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En general los métodos luminiscentes se aplican menos que los métodos de absorción
en los analitos cuantitativos debido a que el número de especies que absorben
radiación ultravioleta / visible es mucho mayor que el de especies que presentan
fotoluminiscencia tras la absorción de radiación en esta región del espectro.
Teoría de la Fluorescencia y de la Fosforescencia
Para diferenciar entre los fenómenos de fotoluminiscencia se requiere una revisión del
spín del electrón y de los estados excitados singulete / triplete.
Tanto la estructura molecular como el entorno químico van a influir en que una
sustancia sea o no luminiscente; estos factores también determinan la intensidad de
emisión cuando tiene lugar la fotoluminiscencia.
En este apartado se consideran brevemente los efectos de algunas de estas variables.
Rendimiento cuántico
El rendimiento cuántico, o la eficacia cuántica, de fluorescencia de fosforescencia es
simplemente la relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia
respecto al número total de moléculas excitadas. Para moléculas altamente
fluorescentes como la fluoresceína, la eficacia cuántica, bajo determinadas
condiciones, se aproxima a la unidad. Las especies químicas que no presentan una
fluorescencia apreciable tienen eficacias que se aproximan a cero.
Fluorescencia y estructura
La fluorescencia más intensa y la más útiles la que presentan los compuestos que
contienen grupos funcionales aromáticos con transiciones * de baja energía. Los
compuestos que contienen grupos carbonilo en estructuras alifáticas y alicíclicas o
estructuras con dobles enlaces altamente conjugados también pueden presentar
fluorescencia, pero el número de estos compuestos es pequeño comparado con el
número de sistemas aromáticos.
La mayoría de los hidrocarburos aromáticos no sustituidos son fluorescentes en
disolución, la eficacia cuántica normalmente aumenta con el número de anillos y con
su grado de condensación. Los heterociclos sencillos, como la piridina, el furano, el
tiofeno y el pirrol,
no presentan fluorescencia; por otro lado, las estructuras condensadas con éstas
normalmente sí la presentan. En los heterociclos con nitrógeno, se cree que la
transición electrónica de más baja energía implica a un sistema n * que
rápidamente se transforma en un estado triplete e impide la fluorescencia.
Sin embargo, la condensación de anillos bencénicos para dar núcleos heterocíclicos,
da lugar a un aumento en la absortividad molar del pico de absorción. En estas
estructuras, el tiempo de vida del estado excitado es más corto, así, se observa
fluorescencia en compuestos como la quinolina, la isoquinolina y el indo!.
Efectos de la temperatura y del disolvente
La eficacia cuántica de fluorescencia disminuye en la mayoría de las moléculas al
aumentar la temperatura, ya que al aumentar la frecuencia de las colisiones cuando la
temperatura es elevada aumenta la probabilidad de desactivación por conversión
externa. Una disminución en la viscosidad del disolvente también aumenta la
probabilidad de la conversión externa y conduce al mismo resultado.
La fluorescencia de una molécula se reduce en presencia de disolventes que
contienen átomos pesados o de solutos con dichos átomos en su estructura; como por
ejemplo, el tetrabromuro de carbono y el yoduro de etilo. El efecto es similar al
observado cuando se introducen, por sustitución, átomos pesados en compuestos
fluorescentes; las interacciones espín-orbital desembocan en un aumento en la
velocidad de formación del triplete y en la correspondiente disminución de la
fluorescencia.
Cuando se desea exaltar la fosforescencia se incorporan con frecuencia a los
disolventes compuestos que contienen átomos pesados
Filtro o
Atenuador Monocromador
del haz de emisión
Fotomultiplicador Fotomultiplicador
de referencia de la muestra
Amplificador
diferencial
Dispositivo de lectura
Láseres.
Desde los comienzos de los años setenta, se utilizan también diversos tipos de láseres
como fuentes de excitación para medidas de fotoluminiscencia.
Un particular interés tienen los láseres sintonizables de colorante que utilizan, como
sistema de bombeo, un láser de nitrógeno pulsante o un láser de Nd:YAG.
La mayoría de los espectrofluorímetros comerciales utilizan lámparas (ya descritas)
como fuentes, por ser menos caras y menos complicadas de uso. Sin embargo, las
fuentes de láser ofrecen importantes ventajas en determinados casos: por ejemplo, (1)
cuando las muestras son muy pequeñas como en cromatografía con microcolumnas y
en electroforesis capilar donde la cantidad de muestra es de un microlitro o menor; (2)
en los sensores de control remoto, como en la detección fluorimétrica de radicales
hidroxilo en la atmósfera de clorofila en seres vivos acuáticos, donde la naturaleza
colimada de los haces de láseres vital: o (3) cuando se requiere una radiación de
excitación altamente monocromática para minimizar los efecto de las interferencias
fluorescentes.
Filtros y monocromadores
Tanto los filtros de interferencia como los de absorción se han utilizado en los
fluorómetros para la selección de la longitud de onda del haz de excitación y de la
radiación fluorescente resultante, mayoría de los espectrofluorímetros están equipados
con al menos uno y a veces dos monocromadores de red.
Detectores
La señal de fluorescencia típica es de baja intensidad, por ello, para su medida se
necesitan ganancias de amplificador elevadas. Los tubos fotomultiplicadores son los
detectores más utilizados en instrumentos de fluorescencia sensibles. Suelen trabajar
en la modalidad de recuento de fotones para mejorar la relación señal/ruido. También
se utiliza, a veces, la refrigeración de los detectores para mejorar la relación
señal/ruido. También se han propuesto, para los espectrofluorímetros, los detectores
de diodos en serie y de transferencia de carga. Este tipo de detectores permite el
registro rápido de los espectros de excitación y de emisión y particularmente son útiles
en cromatografía y en electroforesis
Diseños de instrumentos
Fluorómetros
Los métodos inorgánicos fluorimétricos son de dos tipos. Los métodos directos que
conllevan la formación de un quelato fluorescente y la medida de su emisión. Un
segundo grupo, que se basa en el descenso de la fluorescencia que resulta de la
acción amortiguadora de la sustancia que va a ser determinada.
La última técnica se ha utilizado más en la determinación de aniones.
Reactivos fluorimétricos
Los reactivos fluorimétricos de más éxito en el análisis de cationes son los que
presentan estructuras aromáticas con dos o más grupos funcionales dadores que
permitan la formación de quelatos con el ion metálico. A continuación se muestran
Determinación fluorimétrica de especies orgánicas
El número de aplicaciones del análisis fluorimétrico a especies orgánicas y
bioquímicas es impresionante.
Por ejemplo, Weissler y White han recopilado los métodos para la determinación de
más de 200 sustancias, incluyendo una amplia variedad de compuestos orgánicos,
enzimas y coenzimas, agentes medicinales, productos naturales, esteroides y
vitaminas. Es incuestionable que las aplicaciones más importantes de la fluorimetría se
encuentran en el campo del análisis de productos alimentarios, farmacéuticos,
muestras clínicas y productos naturales. La sensibilidad y la selectividad del método
hacen que sea una herramienta particularmente valiosa en estos campos.
Métodos fosforimétricos
Los métodos fosforescentes y fluorescentes tienden a ser complementarios, ya que los
compuestos fuertemente fluorescentes presentan una débil fosforescencia y viceversa.
Por ejemplo, entre los hidrocarburos aromáticos con anillos condensados, aquellos
que contienen átomos pesados como halógeno s o azufre, con frecuencia presentan
una fuerte fosforescencia; por otro lado, los mismos compuestos sin la presencia del
átomo pesado tienden a presentar fluorescencia en lugar de fosforescencia.
La fosforimetría se ha utilizado para determinar una gran variedad de especies
orgánicas y bioquímicas que incluyen sustancias como ácidos nucleicos, aminoácidos,
pirina y pirimidina, enzimas, hidrocarburos del petróleo y pesticidas. Sin embargo, el
método no ha alcanzado el uso tan difundido de la fluorimetría, quizás debido a la
necesidad de bajas temperaturas y a la, generalmente, peor precisión de las medidas
fosforescentes. Por otro lado, es atractiva la mayor selectividad potencial de los
procedimientos de fosforescencia. La razón de estas diferencias de comportamiento
se debe a que la fosforescencia eficaz necesita el cruce entre sistemas rápido para
poblar el estado triplete excitado, que, vuelve a reducir la concentración de moléculas
en el singulete excitado y, por tanto, aumenta la intensidad de fosforescencia.
BIBLIOGRAFÍA
- Principio de Análisis Instrumental. SKOOG, HOLLER y NIEMAN
Quinta Edición. Mc Graw Hill.
- Análisis Instrumental. KENNETH A. RUBINSON y JUDITH F. RUBINSON
Prentice Hall. Madrid 2001.