CRIOPRESERVACION DE SEMEN DE ALPACA: EXTRAIDO DEL

EPIDIDIMO
I. INTRODUCCION
La congelación de semen es una biotecnología reproductiva muy poco empleada
en camélidos sudamericanos (CSA). Las dificultades en la colección de semen y
en el manejo de las muestras seminales, debido a su alta viscosidad, y el escaso
conocimiento sobre dilutores apropiados para el semen de CSA se constituyen
en los principales factores que imposibilitan el desarrollo de protocolos de
criopreservación con resultados óptimos de calidad espermática post-
descongelamiento. Esto determina que la inseminación artificial quede
restringida al uso de semen fresco. Asimismo, se tiene que considerar la baja
concentración de espermatozoides y el alto porcentaje de anormales que, como
características usuales del semen de alpaca, incrementan la dificultad de obtener
parámetros espermáticos post-descongelamiento adecuados que permitan la
fecundación (Fernández-Baca y Calderón, 1966; Sumar y Leyva, 1981; Bravo et
al., 1997).
La selección de los machos en alpacas, ha estado dirigida solo a aspectos de
conformación, dejando de lado las características reproductivas. Una
consecuencia de esto es la alta incidencia de anormalidades de los genitales de
los machos reproductores.
Uno de los principales problemas existentes para el desarrollo de las
biotecnologías reproductivas es la dificultad en el manejo del eyaculado de
alpaca, por la alta viscosidad, motilidad y concentración espermática. No
obstante, al obtener semen proveniente del conducto deferente, es decir libre de
las glándulas accesorias, se espera facilitar el manejo y dilución del mismo, así
como no afectar la integridad de los espermatozoides a la congelación y post-
descongelación.
La concentración espermática es mayor cuando se obtiene directamente del
epidídimo a través del conducto deferente (Fernández-baca, 1971)
 II. OBJETIVOS
Evaluar el efecto de la criopreservación sobre la motilidad y viabilidad de
espermatozoides.
Obtener la tasa de recuperación de del semen.
III. REVISION BIBLIOGRAFICA
Los trabajos referidos a la congelación de semen de CSA muestran resultados

desalentadores en función a la calidad seminal post-descongelamiento. En

llamas, McEvoy et al. (1992) obtuvieron solo un 10% de motilidad al

descongelamiento de semen colectado por electroeyaculación; Von Baer y

Hellemann (1999) describen motilidades entre 16 y 28% en semen descongelado

de llama, probando la adición de un surfactante al 0.5% (Equex); mientras que

Aller et al. (2003) reportan 20% de espermatozoides mótiles.

En alpacas la utilización de dilutor (glicerol y yema de huevo) fue la

combinación estándar utilizada en la investigación, encontrándose un efecto

negativo para espermatozoides de esta especie. Con respecto a la viabilidad

espermática post-congelamiento, se obtuvo una tasa de sobrevivencia de 5 % de

espermatozoides extraído del epidídimo por lavado retrogrado. Gonzales,

Davalos et al. (2007)

En alpacas Banda, Ruiz (2008) evaluaron la motilidad, integridad funcional de

membrana y vitalidad/integridad acrosomal en las muestras descongeladas. La

motilidad fue de 14.0, 8.6 y 17.0% en los grupos Tris, Tes y leche descremada.

Se concluye que los tres dilutores brindan efectos similares para la

criopreservación de espermatozoides epididimarios de alpaca.

IV. MATERIALES
Testículos de alpaca con 4 mm de distancia y 12 gr. de peso aproximadamente.
Dilutor ANDROMED.
Nitrógeno liquido.
Pajillas de 0.25 ml.
Caja de tecnopor.
Equipo de disección.
Refrigeradora.
Jeringa de tuberculina y de 5 ml.
Microscopio
Placas petri
Porta y cubre objetos.
Ependorf
Tapón de PVP
V. METODOS
El método utilizado en clase fue explicativo-demostrativo.
Método explicativo.
-Se hablo sobre los tipos de dilutores, la importancia de la tasa de dilución, el uso de
antibióticos en el dilutor y sobre la solución madre.
-Un ejemplo de solución madre seria:
Ejemplo para alpacas.
-TRIS (Buffer)
-Acido cítrico
-Fructosa SOLUCION MADRE
-Agua
-Antibiótico
 El 50 % de la solución madre para refrigerar se adiciona yema de huevo
(medio de equilibrio), alpaca 20 %, ½ tiempo
 El 50 % de la solución madre para congelar se adiciona glicerol, alpaca
7 %, ½ tiempo.
Si tenemos 100 ml ------------------ 100 %
x ml ------------------- 20 % de yema de huevo Sol. madre

x = 80 ml de solución madre y el 20 ml de yema de huevo

-También en la división de la solución madre en dos partes, una para refrigerar en donde
se adiciona la yema de huevo y otra para congelar donde se adiciona glicerol.
-Se hablo sobre la concentración espermática: la cantidad de espermatozoides viables
que hay.
 La fórmula para hallar la concentración seria:
𝑪 = 𝐱̄ 𝐜𝐚𝐦𝐚𝐫𝐚𝐬 𝐱 𝐅𝐂 𝐱 𝐅𝐃 𝐱 𝐅𝐂
Donde:
C : Concentración.
x̄ : Promedio de las dos cámaras.
FC: Factor de corrección de la cámara.
FD: Factor de dilución.
FC: Factor de conversión.

-También se explico que para preparar la solución buffer en cantidad suficiente se

realiza calculando el Nº de dosis a preparar y la cantidad de dilutor necesario, de la
siguiente manera.
𝑉 𝑥 [ ]𝑥 % 𝑚𝑜𝑡𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑥 % 𝑑𝑒 𝑣𝑖𝑣𝑜𝑠
𝑁º 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑠𝑖𝑠 =
𝑁º 𝑑𝑒 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑚𝑎𝑡𝑜𝑧𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑑𝑜𝑠𝑖𝑠

Método demostrativo.
Procedimientos
El proceso de criopreservacion se define en 6 pasos
1. Colección de muestras.
2. Evaluación del semen (motilidad, viabilidad, volumen, número de
espermatozoides por dosis).
3. Hallar el número de dosis.
4. Preparación del dilutor y de la muestra.
5. Empajillado
6. Sellado con PVP (alcohol poli vinilico)
7. Colocación en el nitrógeno liquido
8. Almacenado
1. Colección y preparación de muestra
Lavar los testículos, luego extraer la parte de la cabeza del epidídimo.

En una Placa Petri se coloca la muestra extraída y se agrega 1mL de eseptal

para mantener los espermios vivos.

Se hace picadillo la muestra para que se combine con el eseptal. Se observa si la

muestra está bien en el microscopio.

2. La evaluación del semen y numero de dosis se omitieron en esta práctica.

3. Preparación del dilutor y la muestra
Para la dilución de utilizo el dilutor ANDROMED cuya tasa de dilución es 1:5,
por lo cual se tiene 1 ml de ANDROMED Y 4 ml de agua para completar la tasa de
dilución 5 ml.
En dos tubos ependorf se agrega la muestra más la solución del dilutor, en el tubo
A 2.5 ml y en el tubo B 2.5 ml
Se centrifuga a 3000 rpm durante 5 min.
Pasado los 5 min. Se verifica en el microscopio la motilidad de espermios.
El tubo A (50 %) es llevado al horno a 38 º C durante 10 minutos.
Luego se desciende la temperatura en la refrigeradora 4º C durante 10 minutos.
Pasado los 10 minutos se agrega el tubo B (50 %) se adiciona a la solución A.
Se realiza una observación al microscopio para verificar la motilidad.
4. Empajillado
Después de la adición del otro 50 %, la solución es colocada en las pajillas.

5. Sellado con PVP

Las pajillas son selladas con PVP (alcohol poli vinilico)

6. Colocación en el nitrógeno liquido

En la caja de tecnopor se coloca el nitrógeno líquido.
 Las pajillas son depositadas dentro de la caja más nitrógeno durante 10 minutos.

Pasado los 10 minutos, las pajillas son descongeladas con agua a 38 º C.

La punta sellada con PVP es cortada, con una gota del semen dentro de la pajilla
se procede con la evaluación de motilidad.
7. Almacenado
Las muestras pueden ser almacenadas por varios días.

VI. RESULTADOS
La criopreservacion de semen en la práctica en cuanto a la motilidad y
viabilidad, afecto de manera poco significativa puesto que antes y después de la
criopresrvacion se observo la motilidad en la muestra, esto es debido a que la
solución cuenta con criopreservantes y alimento para los espermios otro punto a
tener en cuenta es que los dilutores aumentan la cantidad y la concentración.
 La tasa de recuperación de semen aumenta, siempre y cuando la concentración
seminal supera la dosis normal para una alpaca (8 x 106), es decir para más de
una alpaca.
VII. CONCLUSION
La aplicación de dilutores en semen ayuda a utilizar y aumentar las dosis de
semen conjuntamente con la criopreservacion que es una técnica que ayuda a
almacenar o conservar el semen.
La aplicación de estas dos técnicas ayudan a aumentar y conservar semen si
alterar los parámetros de importancia como: % de vivos y motilidad

VIII. DISCUSION
La importancia de criopreservar espermatozoides de las especies animales como
la alpaca, el mejoramiento de esta técnica implicaría una mayor contribución
potencial, como favorecer el comercio nacional e internacional de un animal con
características genéticas deseables, siempre y cuando los animales ya sean
mejorados, también la formación de bancos de germoplasma, reserva genética,
conservación de raza.
La motilidad probablemente es el parámetro más cercano a medir la viabilidad
de los espermatozoides, la observación visual de la motilidad, es un método
inexacto, puesto que es subjetivo y depende mucho de la experiencia del
observador.

BIBLIOGRAFIA
-Dialnet-Influencia de la Criopreservacion Sobre la motilidad Viabilidad y Fertilidad de
espermatozoides de llama (Lama glama)
http://www.urp.edu.pe/urp/modules/centros/centroinvestigacion/ciencias/hugogonzales.
pdf
-http://www.scielo.org.pe/scielo.php?pid=S1609-
91172010000200001&script=sci_arttext
-http://www.bioline.org.br/request?la07052
-http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n040408/040806.pdf