Electroforesis en gel

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Gel de electroforesis.
La electroforesis en gel es un grupo de t�cnicas empleadas por los cient�ficos para
separar mol�culas bas�ndose en propiedades como el tama�o, la forma o el punto
isoel�ctrico. La electroforesis en gel se utiliza generalmente con prop�sitos
anal�ticos, pero puede ser una t�cnica preparativa para purificar mol�culas
parcialmente antes de aplicar espectrometr�a de masas, PCR, clonaci�n o
secuenciaci�n de ADN.

�ndice
1 Significado
2 Aplicaciones
2.1 �cidos nucleicos
2.2 Prote�nas
3 Concentraci�n del gel
3.1 Concentraci�n de agarosa
3.2 Concentraci�n de poliacrilamida
4 Corriente el�ctrica
5 Revelado y visualizaci�n
6 Tipos
7 Referencias
8 Bibliograf�a
9 Enlaces externos
Significado

Esquema de preparaci�n de un gel de electroforesis horizontal. La placa que se

observa se introduce a continuaci�n en una cubeta rellena de tamp�n de
electroforesis y conectada a los electrodos.
La segunda parte del n�cleo, gel se refiere a la matriz usada para separar las
mol�culas. En muchos casos un gel es un pol�mero entrelazado de porosidad
controlable. Cuando la separaci�n es de prote�nas, ADN o �cidos nucleicos peque�os
(ADN, ARN o ribonucle�tidos), el gel est� compuesto por diferentes concentraciones
de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la polimerizaci�n, para producir
redes de poliacrilamida de diferentes tama�os. Para separar �cidos nucleicos
grandes (m�s de unos centenares de bases), la matriz empleada es agarosa
purificada. En ambos casos, el gel forma una matriz s�lida pero porosa. La
acrilamida, en contraste con la poliacrilamida, es una neurotoxina y debe ser
manipulada con precauci�n.

La primera parte del nombre, electroforesis, se refiere a la fuerza electromotriz

que es empleada para desplazar las mol�culas a trav�s del gel. Al situar las
mol�culas en el gel y aplicar una diferencia de potencial el�ctrico, las mol�culas
se mueven a diferentes velocidades, hacia el c�todo, si est�n cargadas
positivamente, y hacia el �nodo, si est�n cargadas negativamente (en una
electroforesis, los electrodos se comportan igual que en una cubeta electrol�tica).

Aplicaciones
�cidos nucleicos
En los �cidos nucleicos la direcci�n de migraci�n es del electrodo negativo al
positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto az�car-
fosfato. En los fragmentos de ADN dobles (con estructura de doble h�lice) la
velocidad de migraci�n es inversamente proporcional a su tama�o. En fragmentos
simples de ADN y ARN (una sola cadena), dichas mol�culas tienden a plegarse de
forma compleja y a migrar de forma m�s complicada, seg�n la estructura terciaria
formada tras el plegamiento. Sin embargo, compuestos que puedan romper los enlaces
de puente de hidr�geno, como el hidr�xido de sodio o la formamida, son empleados
para 'desplegar' las mol�culas plegadas y permitir que la velocidad de migraci�n
dependa �nicamente y exclusivamente del tama�o y no de la estructura formada tras
el plegamiento.1?

Prote�nas
Las prote�nas no tienen una estructura predecible como los �cidos nucleicos, y por
tanto sus velocidades de migraci�n no son similares entre las prote�nas. Incluso
puede que no migren ni al aplicar una fuerza electromotriz (al encontrarse en su
punto isoel�ctrico). En estos casos, las prote�nas se desnaturalizan mediante la
adici�n de un detergente como el dodecilsulfato s�dico/dodecilfosfato s�dico
(SDS/SDP) y un agente reductor como el 2-mercaptoetanol. Los detergentes otorgan
una carga neta negativa a la prote�na que les permite migrar a trav�s del gel de
poliacrilamida en relaci�n directa a su masa, ya que la cantidad de cargas
negativas que se unen a la prote�na depende del tama�o de �sta, existiendo una
relaci�n carga/masa similar. Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces
disulfuros, separando a la prote�na en sus sub-unidades. Adem�s, la
desnaturalizaci�n hace que pierdan su estructura terciaria y cuaternaria por tanto
su velocidad de migraci�n es proporcional al tama�o y no a su estructura terciaria
ni a su interacci�n con otras macromol�culas. As�, los m�s grandes se desplazan m�s
lentamente.1?

Concentraci�n del gel

Concentraci�n de agarosa
La concentraci�n de agarosa depender� siempre del tama�o del �cido nucleico que se
desea analizar. Esto es importante, debido a que permitir� una mejor resoluci�n de
las muestras si el porcentaje de concentraci�n es el adecuado. Usualmente los
porcentajes de concentraci�n van desde el 0.2% hasta un 6%, dependiendo del n�mero
de pares de bases (pb), como se observa en la Tabla 1. A mayor concentraci�n del
gel, los poros ser�n m�s peque�os por lo que se podr�n apreciar aquellos fragmentos
con un n�mero pb menor y viceversa.1?

Tabla 1. Recomendaciones de concentraciones de geles de agarosa para diferentes

tama�os de ADN.1?

% de Agarosa Tama�o del fragmento de ADN (pb)

0.3 > 700 pb
0.5 700 pb a 25000 pb
0.8 500 pb a 15000 pb
1.0 250 pb a 12000 pb
1.2 150 pb a 6000 pb
1.5 80 pb a 4000 pb
2.0 100 pb a 3000 pb
3.0 500 pb a 1000 pb
4.0 100 pb a 500 pb
6.0 10 pb a 100 pb
Concentraci�n de poliacrilamida
As� como en el caso de la agarosa, determinar la concentraci�n apropiada para las
mol�culas que se van a evaluar por medio de un gel de poliacrilamida resulta
crucial. El tama�o de los poros de estos geles est� determinada por la
concentraci�n final de acrilamida y biscacrilamida, de los cuales usualmente hay
una proporci�n 19:1 para la observaci�n de DNA o RNA desnaturalizado y una
proporci�n de 29:1 para la mayor�a de las prote�nas y geles nativos para DNA y RNA
(Tabla 2, Tabla 3). Si se regula adecuadamente la relaci�n y concentraci�n de
acrilamida con poliacrilamida se podr�n obtener diferentes porosidades, que ser�n
menores que la de geles de agarosa.2?

Tabla 2. Concentraci�n de gel de poliacrilamida y relaci�n de acrilamida y

biscacrilamida para ADN/ARN nativo y desnaturalizado seg�n su n�mero de pb.2?
Proporci�n
Acrilamida/bisacrilamida

% del gel ADN/ARN

Nativo

(bp)

ADN/ARN
desnaturalizado

(bp)

19:1 4 100-1500 70-500

6 60-600 40-400
8 40-500 20-200
10 30-300 15-150
12 20-150 10-100
29:1 5 200-2000 70-800
6 80-800 50-500
8 60-400 30-300
10 50-300 20-200
12 40-200 15-150
20 <40 <40
Tabla 3. Concentraci�n del gel de poliacrilamida para la visualizaci�n de prote�nas
seg�n su peso molecular.3?

Proporci�n
Acrilamida/bisacrilamida

% del gel Peso molecular de la prote�na (kDa)

29:1 7.5 25-500
10 15-300
12 10-200
15 10-45
20 5-40
Corriente el�ctrica
Para generar la movilidad de las muestras a lo largo de sus carriles se requiere
una fuente de poder que genere una corriente el�ctrica. El voltaje que debe de ser
aplicado depende del gel y de las muestras que se desean analizar. Usualmente la
acrilamida es capaz de soportar una mayor corriente que la agarosa, sin embargo si
el voltaje resulta ser demasiado, las bandas pueden verse difusas. Asimismo, si la
corriente aplicada resulta ser excesiva para el sistema, puede provocar el
derretimiento del gel, una curvatura en las bandas y un resoluci�n. En caso de ser
un voltaje insuficiente, la movilidad de las bandas m�s peque�as se ver�
perjudicada y por lo tanto no se apreciar� una adecuada visualizaci�n de las
muestras .2? Tomando todo esto bajo consideraci�n, se recomienda voltajes de 25 a
100 V para geles de agarosa, mientras que para geles de poliacrilamida es
importante conocer el largo del gel para determinar el voltaje apropiado. La
distancia medida desde la parte superior hasta la parte inferior del gel se
multiplica por un valor dentro del rango de 8-15 V, lo que permitir� determinar el
voltaje de corrimiento apropiado .1?

Revelado y visualizaci�n

Cubeta para an�lisis de geles por electroforesis.

Cuando se ha completado la electroforesis, las mol�culas m�s peque�as han llegado
al �nodo. Entonces se pueden 'revelar' mediante la adici�n de un colorante
espec�fico para hacerlas visibles. Se emplean compuestos como el bromuro de etidio,
para los �cidos nucleicos, o tinci�n de plata, azul de coomassie o tinci�n
fluorescente, para las prote�nas. Asimismo se emplean otros m�todos para visualizar
la separaci�n de la mezcla en el gel. Si el reactivo es fluorescente bajo la luz
UV, se puede simplemente hacer una fotograf�a de la placa bajo dicha luz. Tambi�n,
si las mol�culas contienen �tomos radiactivos se puede efectuar una
autorradiograf�a.

Si se han inyectado varias mezclas una junto a otra en la placa, se producir�n

separaciones paralelas (carriles). Cada carril mostrar� distintas bandas
correspondientes a cada componente de la mezcla. Si dos componentes poseen la misma
masa las separaciones ser�n incompletas, por lo cual ambas bandas se ver�n
solapadas.

Las bandas en diferentes carriles que se encuentran a la misma altura contienen

mol�culas que han atravesado el gel a la misma velocidad. Existen marcadores
especiales que contienen una mezcla de mol�culas de tama�o conocido. Si se hace una
electrofor�sis de una mezcla desconocida y se agrega un carril con un determinado
marcador, las bandas observadas en el marcador pueden ser comparadas con las
obtenidas en la mezcla desconocida para determinar su tama�o o punto isoel�ctrico.
Sabiendo que el desplazamiento de las mol�culas es proporcional al logar�tmo de la
masa, se puede estimar el peso molecular de una mol�cula de inter�s compar�ndola
con el patr�n de migraci�n de los marcadores. Esto se realiza construyendo una
curva con los valores del marcador, d�nde el eje (y) representa el logaritmo del
peso molecular y el eje (x) representa el Rf de cada banda. Luego, se calcula el Rf
de la mol�cula inc�gnita y se extrapola en la curva el logartimo del peso
molecular. Aplicando el antilogar�tmo se obtiene el peso molecular de la prote�na
inc�gnita.

Tipos
La electroforesis en gel se utiliza en biolog�a molecular, gen�tica y bioqu�mica:

La electroforesis en gel de muestras grandes de ADN y ARN se efect�a en geles de

agarosa.
La electroforesis de prote�nas se lleva a cabo en geles de poliacrilamida-SDS (SDS-
PAGE), isoelectroenfoque, geles nativos o electroforesis bidimensional.
Electroforesis capilar.
Electroforesis de ADN.
Zimograf�a o zimogramas
Extracci�n en gel.
Electroforesis en gel de campo pulsado.4?
Referencias
Salazar Montes, Adriana (2013). �Electroforesis�. Biolog�a Molecular. Mc Graw
Hill. ISBN 9786071509123.
Magdeldin, Sameh (2012). Gel electrophoresis -Principles and Basics (en ingl�s).
InTech. ISBN 9789535104582.
An�lisis de prote�nas. Electroforesis, transferencia e inmunodetecci�n.. Advansta
Corportation. 2011.
Centers for Disease Control and Prevention (18 de julio de 2013). �Pulsed-field
Gel Electrophoresis (PFGE)� (en ingl�s). Consultado el 7 de septiembre de 2013.