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PRÁCTICAS DE FUNDAMENTOS DE
MICROBIOLOGÍA
Curso 2007-2008
Material a esterilizar
Pipetas
Asa de siembra
Asa de vidrio
Procedimiento
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dejando la cara brillante del papel hacia fuera. Finalmente, se depositan las pipetas en el
Horno Pasteur.
Material
Objetivo
Procedimiento
1.- Los tubos, tanto el que contiene el cultivo puro del microorganismo como el que
contiene el medio virgen, se deben tomar con la mano izquierda. Con la mano derecha
se toma el asa y se esteriliza a la llama del mechero, hasta que se pone al rojo.
2.- Se destapa el tubo que contiene el microorganismo, tomando el tapón con el dedo
meñique de la mano derecha. Se esteriliza la boca del tubo pasándolo ligeramente por la
llama del mechero. Se introduce el asa, se roza suavemente la superficie del cultivo, y se
saca el asa con cuidado para no tocar las paredes del tubo. Se esteriliza la boca del tubo
y se cierra.
3.- Se abre el tubo que contiene el medio virgen y se esteriliza la boca en la llama del
mechero. Se introduce el asa de siembra (que contiene una muestra del
microorganismo) hasta el fondo del tubo. Al sacar de nuevo el asa se avanza en zig-zag
sobre la superficie del agar. De esta forma se extiende el microorganismo en la
superficie del medio sólido. Se flamea la boca del tubo antes de cerrarlo de nuevo, y el
asa de siembra se esteriliza a la llama del mechero.
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Los tubos inoculados se incuban en una estufa a 37 ºC durante 24 horas, escribiendo el
nombre del microorganismo resembrado en el tubo nuevo.
a) Preparaciones en fresco
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b) Tinción de bacterias
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1) TINCIÓN SIMPLE
Procedimiento:
Frotis de la muestra
2) TINCIÓN NEGATIVA
Procedimiento:
3) TINCIÓN DE GRAM
Procedimiento:
Frotis de la muestra.
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Adición del colorante primario cristal violeta durante 2 minutos.
Procedimiento:
Fijación a la llama.
Las esporas aparecen coloreadas de verde mientras que las células vegetativas
presentan el color de la safranina.
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5) TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS
Procedimiento:
Fijar a la llama.
Procedimiento:
Fijar a la llama.
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Lavar con agua destilada, secar al aire y observar con objetivo de
inmersión.
Las micobacterias aparecen teñidas del color de la fuchsina, mientras que las
bacterias que no pertenecen a este grupo (la mayoría de las bacterias) aparecen teñidas
de azul.
A) Procariotas:
B) Eucariotas:
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Streptomyces sp Saccharomyces sp.
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5.- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE UNA POBLACIÓN MIXTA
Procedimiento:
1 2
3
4
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6.- AISLAMIENTO Y RECUENTO DE MICROORGANISMOS PRESENTES EN
UNA MUESTRA DE SUELO
Procedimiento:
De cada una de las diluciones anteriores se toma con una pipeta estéril 0,1 ml de
muestra y se deposita en el centro de una placa Petri con medio de cultivo PCA (Plate
Count Agar) o de recuento en placa. El inóculo se extiende sobre la superficie de la
placa con el asa de vidrio y finalmente las placas obtenidas (10-1 a 10-5) se incuban a 37
ºC durante 24-48 horas. Transcurrido este tiempo se determina el número de
microorganismos mesófilos viables presentes en la muestra analizada. Para ello se
emplea una placa que contenga entre 30-300 colonias aisladas. Con el número de
colonias contadas se determina el número de microorganismos viables o U.F.C.
presentes en 1 gramo de tierra utilizando esta fórmula.
N= C x 1/D x 1/i
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I = inóculo empleado.
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
1 gr. de tierra
(0,1 ml)
P.C.A
10-4 1 0-5
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7.- ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA. COLIMETRÍA PRESUNTIVA
Y CONFIRMATIVA
El Real Decreto 144/2003 establece los criterios sanitarios que deben cumplir las aguas
de consumo humano y las instalaciones que permiten su suministro desde la captación
hasta el grifo del consumidor y el control de éstas, garantizando su salubridad, calidad y
limpieza, con el fin de proteger la salud de las personas de los efectos adversos
derivados de cualquier tipo de contaminación de las aguas.
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Objetivo
Procedimiento:
1) COLIFORMES TOTALES
A) Colimetría presuntiva
Se emplea como medio de cultivo líquido el caldo McConkey que contiene lactosa y
un indicador de pH, el púrpura de bromocresol. Este medio a pH ácido es amarillo y a
pH básico o neutro es púrpura.
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Caldo McConkey
B) Colimetría confirmativa.
2) COLIFORMES FECALES
Indol (I):
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24 horas. Añadir, tras el periodo de incuabación 1-2 gotas del reactivo rojo de metilo
que es un indicador de pH que vira a color rojo a pH inferiores a 4,4 mientras es
incoloro a pH superiores. Una coloración roja para el tubo analizado indicará que la
prueba es positiva. La acidez generada en el tubo es debida a la producción de una
mezcla de ácidos por fermentación de la glucosa.
Citrato (C):
I M Vi C
Escherichia coli + + - -
Enterobacter aerogenes - - + +
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7) AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE LA GARGANTA
Material:
Procedimiento:
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Plan de realización de las prácticas
Día 1 (lunes).-
Día 2 (martes).-
Día 3 (miércoles).-
Día 4 (jueves).-
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NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP)
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MEDIOS DE CULTIVO
Composición (g/l agua destilada)
Agar nutritivo PCA (plate count agar) Agar soja Agar sangre
Caldo MacConkey Agar MacConkey VRBA (violet red bile agar) Agar Levine (Agar EMB)
Extracto de levadura 3
Lactosa 10 Lactosa 10 Lactosa 10 Lactosa 10
Peptona 20 Peptona 20 Peptona 7 Peptona 10
Sales biliares 5 Sales biliares 1,5 Sales biliares 1,5 Fosfato dipotásico 2
Cloruro sódico 5 Cloruro sódico 5 Cloruro sódico 5 Eosina amarilla 0,4
Púrpura de bromocresol 0,01 Rojo neutro 0,03 Rojo neutro 0,03 Azul de metileno 0,065
Cristal violeta 0,001 Cristal violeta 0,002
Agar 20 Agar 20 Agar 20
pH: 7,4 ± 0,2 pH: 7,2 ± 0,2 pH: 7,4 ± 0,2 pH: 7,1 ± 0,2