MEDICIÓN DE VIABLES O DILUCIONES SERIADAS

Daniela Espindola
Jasbleidy Hernández
Indira Gómez
Yisleinyth Meléndez

2017

Universidad Manuela Beltrán

Ingeniería Ambiental
Biotecnología Ambiental
 CONTENIDO 2
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................................................3
OBJETIVOS ...............................................................................................................................................................3
JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................................................3
1. MARCO TEÓRICO ..........................................................................................................................................4
1.1. Métodos para el conteo de microorganismos viables ...............................................................................4
1.2. Factor de dilución......................................................................................................................................4
1.3. Características Pseudomonas ....................................................................................................................5
1.4. Diluciones en la biorremediación..............................................................................................................5
1.5. Diluciones en el medio ambiente ..............................................................................................................6
2. MATERIALES Y MÉTODOS ..........................................................................................................................6
3. RESULTADOS .................................................................................................................................................7
4. DISCUSIÓN ......................................................................................................................................................9
5. CUESTIONARIO ............................................................................................................................................10
6. CONCLUSIONES ...........................................................................................................................................12
7. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................................13
 3
INTRODUCCIÓN

En Colombia, la problemática actual de los sitios contaminados con hidrocarburos, se debe a que hace unos años
no existía una conciencia del grado de dificultad y del enorme costo de la remediación de suelos, cuerpos de agua
y atmósfera contaminados, lo que representa hoy para la sociedad un gran costo económico (Kantachote, 2011).
Dicha contaminación está ocasionando el deterioro progresivo de la calidad del medio ambiente y genera una
amenaza real a la salud pública, así como la extinción de gran cantidad de especies vegetales y animales. Por esto,
en este trabajo se pretende determinar la capacidad degradadora de gasolina de Pseudomona aeruginosa,
mediante el uso de diluciones seriadas y el cultivo de las mismas en agar nutritivo y en agar gasolina. La
determinación de la misma, permitirá establecer su potencial para la biodegradación de los suelops contaminados
con hidrocarburos.

OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la capacidad de degradación de gasolina por parte de la cepa Pseudomona aeruginosa, utilizando
diferentes diluciones.

Objetivos específicos

 Realizar diluciones de 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa para observar el
crecimiento de microorganismos de acuerdo con su concentración inicial.
 Medir la absorbancia de las diluciones por medio del espectrofotómetro para cuantificar la cantidad de
células presentes en cada una.
 Realizar la siembra de cada dilución en cajas de Petri con agar nutritivo y agar gasolina.
 Aplicar los conceptos posteriormente recuperados en clase teórica y laboratorio.
 Obtener habilidades para el uso de instrumentos de laboratorio, en el manejo de cepas bacterianas y la
evaluación en biorremediación.

JUSTIFICACIÓN

Esta práctica de laboratorio se llevó a cabo con el fin de aplicar los conceptos adquiridos en teoría de una manera
práctica, para así ver como utilizando un tipo de cepa y las diluciones seriadas influyen en el crecimiento de
microorganismos. De igual manera se adquirieron habilidades para realizar diluciones y posterior a esto poder ser
transferidas a un medio de cultivo; ayudando esto para la vida que nos espera profesionalmente como Ingenieros
Ambientales para identificar por medio de estas la presencia de microorganismos que puedan llegar a estar
presentes en los diferentes problemas ambientales que se presentan en nuestro alrededor ya sea por medio del
recurso agua, suelo, etc.
1. MARCO TEÓRICO 4
1.1.1. Métodos para el conteo de microorganismos viables

1.1.2. Recuento en placa

El recuento en placa es uno de los métodos más utilizados para determinar cuál es el número de
microorganismos viables en un medio líquido. Cuando la concentración es baja se procede a filtrar la muestra
a través de una membrana que será pasada al medio de cultivo, en una caja de Petri. Los microorganismos
retenidos en la membrana se desarrollarán formando colonias, permitiendo su cuantificación. Cuando la
concentración es alta, se procede a la preparación de diluciones seriadas en una secuencia de 1:10,
alcanzándose diluciones de 10−7 o mayores. Pequeñas partes que son tomadas del volumen de esas diluciones
son sembradas en medio nutritivo en placa, donde las bacterias se desarrollan formando colonias (Vermelho,
2006).

1.1.3. Método de diluciones seriadas

Cuando una muestra contenga muchos microorganismos que superen las 300 UFC se recomienda realizar
diluciones seriadas que faciliten el conteo y permita obtener resultados confiables; luego de las diluciones, se
siembran las placas y se procede a hacer el conteo del número de colonias que debe ser multiplicado por el
factor de dilución para obtener las UFC por mililitro de muestra original (Medidas directas del crecimiento
microbiano, 2003).

1.1.4. Recuento en placa por siembra en profundidad

Consiste en añadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50ºC sobre caja de Petri que contiene una cantidad
determinada de la muestra diluida. Se tapa la caja y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar
solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un
método generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios. (julia, 2010).

1.1.5. Recuento en placa por siembra en superficie

Consiste en la siembra de un volumen conocido de la dilución de la muestra sobre la superficie de un medio

de cultivo en caja de Petri. En este método todas las colonias crecen sobre la superficie del medio.
Generalmente se utiliza esta técnica para el recuento de bacterias aerobias (julia, 2010)

1.2. Factor de dilución

Para obtener diferentes concentraciones de muestras se requiere realizar diluciones de la misma, para esto se
emplea el Factor de Dilución, el cual se presenta así (julia, 2010):

Dónde:
F.D = Factor de Dilución
VF= Volumen final que se coloca de la muestra
VT= Volumen total (VF+ Vestante para completar)
C = Concentración 5

Tabla 1. Diluciones Seriadas

Tubo Concentración Ml de medio ml de solución (medio + Factor de
liquido inóculo) dilución
1 0.01 (10-2) 9 ml 1 ml de la solución 0.1 1/10

2 0.001 (10-3) 9 ml 1 ml de la solución 0.01 1/100

3 0.0001 (10-4) 9 ml 1 ml de la solución 0.001 1/1000

4 0.00001 (10-5) 9 ml 1 ml de la solución 0.001 1/10000

Tomado de: (http://photos1.blogger.com/blogger/263/2594/1600/Dibujo.0.jpg)

1.3. Características Pseudomonas

Las bacterias Pseudomonas, son microorganismos que tienen una gran versatilidad metabólica, por ende son
grandes biorremediadores en el medio ambiente, esto se debe a que las Pseudomonas son un gran grupo de
bacteria que degradan compuestos que otros microorganismos no pueden, esto los convierte en un
microorganismo óptimo para esta práctica ya que gracias a eso podemos usarlo para las diluciones, porque a
pesar de que sea expuesto a un ambiente nuevo y además con muy bajas concentraciones, este con sus
plásmidos que son catabólicos con genes que ayudan a codificar las enzimas involucradas en el proceso de
degradación, amplían en gran manera el campo de degradación. (Alanis & Guerrero, 2004)

Existe un tipo de Pseudomona que ayudan a degradar hidrocarburos del petróleo están usan el proceso
mencionado en el párrafo pasado para degradar y poder crecer, estas son llamadas Pseudomonas spp, lo más
abundante en el petróleo son los n-alcanos, los cuales pueden ser degradados por distintas rutas metabólicas
de la Pseudomona, una de estas rutas deja como producto final a estos n-alcanos en ácidos grasos. (Alanis &
Guerrero, 2004)

1.4. Diluciones en la biorremediación

La importancia de las diluciones seriadas en la biorremediación está muy ligada en que se puede saber qué
tipo de microorganismos son los que se necesitan para hacer la biorremediación de algún compuesto o metal
pesado, ya que también depende no solo del microorganismo sino también de la concentración que este tenga
cuando se expone al ambiente (Gasol y Torralba, 2009).

También gracias a esto podremos saber cuál es el tipo de microorganismo que actúa en la biorremediación
porque en una concentración muy alta o en una población muy alta no tendremos este único microorganismo,
sino que tendremos otros y en pequeñas proporciones al momento de hacer las diluciones podemos filtrar o
hacer que estemos más seguros que la concentración que tenemos es totalmente del microorganismo que
creemos tener (Gasol y Torralba, 2009).
1.5. Diluciones en el medio ambiente 6
Si se quiere lograr que un microorganismo haga una degradación, pero aún no se sabe cuál es podemos
utilizar las diluciones ya que, con estas de un ambiente con microorganismos mixtos, se puede obtener el que
queremos, por medio de las diluciones y así evitar que en el ambiente se expongan microorganismos que
pueden no solo ser nocivos para el medio ambiente sino también para el ser humano (Gasol y Torralba,
2009).

2. MATERIALES Y MÉTODOS
Los materiales usados en esta práctica son los siguientes:
 Pipeteador y puntas estériles para 1 ml. (1 por grupo)
 Tubos de ensayo (4 por Grupo)
 Gradillas para tubo de ensayo (1 por grupo)
 Espectrofotómetro (1)
 Celdas esterilizadas. (4 por grupo)
 Tubos de ensayo con Agua Peptonada al 0.1% (4 por grupo)
 15 ml de Caldo Nutritivo con cultivo bacteriano (Pseudomona Aeruginosa)
 Cajas de Petri con agar nutritivo (1 por grupo)
 Cajas de Petri con Agar gasolina debidamente esterilizadas (3 por grupo)

La metodología seguida se describe a continuación:

1. Se realizó la entrega de los materiales por parte de la docente, siendo estos: 4 tubos de ensayo con
agua peptonada al 0,1%, una gradilla, un pipeteador automático, dos puntas estériles, y cuatro celdas
para el espectrofotómetro.
2. Se marcaron los cuatro tubos de ensayo con el valor del factor de dilución (10-1, 10-2, 10-3 y 10-4) con
un marcador sharpie para evitar confusión.
3. El compañero Sergio Herrera Gonzales repartió un 1 ml de caldo nutritivo en el tubo de ensayo
número 1 (10-1) que contenía 9 ml de agua peptonada al 0.1%, y luego se agito para homogeneizar la
muestra.
4. Al segundo tubo de ensayo que contenía 9 ml de agua pectonada, se le agrego 1 ml de la dilución 10−1
usando la pipeta automática, obteniendo una disolución de 10−2, que luego se agito para
homogeneizar la muestra.
5. Se tomó el tercer tubo y se le agregó 1 ml de la disolución 10−2, se agitó y se obtuvo la dilución 10−3.
6. Se toma el cuarto tubo y se le agregó 1 ml de la disolución 10−3, se agitó y se obtuvo la dilución 10−4
7. Después de tener las cuatro diluciones, se agregaron a las celdas, y se pusieron junto con un blanco en
el espectrofotómetro. Luego, se registraron las mediciones obtenidas para cada uno de los cinco
grupos.
8. En las cuatro cajas de Petri entregadas al inicio de la clase (debidamente marcadas), se hace la
siembra en cada una de ellas de 0.2 ml de cada dilución. En las tres cajas de agar gasolina se
sembraron las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3, y en la caja de agar nutritivo se sembró la dilución 10-4.
9. Se agrupan las cajas, y se les coloca cinta adhesiva debidamente marcada con el nombre del grupo y
la fecha, y se incuba a 37 °C.
 10. Pasadas 24 horas, se observa el crecimiento en cada una de las cajas de Petri, y se realiza el conteo7
de las colonias.
11. Pasadas 48 horas, se vuelve a observar el crecimiento, se toman los datos pertinentes y se desechan
las cajas de Petri.
12. Se realizan gráficas y tablas, que permitan presentar los resultados recuperados.

3. RESULTADOS
Los datos de absorbancia recuperados de las diluciones sucesivas (10-1, 10-2, 10-3 y 10-4) realizadas a partir de una
solución madre que contenía un cultivo se Pseudomona aeruginosa, se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Datos de absorbancia para cada factor de dilución.

Absorbancia
Concentración G1 G2 G3 G4 G5
0,1000 0,006 0,004 0,004 0,003 0,004
0,0100 -0,003 0,002 -0,003 -0,005 -0,006
0,0010 0,031 -0,003 0,008 0,002 -0,003
0,0001 0,03 0,005 -0,005 0,085 0,004

A partir de estos datos, se elaboró una gráfica de absorbancia vs factor de dilución (Figura 1). Ésta representa, la
concentración de células en cada dilución, ya que se considera que la absorbancia es proporcional a la cantidad de
células en una muestra (Martínez, 1990).

Absorbancia vs Factor de dilución

0.035

0.03

0.025

0.02
Absorbancia (UNT)

G1
0.015
G2
0.01 G3

0.005 G4

0
0.1000 0.0100 0.0010 0.0001
-0.005

-0.01
Factor de dilución

Figura 1. Absorbancia vs factor de dilución.

 8
-1 -2 -3
Por otra parte, el número de colonias de Pseudomona aeruginosa presentes en las diluciones 10 , 10 y 10 ,
cultivadas en el agar gasolina, no pudo ser determinado, debido a que solo se observó un crecimiento leve en
éstas, por lo que las colonias no eran fácilmente diferenciables, sino que solo se podía determinar la silueta del
área en la que estaban comenzando a crecer. En cambio, en el agar nutritivo, las colonias de Pseudomona
aeruginosa eran diferenciables, pero superaban las 300 colonias, por lo que se consideran como incontables
(Izurieta, N). Por esto, no puedo determinarse el número de UFC/ml en ninguna de las diluciones, y se usó otro
método aproximado para graficar su crecimiento. En este método, se dividió la caja de Petri en cuatro partes
iguales (Figura 2), y mediante la observación del contorno del crecimiento de la bacteria en cada caja de Petri, se
determinó el porcentaje que ocupaba con respecto al área total de la caja de Petri (Tabla 2). Luego, estos
porcentajes se graficaron en función del factor de dilución (Figura 3).

Figura 2. Contorno del área de crecimiento de Pseudomona aeruginosa en 48 horas. a) Dilución 10-1; b)
dilución10-2; c) dilución10-3; d) dilución 10-4.

Tabla 2. Porcentaje de crecimiento aproximados de Pseudomona aeruginosa en cuanto al contorno del área de la
caja de Petri ocupada.
Crecimiento
Factor de dilución 24 h 48 h
0,1000 20 25
0,0100 35 37
0,0010 30 32
0,0001 85 90
 9

Crecimiento vs Factor de dilución

100

90

80

70
Crecimiento (%)

60

50
24 h
40 48 h
30

20

10

0
0.1000 0.0100 0.0010 0.0001
Factor de dilución

Figura 3. Porcentaje de crecimiento aproximados de Pseudomona aeruginosa en cuanto al contorno del área de la
caja de Petri ocupada.

4. DISCUSIÓN
A partir de los resultados recuperados, puede observarse que la absorbancia en cada una de las diluciones seriadas
no muestra una tendencia inversamente proporcional entra la turbiedad y el factor de dilución, como lo establece
la teoría. Esto quiere decir, que entre más diluida este la dilución, menor es la cantidad de absorbancia. Es por esto
que, al estar más diluida la dilución 10-4, la turbiedad debería ser menor en un factor de 0,0001 respecto a la
concentración inicial, mientras que en la dilución de 10-1, la turbiedad debería ser menor en un factor de 0,1
respecto a la concentración inicial. Sin embargo, los valores de turbiedad (G2), fueron de 0.004, 0.002, -0.003 y
0.005 UNT, para las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4, respectivamente, los cuales no muestran la tendencia
descrita anteriormente. Estos valores negativos recuperados, pueden presentarse porque la sensibilidad del
espectrofotómetro no es suficiente para medir pequeñas cantidades de muestra (BVSDE, 2005), como sucedió en
la dilución 10-3.

Por otra parte, el crecimiento celular en las cajas de Petri con Agar Gasolina para las diluciones 10-1, 10-2, y 10-3,
tampoco muestra una tendencia inversamente proporcional entre el crecimiento y el grado de dilución. Esto quiere
decir, que entre más diluida este la dilución, menor es el crecimiento de la bacteria. De esta manera, el
crecimiento en 48 horas en la dilución 10-1 (25%) es menor a la dilución 10-2 (37%). Esto pudo deberse, a que la
temperatura no era uniforme en todas las cajas Petri lo que pudo causar que el crecimiento en la dilución 10-1
fuera menor con respecto a la dilución 10-2.
 10
En la figura 3, también se puede observar la comparación entre el crecimiento de Pseudomona aeruginosa en agar
gasolina (10-1, 10-2 y 10-3) y en agar nutritivo (10-4), en donde el agar nutritivo puede considerarse el blanco en
cuanto al crecimiento normal que se obtendría en 48 horas de la bacteria. La diferencia entre el porcentaje de
crecimiento en agar nutritivo y agar gasolina, se debe principalmente a que la disponibilidad de nutrientes no es la
misma, teniendo el agar gasolina como única fuente de nutrientes la gasolina, la cual puede ser más difícil de
metabolizar para la bacteria. También, pudo ocurrir que la concentración de gasolina era muy alta, y dificultaba el
crecimiento de la bacteria. Sin embargo, aunque el porcentaje de crecimiento es menor, puede concluirse que
Pseudomona aeruginosa puede degradar gasolina, ya que se observó el crecimiento de la misma en el medio. Esta
capacidad de degradar hidrocarburos, se debe, según Rodríguez, et al. (2011), a que muchas especies del genero
Pseudomona contienen plásmidos en los que se encuentran enzimas capaces de degradar compuestos orgánicos
derivados del petróleo.

5. CUESTIONARIO

1. ¿Se observa que las Pseudomonas consumen la gasolina o el pesticida?

Se observa que las Pseudomonas consumen gasolina ya que las sepas rompen los enlaces de carbono y
posterior se alimentan del carbono degradando más rápido la gasoline.

2. Consulte las rutas metabólicas utilizadas por los microorganismos para la degradación de
hidrocarburos alifáticos y aromáticos.

Degradación de hidrocarburos alifáticos en presencia de oxigeno

Según lo establecido por la Universidad Autónoma de Barcelona (2012). los hidrocarburos alifáticos se pueden
clasificar en alcanos, alquenos y alquinos, encontrando alcanos de cadena larga los cuales son resistentes a la
biorremedacion pero si se pasa del peso de 500 no funciona correctamente el crecimiento microbiano, por lo cual
se va a reducir la tasa de biodegradación, la ramificación interfiriendo carbonos de cuarta y tercera generación.
Los microorganismos deben tener enzimas monooxigenasas que dependen del oxígeno. Los microorganismos
deben oxidar primero la última molécula con ayuda del oxígeno y el complejo multienzimatico, obteniendo el
hidrocarburo con un grupo alcohol, pero con ayuda de otra enzima el alcohol se oxida hasta grupo aldehído y
finalmente obtenemos carboxílico resultando una molécula de ácido graso y se degrada a acetilCoA por
oxidación.
 11

FUENTE:http://bioinformatica.uab.es/biocomputacio/treballs0203/RBurgos/dades/degradaci%C3%B3n_de_hidro
carburos.htm

Degradación de hidrocarburos aromáticos en presencia de oxigeno

En el caso de los hidrocarburos aromáticos, Principalmente es romper el anillo aromático utilizando una enzima
monooxigenasa.

FUENTE:http://bioinformatica.uab.es/biocomputacio/treballs0203/RBurgos/dades/degradaci%C3%B3n_de_hidro
carburos.htm

3. Consulte las rutas metabólicas utilizadas por los microorganismos para la degradación de
pesticidas.
 12

FUENTE:
https://www.researchgate.net/publication/284162457_Bioremediation_of_a_pesticide_polluted_soil_case
_DDT

4. Consulte otras técnicas para el conteo de poblaciones de microorganismos.

Medida de la Biomasa
Peso húmedo: Martínez (2010) Se obtiene de la separación de las células por centrifugación, donde se tiene que
tener en cuenta ya que el diluyente queda en el espacio intercelular contribuyendo al peso de la masa.

Peso seco: Izurieta. (2011). Los sólidos que hacen parte del suelo seco se obtiene por el secado de un horno a
105°C hasta llegar a un peso constante. Esta técnica es para muestra grandes, debido a que representan el peso de
un gran número de bacterias.

Determinación de ácidos nucleicos: Determina indirectamente la masa de una población bacteriana.

Incorporación de precursores radiactivos: Permite adicionar un compuesto marcado radiactivamente que puede ser
incorporado a la célula.

6. CONCLUSIONES
La cepa Pseudomona aeruginosa puede degradar gasolina, ya que se observó el crecimiento de la misma en el
medio. Esta capacidad para degradar gasolina se debe a que, según Rodríguez, et al. (2011), contienen plásmidos
en los que se encuentran enzimas capaces de degradar compuestos orgánicos derivados del petróleo. Por otra
parte, el crecimiento de ésta fue menor en el agar gasolina en comparación con el agar nutritivo, que puede
tomarse como el blanco en la práctica, ya que la metabolización de la misma puede ser más lenta debido a que
presenta una estructura química más complicada. También, el poco crecimiento en el agar gasolina pudo deberse a
que la concentración de esta última era muy alta. Por otra parte, la relación inversamente proporcional entre el
grado de dilución de la muestra y el crecimiento de la bacteria no pudo ser observado. Esto pudo deberse a la13
temperatura no era uniforme en todas las cajas de Petri. Además, los valores negativos obtenidos en la medición
de la turbiedad pudieron deberse a que la sensibilidad del espectrofotómetro no era suficiente para medir la
pequeña cantidad de muestra en algunas diluciones, como en la dilución 10-3. Por lo anterior, puede también
concluirse que la cepa de Pseudomona aeruginosa puede ser usada en la biorremediación de suelos contaminados
con hidrocarburos.

7. BIBLIOGRAFÍA
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ddcddc_bd&ei=UTF8&u=http://cc.bingj.com/cache.aspx?q=recuento+del+numero+de+bacterias&d=495
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