucono-lactona NAD(P)+
R1 R2
Glucosa deshidrogenasa CÉLULA ENTERA Alcohol deshidrogenasa
OH
D-Glucosa + R1 R2
NAD(P)H + H
OH OH OH OH
O Br
Cl O O Br
31 h; 94%; ee.: > 99% 27 h; 93%; ee.: 96% 25 h; 95%; ee.: > 99% 26 h; 94%; ee.: 97%
156 g/L 210 g/L 212 g/L 140 g/L
Las liasas dependientes de tiamina difosfato constituyen un ejemplo. Es-

tas enzimas son capaces de formar (enantioselectivamente) enlaces C-C
a partir de aldehídos para dar lugar a α-hidroxicetonas. Los aldehídos se
consiguen en el mercado y se hallan disponibles en gran escala; por otra
parte, estas α-hidroxicetonas son estructuras muy útiles como sintones
químicos. La empresa Evonik AG ha desarrollado un proceso para la
producción biocatalizada de α-hidroxicetonas mediante el empleo de
células enteras con una benzaldehído liasa (bal) sobreexpresada como
biocatalizador (figura 9) (Domínguez de María et al., 2008).
Los aspectos relevantes de esta biotransformación son varios. En
primer lugar, también en este caso para lograr un buen rendimiento
fueron cruciales los aspectos de la ingeniería del medio (sistema bifási-
co, concentración relativa entre sustratos). Se utilizó una segunda fase
orgánica para mejorar la solubilidad de los sustratos y evitar posibles

FIGURA 9. Formación de enlaces C-C de manera enantioselectiva y competitiva
con una bal (benzaldehído liasa) como biocatalizador (Domínguez de María
et al., 2008)
O O O O
O BAL (Sobre-expresada en células E. coli )
H + H O
O Sistema bifásico: MTBE/Buffer OH
20 h; ca. 80 g/L; ee.: 98%
inhibiciones de la enzima. Por otro lado, al emplear una célula entera

diseñada especialmente (contenía bal sobreexpresada) no fue necesa-
rio adicionar cofactor externo (tiamina difosfato), lo que obviamente
abarató considerablemente el proceso. Por otro lado, el empleo de cé-
lulas también simplifica sobremanera el proceso downstream o work-up
y con una extracción de la fase orgánica y posterior concentración se
alcanzaron productividades de 80 g/L de producto prácticamente puro
en términos enantioméricos (Domínguez de María et al., 2008).
Otras enzimas que pertenecen a esta categoría son las transaminasas,
que emplean piridoxal fosfato como cofactor orgánico. Nuevamente, la
necesidad de agregar el cofactor cuando se trabaja con la enzima libre
obliga a un incremento de los costos y la complejidad durante el esca-
lado del proceso. Hace poco Brystol-Myers propuso un proceso bioca-
talizado para la síntesis de aminas enantioméricamente puras mediante
resolución cinética con transaminasas. Con un concepto análogo al des-
crito para las liasas se procedió a la clonación y sobreexpresión de una
transaminasa en un huésped microbiano y se utilizó la célula entera
como biocatalizador (figura 10) (Hanson et al., 2008).
Como puede verse, volvieron a obtenerse resultados competitivos
cuando se empleó una célula entera (preparada como designer bug). Es
importante destacar que estos casos figuran entre los primeros ejem-
plos del uso de liasas y transaminasas a nivel industrial, en asociación
con el empleo de células enteras (Domínguez de María et al., 2008;
Hanson et al., 2008). Cabe esperar que con las técnicas de evolución
dirigida y metagenómica citadas someramente en el presente capítulo
en los próximos años se desarrollen procesos enzimáticos industriales
nuevos y competitivos.

FIGURA 10. Empleo de transaminasas sobreexpresadas dentro de una célula entera
para obtener una alta productividad de aminas quirales (Hanson et al., 2008)
NH 2 E. coli (Transaminasa sobre-expresada) NH 2 O

+
23 h; ca. 60 g/L;
ee.: > 99%
O NH 2
OH OH
O O
Ácido Pirúvico Alanina
(Aceptor Amina)
Los compuestos producidos en estos procesos son (o buscan ser)

enantioméricamente puros. Por consiguiente, se trata de productos de
alto valor añadido y como consecuencia es probable que en la mayoría
de los casos un solo uso del biocatalizador (células) sea suficiente para
asegurar costos competitivos. Sin embargo, los procesos biocatalizados
también son muy útiles para la síntesis de productos de bajo valor aña-
dido y commodities. En estas aplicaciones se busca reducir el consumo
energético y la generación de residuos o evitar la formación de produc-
tos secundarios; no obstante, los biocatalizadores deben reutilizarse un
número significativo de veces para permitir costos acordes con el pro-
ceso deseado, capaz de proveer un bajo costo del producto.
Un ejemplo paradigmático es la producción de acrilamida por Mits-
hubishi Rayon mediante el empleo de células inmovilizadas de Rhodo-
coccus rhodochrous. Actualmente, toda la acrilamida comercializada por
esa empresa (> 40.000 toneladas/año) se produce con procesos biocata-
líticos. Las cepas empleadas son capaces de operar en concentraciones
de acrilamida de ca. 400 g/L y las bajas temperaturas a las que se genera
la síntesis aseguran que no se produzcan polimerizaciones no deseadas
ni formación de color (figura 11) (Yamada y Kobayashi, 1996).
En otro ejemplo similar la empresa DuPont presentó un proceso
para la producción de ácido glicólico mediante el empleo de nitrilasas
sobreexpresadas en E. coli y mejoradas genéticamente (figura 12) (Pa-
nova et al., 2007).

FIGURA 11. Proceso biocatalítico para la formación de acrilamida mediante el
empleo de células enteras (Yamada y Kobayashi, 1996)
O
CN Rhodococcus rhodocrous
NH 2
Acrilamida
ca. 400 g/L
FIGURA 12. Síntesis quimioenzimática de ácido glicólico con nitrilasas

sobreexpresadas en células enteras inmovilizadas (Panova et al., 2007)
O > 99% E. coli (Nitrilasa) O +NH 4+ IEX OH

HO CN HO HO
H H + HCN > 99%
O O
PASO BIOCATALÍTICO Ácido Glicólico
En conjunto el proceso de DuPont muestra varios aspectos crucia-

les a la hora de pensar en un proceso industrial biocatalizado porque
además de ser un proceso enzimático altamente competitivo revela su
perfecta inclusión dentro de un desarrollo químico global. La síntesis se
inicia con química C1 –condensación química entre ácido cianhídrico
y formaldehído– para dar lugar al glicolonitrilo. Dicho compuesto es
el sustrato del proceso enzimático, convirtiéndolo en la sal amónica del
ácido glicólico. Un paso químico final (columna de intercambio iónico,
iex) da lugar al ácido glicólico. El proceso biocatalítico en sí también
es un ejemplo paradigmático del enfoque actual de las biotransforma-
ciones industriales: primero se efectuó un cribado de diferentes nitri-
lasas obtenidas en muestras de suelos (metagenómica) y a partir de ese
estudio inicial se seleccionó la nitrilasa de Acidovorax facilis 72W. Sin
embargo, como la nitrilasa natural no ofrecía suficiente capacidad para
la exigencia de un proceso industrial se procedió a su clonación, sobre-
expresión y mejoramiento genético mediante evolución dirigida. Debi-
do al bajo valor añadido del ácido glicólico (producto final), las células
enteras se inmovilizaron en carragenano, lo que permitió una reutili-

zación de meses del biocatalizador. El proceso final presenta una pro-
ductividad de > 1 kg de ácido glicólico/gramo de biomasa seca, lo que
garantiza ampliamente que el proceso enzimático pueda implementar-
se a escala industrial, con garantías incluso para productos de tan bajo
valor añadido como en este caso (Panova et al., 2007).
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
Hemos tratado de explicar –a través de ejemplos seleccionados– cómo

deben enfocarse los procesos industriales biocatalíticos y qué aspectos es
importante considerar a la hora de evaluar dichas (bio) síntesis. Se parte
de una motivación clara (selectividad, reducción del gasto energético,
reducción de residuos, nuevos mercados, no formación de productos
secundarios) y se utilizan como apoyo técnicas modernas de biología
molecular (clonación, sobreexpresión, metagénomica, evolución dirigida)
junto con aspectos de ingeniería del medio y promiscuidad enzimática.
Para poder competir en términos económicos, en función del valor
añadido del producto deseado así como de la disponibilidad/precio de
los sustratos de partida, los biocatalizadores pueden ser inmovilizados
o utilizarse una sola vez. Por otro lado, en función de la necesidad de
un cofactor orgánico –y su eventual regeneración– se aplican enzimas
libres o células enteras como biocatalizadores. Es obvio que el uso de
procesos biocatalíticos en la industria actual es una tendencia en alza
y cabe esperar que en los próximos años se implementen conceptos
nuevos, innovadores y competitivos.
Para terminar es importante mencionar que los procesos industriales
biotecnológicos no se acaban en los descritos en este capítulo. Otros en-
foques, como pueden ser los procesos enzimáticos en cascada (dentro de
una célula), la ingeniería metabólica y el uso de materias primas biode-
gradables (residuos de lignocelulosas, molasas, etc.) para la producción
de sintones químicos de partida –la biotecnología blanca, perspectivas
cradle-to-cradle– también son propuestas que van a contribuir de manera
muy significativa al cambio de paradigma de las industrias químicas y
farmacéuticas durante el siglo xxi: el salto de sociedades basadas en el
petróleo a sociedades basadas (total o parcialmente) en procesos “bio”.
Es evidente que otros aspectos (sociales, económicos) desempeñarán
un papel determinante en la correcta (ética) implementación de dichas

tecnologías a nivel industrial y práctico. Se requieren acuerdos en varios
niveles sociales y económicos para buscar las sinergias y el mejor uso
de los recursos en pro del mejoramiento de las condiciones de vida de
las sociedades humanas. De todas las sociedades humanas.
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1. Biotecnología. 2. Enzimas. I. Lewkowicz, Elizabeth, comp.

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Prólogo, por Elizabeth Lewkowicz. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

Capítulo 1. Fuentes de biocatalizadores. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

Capítulo 2. Los vegetales en biocatálisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Capítulo 3. Biocatálisis en medios no convencionales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

Capítulo 4. Aplicaciones de la biología molecular en biocatálisis.

Capítulo 5. Aplicaciones del modelado molecular a la biocatálisis. . . . . . . . . . 125

Capítulo 6. Biocatálisis enzimática industrial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

Capítulo 7. Procesos industriales biocatalizados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191

Andrés R. Alcántara León, Grupo de Biotransformaciones (btg), De-

En la biotecnología las enzimas desempeñan una función clave como

Los procesos biotecnológicos son aquellos que involucran el uso de

16 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

ORIGEN DE LOS BIOCATALIZADORES

Los tejidos de origen animal y vegetal son fuentes clásicas de biocatali-

18 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

Microorganismos naturales (wild type)

Los microorganismos han sido ampliamente explotados en las áreas de

El uso en gran escala de levaduras en procesos catalizados por enzimas

20 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

22 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

Tradicionalmente, los hongos han sido uno de los sistemas de células

Los microorganismos procariontes (Bacteria y Archaea), y entre ellos las

24 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

Las técnicas de ingeniería genética de clonado y expresión de enzimas

Búsqueda y selección de actividad catalítica

El uso industrial de enzimas se ha extendido rápidamente (Schmid

26 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

a. Búsqueda de nuevas actividades en diferentes ambientes, que pue-

Actualmente, se considera que por cada producto deseado se puede en-

El recurso más sencillo y rápido es la fuente comercial. Muchos desa-

Dado que los microorganismos representan la fuente más útil y accesible

28 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

Abreviatura Nombre Lugar

atcc American Type Culture Collection Maryland, Estados Unidos

cbs Centraalbureau voor Schimmelcultur Utrecht, Holanda

ccm Czechoslovak Collection of Microorganisms Universidad Purkyne, Brno,

cdda Canadian Department of Agriculture Ottawa, Canadá

cip Collection of the Institut Pasteur París, Francia

dsmz Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen Braunschweig, Alemania

jcrb Japanese Collection of Research Biosources Tokio, Japón

nctc National Collection of Type Cultures Londres, Reino Unido

cect Colección Española de Cultivos Tipo Universidad de Valencia, España

ifo Institute for Fermentation, Culture Collection of Microorganisms Osaka, Japón

Como los microorganismos se adaptan fácilmente a cambios de nu-

a. Ambiente específico. La diversidad se obtiene con un aumento de

El éxito del aislamiento de microorganismos de ambientes naturales de-

30 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

SELECCIÓN DEL BIOCATALIZADOR

A diferencia de lo que sucede cuando se emplean los reactivos comu-

Screening versus selección

Cuando se desea evaluar un número elevado de muestras con el fin

32 | ELIZABETH LEWKOWICZ Y DANIELA GAMENARA

a. El diseño del proceso. La principal consideración es la selección

Entre los biocatalizadores positivos seleccionados se buscarán princi-

a. Producir la enzima con buen rendimiento y en tiempos razo-