Capitulo 5 Rompimiento de Células 5.1 Introduccién El rompimiento celular es una operacién unitaria de gran importan- cia industrial. Algunos de los productos biotecnolégicos producidos a escala industrial son extracelulares y no requieren ser extraidos de la célula, Cuando el producto de interés es intracclular (Tabla 5.1), una ver realizada la cosecha de eélulas una operacién necesaria para la li beracién del producto es el rompimiento de la cchila misma (Petrides et al, 1989). Algunas proteinas eucaridticas recombinantes producidas por ini croorganismos procariotes no son secretadas por la célula recombinante y constituyen productos intracelulares, los cuales pueden estar en forma activa o cn forma desnaturalizada. Las protefuas intracelulares desva- turalizadas con frecuencia forman cuerpos de inclusin insolubles Otras protefnas de interés permanecen en el espacio periplasmico entre la membrana y la pared celular. Sélo algunas células presentan mecanismos de secrecién celular del producto de interés. Esto hace necesario contar con técnicas de rompimiento celular eficientes y selec- tivas en la produccién de proteina intracelular La técnica de rompimiento celular seleccionada dete de los desechos resultantes y la influencia que estos tendr operaciones que se utilicen para su separacién, Asimisino, la técnica es funcién del tipo de microorganismo que contiene al producto de interés, nina el nen las 165,166 CAPITULO 5. ROMPIMIENTO DE CELULAS ‘Tabla 5.1: Productos que requieren de una ruptura celular. Tipo de Producto Ejempio: Proteinas Recombinantes | Tusulina, IC, Proteia | , Protefna G. Bnzimas L-Asparaginasa, luvertasa, Glucocinasa. Vacunas Totanos, Meningitis Otros DNA, Mitocondrias, Esporas, Toxinas, Adaptada de: Foster, 1992 Reproducida con cl permiso de Nature Publishing Co. Copyright ©1992, ‘Todos los derechos reservados. particularmente en relacién a su estructura externa (Asenjo, 1990). En este capitulo en la seccién 5.2 se presentan los fundamentos de la operacién de rompimicnto. La seccién 5.3 se centra en los equipos de rompimiento que se utilizan @ nivel industrial. KI diseiio de estos equipos se discute en la sece’ 5.2 Fundamentos La recuperacién éptima de productos int miento de la estructura de las capas externas que protegen a las células: la membrana y la pared celular. Requiere ademds del conocimiento de los sisternas que permiten a ciertas células secretar los productos de interes en forma. activa, evitando con ésto la necesidad de romper la célula para recuperar el producto. Existen varios métodos para la recuperaciéa de productos intracehi- ares, los mas drasticos involucran el rempimiento completo de la célula. Los métodos de recuperacién menos severos involucran una alleracién quimica de las cubiertas celulares © permeabilizacién que facilita la sa- lida del producto. Esta seccién se centra en cuatro aspectos fundamentales andlisis de la operacién de rompimiento: uilares requiere del conoci para cl © Estructura de la pared celular.5.2. FUNDAMENTOS 167 Sistemas celulares de secrecién. © Métodos de rompimiento celular. © Métodos de permeabilizacién celular. 5.2.1 Estructura de la Pared Celular En esta seccién se describe brevemente la estructura de las paredes microbianas, particularmente la estructura de las paredes bacterianas, debido al relevante papel que tienen las bacterias como la E. coli como organismos huésped de varios productos biotecnolégicos recombinantes (Wang, 1988). Las paredes celulares de las bacterias son rigidas y porosas, debido a que las bacterias poseen una elevada presién osmoética interna y a que frecuentemente pueden hallarse expuestas a diferentes condiciones ambientales externas. Las paredes celulares de las bacterias Gram-positivas y Gram-ne- gativas poseen una caracteristica molecular comin: en ambas existe un rigido esqueleto peptidoglucano o mureina. La unidad basica que se repite en la estructura del peptidoglucano es la del disacérido con- stituide por N-acetil-D-ghicosamina y el acido N-acetilmuramico. En las células Gram-positivas la capa de peptidoglucano es mucho més gruesa que en las células Gram-negativas. En éstas la capa de peptidoglucano se encuentra localizada en el espacio periplésmico en- lazandose covalentemente a las lipoproteinas de la capa exterior de la pared celular, El espacio periplasmico esta constitufdo por una sustancia seme- jante a un gel, que contiene una alta concentracién de enzimas degrada- tivas y proteinas de transporte. La estructura del peptidoglucano de la pared celular bacteriana es resistente a la accién de las enzimas que hidrolizan los péptidos, las cuales no atacan a los péptidos que contienen D-aminodcidos como los que se encuentran en la estructura de la pared (como D-alanina y D- glutamina). En las células Gram positivas la enzima lisozima se utiliza para el rompimiento celular ya que su mecanismo de accidn es el rompimiento