GUÌA DE PRÁCTICAS

Unidad académica:

EAP DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ASIGNATURA: BIOQUÍMICA

Mg. Q.F. Carmen Peña Suasnabar

Mg. Q.F. Elizabeth Liz Chavéz Hidalgo
QF. Enrique León Mejia (J.P)
QF. Robert Armando Cárdenas Orihuela (J.P)

2017
 INTRODUCCION

La bioquímica es una ciencia básica, cuya actividad primordial està dirigida a

demostrar las reacciones básicas que determinan la estructura y el funcionamiento
de los seres vivos.

La enseñanza de la Bioquímica en las distintas áreas de Ciencias de la Salud requiere de

una metodología específica y profunda, para la Carrera de Farmacia y Bioquímica
se ha preparado la presente guía que permitirá a nuestros estudiantes contar con un
instrumento práctico y didáctico para fortalecer el proceso enseñanza-aprendizaje.

La presente guía otorga metodologías sencillas y claras para la

obtenciòn, determinación, identificación u observación de metabolitos o
sustancias relacionadas con los procesos bioquímicos de los seres vivos;
asimismo, plantea los ejercicios que debe realizar cada estudiante para un mejor
resultado académico.
 PRÀCTICA 01

CAPACIDAD AMORTIGUADORA DE UN FLUIDO BIOLÒGICO

I. Fundamento teórico

La titulación es una técnica que permite determinar la concentración de una solución cuya
concentración es desconocida utilizando como patrón otra solución pero con
concentración conocida denominada (solución valorada).
La titulación de una sustancia ácida o básica se fundamenta en la reacción de neutralización
de dos especies contrarias, así tenemos que si no conocemos la concentración de la
solución ácida, la solución básica debe estar valorada y debe conocerse en ambas
soluciones los volúmenes utilizados.

HCl + NaOH NaCl + H2O

Los buffer son una mezcla de dos especies químicas relacionadas (ácido o base débil y su
respectiva sal conjugada) ambas tienen una capacidad para captar y liberar H+.
Los Buffer están presentes en casi todos los fluidos biológicos ejerciendo un equilibrio en la
concentración de H+.

Dentro de los buffer más conocidos que se encuentra presente en los sistemas biológicos
tenemos:
Buffer bicarbonato HCO3-1 y H2CO3
Buffer Fosfato HPO4-2 y H2PO4-1

Las proteínas y los aminoácidos también ejercen capacidad buffer, debido a los grupos
funcionales que presentan, a pesar que literalmente no son buffer sin embargo por la función
son considerados como buffer biológicos.

II COMPETENCIA

Determina la concentración de una muestra desconocida mediante la titulación Determina la

capacidad buffer.

III. Materiales y equipos:

3.1 Reactivos.
a. HCl 0,1N
b. NaOH 0,01N
c. Fenolftaleína
d. Agua destilada
 3.2 Equipos y materiales
a. Cinta para medir pH
b. Matraz 100 mL
c. Bureta 25 mL
d. Soporte universal
e. Pipetas 5 y 10 mL
f. Potenciómetro
g. Beaker de 50 mL
h. Pinzas de nueces
i. Baguetas

IV. Procedimiento:

a) Titulación de una solución ácida desconocida:

1. En un Matraz agregar 1 mL de la muestra desconocida del ácido y 9 mL de agua
destilada, homogenizar.

2. Luego agregue II gotas de fenolftaleína.

3. Iniciar la titulación con NaOH 0.01 N, agregando gota a gota utilizando la
bureta.

4. Observar con que volumen de NaOH cambia de color (debe de quedar de un color
rosado pálido) anotar el gasto del NaOH.

5. Determinar la concentración [H+], mediante la siguiente formula. [MP]

x VMP = [bs] x Vbs

b) Capacidad buffer de la orina:

1. Colocar 2 mL de orina en un beaker, luego agregue 5 mL de agua.

2. Agregue II gotas del indicador de fenolftaleína
3. Titule con la bureta que contiene el NaOH 0.01 N.
4. Anotar el gasto del NaOH
5. Determinar la concentración de H+ en cada muestra, con la formula anterior.
6. Determinar la capacidad amortiguadora de la orina, mediante la siguiente
formula:

β = # n (base adicionado) Vol

buffer (L) x Δ pH
V. Cuestionario:
1. Si el pH de la sangre es de 7,42 ¿Determinar la concentración de
hidrogeniones libres?
2. A una solución de 80 mL de ácido carbónico 0,05 mol/L se le adiciona 20 mL de
NaOH 0,01 mol/L.

a) Represente la reacción en ecuación química

b) Después de la mezcla cual es la concentración del ácido y sal en la
solución
c) Determine el pH de la solución
d) Si a la solución final se le agrega 20 mL de agua destilada, cual será su pH.
Explique si existe variación o no.

VI. Fuentes de Información.

a. Devlin Thomás M. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas. Tomo
I y II. Barcelona. Edit. Reverté Colombiana. S. 2000.
b. Luque L, Hermoza A. Biología Molécular e Ingenieria Genética.
Barcelona.Edit. Hartcourt. 2001.

c. Martin D W. Bioquímica de Harper. México .Edit Manual Moderno. 2000.

d. Rawn M. Bioquímica. Madrid McGraw- Hill .Interamericana. 2003.

 PRÀCTICA 2

EXTRACCIÓN DE CASEINA Y DETERMINACIÓN DE SU PUNTO ISOELÈCTRICO

I. Fundamento teórico

La leche contiene tiamina, riboflavina, ácido pantoténico y Vitaminas A, D y K,

minerales (Ca, K, Na, P), proteínas, carbohidratos (lactosa) y lípidos.
Las proteínas se pueden clasificar de manera general en proteínas globulares y
fibrosas. Las proteínas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas
esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes
de hidrógeno (característicos de las proteínas fibrosas) siendo solubilizadas en
suspensiones coloidales.
En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lacto albúminas y lacto globulinas
(todas globulares).
La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se
separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas
son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que
contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están
unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en
la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico).
La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la
leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente
y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la
superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la proteína
neutra precipita
Ca2+ Caseinato + 2HCl  Caseína + CaCl2

Todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que
se encuentren y de los aminoácidos que la componen.
Debido a la composición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden
existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y
aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo
suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártico
y glutámico estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina
estarían protonados (-NH3 +).
De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría
cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían
desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2). Las
proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero. A este pH se le
denomina punto isoeléctrico (pI).
En el punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y
negativas por lo que la proteína presenta su máxima posibilidad para ser
precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.
 II. COMPETENCIA

Obtiene Caseina a partir de leche y determina su punto isoeléctrico.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

- Beaker de 25, 50 y 250 mL

- Probeta de 50 mL
- Matraz aforado de 50 mL
- Pipetas de 0,5; 1,0 y 10 mL
- Embudo de vidrio mediano
- Papel de filtro
- Termómetro
- Tubos

- Reactivos por grupo:

o Agua destilada
o Acetato sódico 0,1 N
o Ácido acético 0,01 N
o Ácido acético 0,1 N
o Ácido acético 1,0 N
o NaOH 1N
o Éter etílico
o Etanol al 70%

- Materiales y reactivos de uso general:

o Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potenciómetro

o Potenciómetro (pH-metro)
o Leche entera corriente ( 1 litro)

DESARROLLO EXPERIMENTAL

A. Aislamiento de la caseína:

a. Caliente, en un vaso de precipitados, 150 mL de agua destilada a 38 ºC,

añada 50 mL de leche y luego gota a gota y con agitación, adicione ácido
acético 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se
corta)
b. Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal.
c. Lave el precipitado con 20 mL de etanol en el mismo filtro.
d. Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
 e. Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeño previamente
pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5 mL/g
de éter etílico.
a. Filtre nuevamente.
b. Deseche el líquido, quedará un precipitado blanco de fácil manipulación
que es la caseína.

B. Preparación de la solución de caseína:

a. Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un vaso de 50 mL.

b. Agregue 20 mL de agua destilada y 5 mL de NaOH 1N; agite hasta lograr
una solución total de la caseína.
c. Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz aforado de 50 mL,
adicione 5 mL de ácido acético 1N y diluya con agua destilada hasta 50 mL
y mezcle bien.
d. La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe volver a filtrar.

C. Determinación del pI de la caseína:

En diez tubos de 25 mL limpios y secos adicione exactamente los volúmenes de los

reactivos según la siguiente tabla:

TABLA DE DISOLUCIONES

TUBO Acetato Ac. Acético Ac. Acético pH

0.1N 0.1 N 0.01 N resultante(aprox.)
1 0.5 9.5 - 3.2
2 1 9 - 3.6
3 1.5 8.5 - 3.8
4 2 8 - 4.0
5 3 7 - 4.2
6 4 6 - 4.5
7 6 4 - 4.7
8 8 2 - 5.1
9 6 - 4 5.5
10 8 - 2 6.1

 Medir experimentalmente el pH en todos los tubos, que debe cubrir un

rango aproximado semejante al teórico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la
Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso creciente.

 Añadir 1 mL de disolución de caseína a cada tubo.

 Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.

  Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetría
de 1 cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien el contenido de
cada tubo para obtener una solución / suspensión homogénea antes de verter
una parte en la cubeta.

 Anotar resultados, representar la absorbancia frente al pH, y determinar el pI

aproximado de la caseína.

IV. Cuestionario
1) ¿Cuál es el punto isoeléctrico de la caseína?
2) Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pI?

V. Fuentes de información:

a. Devlin Thomás M. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas. Tomo I y II.

Barcelona. Edit. Reverté Colombiana. S. 2000.
b. Luque L, Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería Genética.
Barcelona. Edit. Hartcourt. 2001.

c. Martin D W. Bioquímica de Harper. México .Editorial Manual Moderno.

2000.

d. Rawn M. Bioquímica. Madrid Mc Graw - Hill. Interamericana. 2003.

 PRÀCTICA 3

I. MARCO TEÓRICO

El almidón constituye un importante componente de la dieta de los seres humanos. El proceso de

digestión de este nutriente se inicia en la cavidad oral, lugar en que actúa la alfa-amilasa salivar,
enzima que tiene la propiedad de hidrolizar los enlaces alfa 1,4 del almidón y formar
polisacáridos de menor peso molecular.

II. COMPETENCIA:
Realiza in vitro la hidrólisis del almidón por acción de la amilasa salival

III.MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES
- Beaker de 25, 50 y 250 mL
- Probeta de 50 mL
- Matraz aforado de 50 mL
- Pipetas de 0,5; 1,0 y 10 mL
- Embudo de vidrio mediano
- Papel de filtro
- Tubos

Reactivos
- Agua destilada
- Buffer fosfatos 0,1 M pH 6,5
- Soluciìòn de almidos al 1 %
- Àcido Clorhidrico 0,5 N
- Soluciòn de Saliva al 10 %

IV. TÈCNICA OPERATORIA

Para realizar el experimento se prepararán los siguientes medios de reacción:

1 2 3

mL. tampón fosfato 0.1 M pH 6.5 1.0 1.0 1.0

mL. de almidón al 1 % 2.0 2.0 2.0
mL. ácido clorhídrico 0.5 N --- --- 1.5
mL. de agua destilada 2.0 1.5 ---

Colocar los tubos de ensayo en el baño maría a 37 °C durante 2 min, luego adicionar:

mL. solución de saliva --- 0.5 0.5

Colocar nuevamente los tubos en baño maría y sacar alícuotas de 0.5 mL. de cada uno de los
tubos a los 0, 5, 10, 15 y 20 minutos, y adicionarlos a tubos previamente preparados que
contienen 2.0 mL de ácido clorhídrico 0.05 N, de acuerdo al siguiente esquema:

Tubo N° 1 2 3
mL de ácido clorhídrico 0.05 N 2.0 2.0 2.0

Luego adicionar a cada tubo:

Gotas de solución de Lugol I gota I gota 1 gota

Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado.

Durante el desarrollo del experimento se observarán modificaciones del color inicial de los tubos
como consecuencia de la acción de la alfa-amilasa salivar.
El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un color pardo claro.

V. CUESTIONARIO

a. Elabore un mapa conceptual acerca de los factores que afectan la

actividad enzimática
b. Explique las aplicaciones clínicas de la ecuación de Linewaber y Burk.

VI. FUENTES DE INFORMACIÒN

a. Devlin Thomas M. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas. Tomos I y II.

Barcelona. Reverté Colombiana. S. 2000.

b. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud. España. McGraw

Hill- Interamericana. 2001.

c. David L N, Cox M M. y Lehninger A. Principios de Bioquímica.

Barcelona. Omega. 2001.

d. Luque L y Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería Genética.

Barcelona. Hartcourt. 2001.
 PRÀCTICA 4

EXTRACCIÓN DE OLIGOFRUCTANOS E IDENTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS

I. FUNDAMENTO TEÒRICO:

Los carbohidratos son biomoléculas que presentan grupo funcional carbonilo

(aldehído y cetona) y varios grupos hidroxilos en cada carbono.
Los carbohidratos tienen la propiedad química oxidarse por el carbono anomérico,
(grupo carbonilo) dando origen a un ácido orgánico, y produciendo la reducción de
otros compuesto, es por ello que los carbohidratos principalmente los monosacáridos
y algunos disacáridos expresan esta propiedad, sin embargo e n los polisacáridos
dicha propiedad está ausente.
Los carbohidratos pueden formar polímeros mediante la unión entre ellos (enlaces o-
glucosídicos) dando origen a monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos y
polisacáridos.

Los fructanos son los polisacáridos no estructurales más abundantes en la naturaleza,

presentes en muchas especies de plantas, en hongos del tipo Aspergillus sp. y en
bacterias. De este grupo los más ampliamente estudiados y de mayor uso a nivel
industrial son la inulina y los fructooligosacáridos o FOS, que se caracterizan por sus
enlaces de tipo β-(2-1) entre las unidades de fructosa, con un grado de polimerización
que varía entre 2 y 60 unidades, y se les considera carbohidratos de cadena corta o de
bajo nivel de polimerización.

II. COMPETENCIAS:
Extrae oligofructanos del jugo del yacon e identifica los carbohidratos con los diferentes
reactivos.
Explica el fundamento de reconocimiento de los reactivos.

III. MATERIALES Y REACTIVOS:

 Reactivo de Lugol
 Reactivo de Benedict
 Reactivo de Molish
 Reactivo de Selivanoff
 Ácido clorhídrico 0,5 N
 Alcohol etílico
 Acido sulfúrico
 Solución A (Galactosa)
  Solución B (Sacarosa)
 Solución C (Maltosa)
 Solución D (Almidón)
 Pipetas de 1, 5 y 10 mL
 Beaker 250 mL
 Rejilla
 Trípode
 Mechero
 Baño maría
 Tubos de prueba 13 x 100mm

IV. MÈTODO OPERATORIO:

a. El extracto de yacón se obtiene triturando muestra fresca, se diluye con agua y

se agita por 15 min a 80 ºC. Se enfria y se afora a 100 mL con agua destilada. Se
filtra (muestra).
b. Reacción con el reactivo de Lugol: esta prueba es utilizada para identificar
polisacáridos:
A B C D E
mL Solución A 0,5 -- -- -- --
mL Solución B -- 0,5 -- -- --
mL Solución C -- -- 0,5 -- --
mL Solución D -- -- -- 0,5 --
mL Muestra -- -- -- -- 0,5
mL HCl 0,5 N 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
mL Rvo. de Lugol 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Llevar a baño María a 100 ºC por 3 a 5 minutos. Evaluar el color y el precipitado.

Indique según resultados, que carbohidratos corresponde a cada solución.

c. Reacción de Molish.
Colocar 2 mL de cada solución y la muestra problema. Luego adicionar
II gotas de reactivo de Molish, mezclar. Lentamente deslizar por las
paredes del tubo, 1 mL. de ácido sulfúrico concentrado, (reacción
exotérmica). La formación de un anillo de color violeta o púrpura indica
presencia de glúcidos.

d. Reacción de Benedict.
Colocar 2.5 mL de Reactivo de Benedict en 5 tubos, calentar hasta
ebullición por 2 minutos. Si no hay cambio de color se adicionan V
gotas de c a d a s o l u c i ó n y d e Muestra problema, luego se colocan
en B.M. hirviente durante 3 minutos, luego se deja enfriar. La aparición
de una coloración o, precipitado, amarillo anaranjado o rojo, indica
presencia de glúcidos reductores.
 e. Reacción de Selivanoff. En un tubo de prueba se coloca 3 mL de
solución clorhídrica de resorcinol y 6 mL de cada solución y de la
Muestra problema. Luego se coloca en Baño de María hirviente por
unos minutos. El desarrollo inmediato de una coloración anaranjado
rojizo indica presencia de cetosas.

V. CUESTIONARIO:

1. Explique el fundamento del reconocimiento de Benedict.

2. Indique dos métodos químicos para reconocer azucares reductores

VI. FUENTES DE INFORMACIÒN.

a. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud. España. Edit.

Mc Graw- Hill- Interamericana de. 2001.
b. Luque L y Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería
Genética. Barcelona. Edit. Hartcourt. 2001.
c. Matheus Van Holde. Bioquímica. México. Edit. Mc Graw Hill. 2000.
d. Martin, D.W. Bioquímica de Harper. México. Edit. Manual Moderno.
2000.
d. Lehninger, A.. Bioquímica. Barcelona .Edit. Omega. 2001.
e. Claros MG, Avila C. Gallardo F. Madrid .Edit. ISBN. 2001
 PRÀCTICA 5

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN SUERO SANGUINEO

I. MARCO TEÒRICO.

La glucosa es una sustancia cuyos niveles en la sangre pueden constituir un indicio, que podría
permitir diagnosticar diversas patologías: diabetes mellitus, mixedema, hipopituitarismo, etc.

II. COMPETENCIA
Determina la concentraciòn de glucosa en sangre utilizando el método enzimático de Trinder.

III MATERIALES Y EQUIPOS.

a. Espectrofotómetro.
b. Centrifuga.
c. Baño María 37 ºC.
a. Gradilla.
b. Pipeta de 1, 5 y 10 mL.
c. Micropipeta de 10 a 50 uL
d. Micropipeta de 100 a 1000 uL
e. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
f. Ligaduras
g. Agujas 20 x 1”
h. Tips azules y amarillos

Reactivos.

a. Solución estándar de Glucosa 100 mg/dL.

b. Reactivo Enzimático
c. Alcohol etílico absoluto
d. Indicador rojo de fenol.
e. Agua destilada.
f. Algodón

IV. FUNDAMENTO DEL MÈTODO:

La determinación enzimática de glucosa sanguínea se realiza utilizando 2 enzimas: glucosa

oxidasa y peroxidasa, cuyas acciones catalíticas en presencia de apropiados reactivos químicos,
permitirán la formación de un compuesto coloreado que es directamente proporcional a la
glucosa existente en el medio de reacción.

Glucosa oxidasa
Glucosa + H2O + 02 Acido glucónico + H2O2

Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O
V. PROCEDIMIENTO.

Preparar los siguientes medios de ensayo:

B X St

Suero o plasma ---- 10 L ----

Standard ---- ---- 10 L
Reactivo de trabajo (mL) 1.0 1.0 1.0

Incubar en baño maría a 37º C durante 10 minutos y leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

VII. RESULTADOS.
Determinar la concentración mg/dL utilizando el método del factor de calibración

VII. Cuestionario
1. Cuáles son los valores normales de glicemia?
2. En qué condiciones debe tomarse la muestra?
3. Como procedería si el resultado es 220 mg/dL?

VIII. FUENTES DE INFORMACIÒN

a. Lehninger, A. Bioquímica. Barcelona . Omega. 2002.

b. Devlin TM. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Barcelona. Reverté Colombiana S.A.
2000.
c. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud. España McGraw -
Hill- Interamericana. 2001.
d. Luque L. y Hermoza A. BiologíaMolecular e Ingeniería
Genética. Barcelona. Hartcourt. 2001.
e. Martin DW. Bioquímica de Harper. México.Manual Moderno.2000.
 PRÀCTICA 6

AISLAMIENTO DE GLUCÓGENO DEL HÍGADO DE POLLO

I. MARCO TEÒRICO.

El glucógeno como sustancia de reserva, se encuentra en muchos

tejidos animales, especialmente en el hígado y músculos. El hígado de
gran número de especies animales tiene la capacidad de almacenar la
glucosa bajo la forma de glucógeno.

El glucógeno puede ser extraído por varios métodos, uno de los

cuales es la hidrólisis alcalina del tejido, la que degrada a las
proteínas y otros constituyentes de la célula dejando l i b r e al
glucógeno, posteriormente puede ser precipitado por su baja
solubilidad en alcohol.

Si una persona es sometida a un período de ayuno durante 24 horas,

el glucógeno hepático disminuye ya que tiene que cubrir las
necesidades de glucosa.

Las vías de síntesis y degradación de este polisacárido,

denominadas glucogénesis y glucogenólisis respectivamente, están
integradas en el conjunto de reacciones de la red metabólica
celular a través de un metabolito común la glucosa-6-fosfato.

II. COMPETENCIA

Aisla glucógeno del hígado de pollo y determina el porcentaje de

este carbohidrato contenido en el hígado.

III. MATERIALES Y EQUIPOS.

3.2. Equipos y materiales.

a. Espectrofotómetro.
b. Centrifuga.
c. Baño María 37 ºC.
d. Cocina eléctrica.
e. Mortero y pilón.
f. Balanza.
i. Gradilla.
j. Pipeta de 1, 5 y 10 mL.
k. Micropipeta de 10 a 50 uL
l. Tubos de prueba de 13 x 100mm y de 16 x 150 mm.
 m. Micropipetas de 100 a 1000 uL con punteras.
n. Embudo mediano; baguetas y punteras amarillas.
o. Pinzas de madera y bolas de vidrio de 100 mm de diámetro

3.2. Reactivos.

g. Solución saturada de sulfato de sodio.

h. KOH al 30% ;
i. NaOH O.5M.
j. HCl 1.2 M
k. Alcohol etílico absoluto
l. Indicador rojo de fenol.
m. Agua destilada.

IV. PROCEDIMIENTO.

A. Aislamiento de glucógeno

a. En un tubo de prueba de 16 x 150 mm, depositar 1 g. de

hígado (triturado), adicionar 4 mL de KOH al 30 %, luego
colocar el tubo en Baño María hirviente durante 20 minutos,
agitando de vez en cuando.
b. Retirar el tubo y colocarlo en un recipiente con agua
helada.
a. Adicionar 0.4 mL de solución saturada de sulfato de
sodio y mezclar enérgicamente
b. Adicionar 8 mL de alcohol absoluto (para pp el
glucógeno), dejar en el baño de hielo durante 5 minutos.
c. Centrifugar por 5 minutos a 3,000 g.
d. Elimine el sobrenadante y disuelva el glucógeno pp en 5 mL de
agua destilada, (caliente suavemente para disolver).

B. Hidrólisis y determinación del glucógeno.

a. En una gradilla disponga dos tubos de prueba, y adicione a cada

tubo 2mL de la solución anterior.
b. Adicionar a cada tubo 2 Ml de HCL 1.2 M., tape la boca de los
tubos con una bolita de vidrio, y luego coloque los tubos a B.M.
por 2 hrs.
c. Agregue a cada tubo I gota de rojo de fenol y neutralice con NaOH
0.5 M hasta que el indicador vire de rosa a anaranjado y luego a
amarillo.
 d. Deje enfriar y luego complete a 5 mL con agua destilada.
e. Determine luego glucosa por el método de la glucosa oxidasa.

V. RESULTADOS

El glucógeno se expresa en mg/dL de glucosa.

VI. CUESTIONARIO.

a. Grafique la cascada glucogenolítica

b. Fundamente la causa por la que la glucosa no se almacena en el
organismo como glucosa, sino bajo la forma de glucógeno.
c. Describa como actúan las enzimas que intervienen en la
glucogenolisis.
d. ¿Cómo se realiza la regulación de la glucogenogenésis?

VII. FUENTES DE INFORMACIÒN

a. Lehninger, A. Bioquímica. Barcelona . Omega. 2002.

b. Devlin TM. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Barcelona.
Reverté Colombiana S.A. 2000.
c. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud.
España McGraw - Hill- Interamericana. 2001.
d. Luque L. y Hermoza A. Biología Molecular e
Ingeniería Genética. Barcelona. Hartcourt. 2001.
e. Martin DW. Bioquímica de Harper. México. Manual
Moderno.2000.
 PRÀCTICA 7

DETERMINACIÒN DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA EN DIVERSOS TEJIDOS

DE ORIGEN ANIMAL Y VEGETAL

I. MARCO TEÒRICO

La enzima catalasa, controla la formación del peróxido de hidrógeno al término de la

cadena de transporte de electrones, desdoblándolo en agua y media molécula de
oxígeno, juega un rol importante en el equipo de antioxidantes de tipo enzimático.

II. COMPETENCIA
Evidencia la presencia de Catalasa en diversos tipos de tejidos mediante el
Dedoblamiento del peróxido de oxigeno

III. MATERIALES

a. Tabla y cuchillo para picar

b. Balanza.
c. Espátula
d. Mortero con pilón
c. Tubos de prueba de 13 x 100mm y de 16 x 150 mm
d. Pipetas de 1, 5 y 10 mL
e. Baguetas
f. Centrifuga.
f. Embudo de vidrio
g. Papel de filtro

Reactivos.
a. Solución de peróxido de hidrógeno 30 mM
b. Solución salina fisiológica (Cloruro de Sodio 0.9 %)

IV. PROCEDIMIENTO

1. Se limpiarán apropiadamente, m u e s t r a s d e t e j i d o v e g e t a l
(papa, rabanito) y animal (hígado, corazón, musculo), se
pesará 1 g de cada muestra, se triturará y homogeneizará
al 10 % con solución salina fisiológica.
2. Colocar en tuboss de ensayo 3 mL de solución de
peróxido de hidrógeno 30 mM y añadir 0.5 mL del
filtrado.
3. Observar el desprendimiento de óxigeno
Repetir el ensayo con cada muestra y comparar los
resultados
 V. RESULTADOS
Formular las conclusiones de acuerdo a lo observado en el procedimiento
operatorio

VI. CUESTIONARIO.

a. Elabore la gráfica de la cadena respiratoria poniendo énfasis en la

participación de la catalasa
b. Elabore un mapa conceptual de la actividad biológica de la
enzima.

VII. FUENTES DE INFORMACIÒN.

a. David LN, Cox M.M. y Lehninger A. Principios de Bioquímica.

Barcelona. Omega 2001.
b. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud .España.
McGraw-Hill Interamericana. 2001.

c. Luque L, Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería Genética. Barcelona.

Hartcourt 2001.
d. Martin DW. Bioquímica de Harper. México. Manual Moderno. 2000.
 PRÀCTICA 8

SAPONIFICACIÓN

I. MARCO TEÒRICO

Los aceites vegetales, como el aceite de coco o de olivo, y las grasas animales, como el
sebo, son ésteres de glicerina con ácidos grasos. Por eso cuando son tratados con una
base fuerte como sosa o potasa se saponifican, es decir producen la sal del ácido graso
conocida como jabón y liberan glicerina. En el caso de que la saponificación se efectúe
con sosa, se obtendrán los jabones de sodio, que son sólidos y ampliamente usados en
el hogar. En caso de hacerlo con potasa, se obtendrán jabones de potasio, que tienen
consistencia líquida.

II. OBJETIVO:

Poner de manifiesto ciertas propiedades de los lípidos, algunas de las cuales pueden
servirnos para su identificación.

III.MATERIALES

Materiales
 Beaker 500ml 100ml,
 Baño maría
 Papel filtro
 Pipetas de 10ml
 Cápsula de porcelana.

Reactivos

 Aceite de palma o aceite de coco

 KOH (1g/ml agua),
  HCl al 10%
 CaCl2 al 10%
 NaCl (sal de cocina).

IV.TECNICA OPERATORIA

Reacción de saponificación
En un vaso de precipitado de 1000ml calienta en un baño maría 15 g de aceite de
palma o aceite de coco. Agitando constantemente agrega 13 ml de KOH (1g/ml
agua). Terminada la adición, continúa calentado en baño maría y agita durante 50
min. Adicionar cloruro de sodio para separar el jabón.

V. CUESTIONARIO

1) Si se agita frecuentemente la mezcla de reacción, ¿Se acelera la velocidad de

saponificación? ¿Porqué?

2) ¿Qué son las micelas?

3) Una molécula de jabón, ¿Es o no soluble en agua? Explica tu respuesta.

4) Explica físicamente cómo un jabón es capaz de quitar una mancha de

aceite de una tela.

5) ¿Qué diferencia estructural hay entre un jabón y un detergente?

VI. FUENTES DE INFORMACIÒN

a. Lozano - Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud. España .
Edit. Mc Graw- Hill- Interamericana de. 2001.

b. Luque L y Hermoza A. Biología Molécular e Ingenieria

Genética. Barcelona.Edit. Hartcourt. 2001.

f. Matheus Van Holde. Bioquímica. México. Edit. Mc Graw Hill.2000.

g. Martin, D.W. Bioquímica de Harper. México. Edit. Manual Moderno.

2000.

h. Lehninger, A.. Bioquímica. Barcelona .Edit. Omega. 2001.

i. Claros MG, Avila C. Gallardo F. Madrid .Edit. ISBN. 2001

 PRÀCTICA 9

DETERMINACIÒN DE COLESTEROL EN SUERO SANGUINEO

I. MARCO TEÒRICO.

El colesterol es el esteroide más abundante en el organismo humano.

Es un componente habitual de la dieta ( carne, leche, huevos) , pero
fundamentalmente el, organismo lo sintetiza en el higado. Es importante
mencionar que una de sus principales funciones biológicas es la de
regular la fluidez de las membranas celulares y la de constituirse como
uno de los precursores de hormonas esteroideas, gestágenos y
corticoides, andrógenos, estrógenos , vitaminas y otros compuestos
biológicos

Se desplaza por la sangre en partículas denominadas lipoproteínas, que

contienen tanto lípidos como proteínas. El organismo cuenta con tres
tipos de lipoproteinas:

Lipoproteinas de baja densidad (LDL): Contienen cerca del 70 por ciento

del colesterol del suero y favorecen los trastornos cardiovasculares

Lipoproteinas de baja densidad (HDL): Acumulan el 20 por ciento del

colesterol total y tienen un efecto protector

Lipoproteinas de muy baja intensidad (VLDL): Contienen en torno al 10

por ciento del colesterol total del suero y la mayor parte de los
triglicéridos

La principal consecuencia del exceso de colesterol en sangre es el

desarrollo de enfermedades coronarias (EC). Que son frecuentes en las
poblaciones cuya alimentación es rica en grasas saturadas

La hipercolesterolemia está estrechamente ligada a la arterosclerosis,

una alteración degenerativa que ataca a las arterias en las que se forman
placas de ateroma.
que obstruyen total o parcialmente los vasos de las arterias ocasionando
una falta de riego. Si la falta de riego se localiza en las arterias coronarias
que irrigan el corazón se puede originar una angina de pecho o un infarto
de miocardio. Si se produce en las arterias cerebrales son frecuentes las
hemorragias y trombosis cerebrales. Cuando la obstrucción se localiza en
las extremidades puede favorecer la gangrena de un miembro y, en el
peor de los casos, su amputación.
II. COMPETENCIA

Determina la concentración de colesterol en suero sanguíneo.

Concientiza el riesgo que genera concentraciones elevadas de
colesterol (a t e r o m a ) o bajas (a f e c c i ó n hepática o tiroidea).

III. MATERIALES Y EQUIPOS.

Equipos y materiales.
1. Espectrofotámetro.
2. Centrifuga.
3. Baño María regulado a 37ºC.
4. Jeringas descartables x 5ml. con aguja hipodérmica estéril.
5. Algodón, ligadura.
6. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
7. Pipetas de 10 mL.
8. Micropipetas de 0 a 50 uL.
9. Punteras amarillas, gradillas y baguetas.

Reactivos.
10. Set de reactivos para colesterol ( enzimático ).
11. Muestra biológica.
12. Alcohol medicinal.

IV. TECNICA OPERATORIA.

A.En una gradilla disponer tres tubos de prueba de 13 x 100mm,
rotularlos con P (problema), S (Standard ) y B (blanco) luego
proceder como sigue

REACTIVOS P S B

Suero del paciente 10 ul - -

Standard de colesterol 200mg/dl - 10ul -

Agua destilada - - 10 ul

Reactivo enzimático 1mL 1mL 1mL

B. Reposo x 20 minutos.
C. Leer a 650 nn, llevando el espectrofotómetro a cero en
absorvancia con el blanco de reactivos.
D. Para obtener la concentración de colesterol de la muestra
problema, se aplica la siguiente fórmula.
 mg de colesterol/ dL = absorbancia del problema X 200
absorbancia del standard

V. RESULTADOS.
Concentraciones de colesterol, en mg/dL, obtenidos por los alumnos enen
las muestras analizadas.

VI. CUESTIONARIO.
i. Describa como se realiza la biosíntesis del colesterol.
ii. ¿ Qué ocurre cuando el LDL-colesterol no es fagocitado?
iii. Mencione cuatro métodos para la determinación de
colesterol en sangre, indicando ¿cuál? de ellos es el más
exacto y porque. y
¿Porqué?
iv. Mencione lo requisitos indispensables que debe
observar una persona,para que su determinación de
colesterol sea real.
v. Explicite la biosíntesis de colesterol a partir de la
ingesta de carbohidratos.

VII. FUENTES DE INFORMACIÒN.

i.Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.
ii. Devlin TM.Bioquímica . 4ª ed. Barcelona. Reverte. 2004.
iii. Lehninger .Principios de Bioquímica.4ª ed. Barcelona. Omega . 2006.
iv.Mathews CK, Van Holde KE Bioquímica. 3a ed. Madrid.Addison Wesley.
2002.
 PRÀCTICA 10

HIDRÒLISIS ENZIMÀTICA DE LOS LÌPIDOS

I. MARCO TEÒRICO.
Los lípidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por acción de la lipasa
pancreática. En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares,
compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lípidos para una eficiente acción
de la lipasa pancreática.

II. COMPETENCIA
Demostrar experimentalmente la acción hidrolítica de la lipasa pancreàtica

III. MATERIALES y REACTIVOS.

a. Tubos de ensayo
b. Pipetas de 1, 5 y 10 mL.
c. Gradillas
d. Probeta de 50 mL.
e. Beakeres de 50, 100 y 250mL
f. Frasco gotero.
g. Piceta
h. Mortero con pilòn
i. Bureta de 25 o 50mL
j. Baño Marìa

Reactivos

a. Aceite
b. Sales biliares al 1 %
c. Soluciòn de NaOH 0,05 N
d. Buffer fosfato 0,1 M, pH 7,8
e. Soluciòn de fenolftaleìna
f. Soluciòn de pancreatina al 1 %

IV. TÈCNICA OPERATORIA

Con la finalidad de mostrar experimentalmente la acción hidrolítica de la lipasa

pancreática se prepararán los siguientes medios de reacción:
 B 1 2 3

mL. de tampón fosfato 0.1 M pH 7.8 2.0 2.0 2.0 ---

mL. de aceite 1.0 1.0 1.0 1.0
mL. de sales biliares al 1% 2.0 2.0 --- 2.0
mL de agua 5.0 --- 2.0 2.0

Añadir II gotas de fenolftaleína a cada uno de los tubos, luego adicionar gota a gota una
solución de NaOH 0.05N hasta que aparezca una coloración débilmente grosella estable,
luego adicionar:

mL. de solución de pancreatina al 1% --- 5.0 5.0 5.0

Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora, agitándolos cada 5
minutos.

Al finalizar el tiempo de incubación adicionar nuevamente a cada tubo II gotas de

fenolftaleína y proceder a titular, utilizando una bureta, con una solución de NaOH 0.05
N hasta que aparezca nuevamente la coloración ligeramente grosella.

V. RESULTADOS

Los resultados se expresarán como miliequivalentes de ácido esteárico liberado por acción
de la lipasa pancreática.

VI. CUESTIONARIO
1. Que función cumple la fenolftaleína
2. Como explica los resultados obtenidos?
3. Qué rol tuvieron las sales biliares?
4.

VII. FUENTES DE INFORMACIÒN

a. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.

b. Devlin TM.Bioquímica . 4ª ed. Barcelona. Reverte. 2004.

c. Lehninger .Principios de Bioquímica.4ª ed. Barcelona. Omega .

2006.

d. Mathews CK, Van Holde KE Bioquímica. 3a ed. Madrid.Addison

Wesley. 2002.
 PRÀCTICA 11

REPRESENTACIÒN GRÀFICA DEL MECANISMO DE ACCIÒN DE

LAS HORMONAS A NIVEL DE MEMBRANA y A NIVEL DE

NUCLEO

I. MARCO TEÒRICO.
Las hormonas son sustancias químicas que se caracterizan por ejercer su
actividad en un lugar diferente a donde se producen, se encuentran por lo
general asociadas a una glándula endocrina, esta libera a la hormona al
torrente sanguíneo hasta que recibe la señal fisiológica adecuada. La
hormona viaja por el torrente circulatorio e interactúa con la las célula
diana mediante la unión inicial a un receptor macromolecular, situado en la
membrana plasmática o en el interior de la célula .

Para ejercer su acción, todas las hormonas deben unirse a su receptor

específico, estas uniones inician mecanismos intracelulares que conllevan
las respuestas celulares. De acuerdo a su mecanismo de acción las
hormonas se dividen en dos grupos , unas de las que vamos a tratar en
esta práctica , se unen a los receptores celulares localizados en la
membrana de las células diana. Esta unión dispara uno o más de las vías de
transducción que llevan a las respuestas celulares. La interacción con el
receptor de membrana es rápida y reversible. Debe existir alta afinidad y
especificidad, ya que las hormonas se encuentran en muy baja
concentración a nivel sanguíneo. Con la unión de la hormona al receptor y
activación del segundo mensajero se producen señales intracelulares que
son específicas para cada receptor; son amplificadas y generan una
variedad de efectos secundarios y terciarios que modifican la función
celular.

Los receptores de membrana en general presentan dominios específicos

que: a.). Se unen al ligando; b). Interactúan con sistemas efectores ya sea
en forma indirecta a través de la proteína G o directa por los canales del
calcio; c). Tienen actividad enzimática inherente; d). Determinan la
localización en la membrana e internalización.

Las hormonas esteroideas y tiroideas actúan a nivel de núcleo, utilizando

receptores intracelulares.
Con respecto a las hormonas esteroídeas, estas se producen en células
específicas de los testículos, la corteza adrenal, ovarios y placenta. Los
testículos son los encargados de secretar, principalmente, testosterona
(andrógenos), la corteza adrenal produce la aldosterona, cortisol y la
DHEA (dehidroepiandrosterona), los ovarios producen los estrógenos que
engloban el estradiol, 4-androsteno-3, 17-diona y la progesterona, y por
último esta la placenta que también secreta estradiol y progesterona,
pero además produce otra sustancia, el estriol.

Gracias a su naturaleza lipídica las hormonas esteroídeas atraviesan

facilmente las membranas de las células diana o células blanco, y se unen
a las moléculas receptoras de tipo proteico, que se encuentran en el
citoplasma. De esta manera llegan al núcleo, donde actúan sobre genes
del ADN, se produce la transcripción. Las moléculas de ARNm originadas
se encargan de dirigir en el citoplasma la síntesis de unidades proteicas,
que son las que producirán los efectos fisiológicos hormonales.

Las hormonas tiroideas se liberan cuando el hipotálamo secreta la

hormona liberadora de tirotropina, que estimula la hipófisis anterior para
liberar TSH, que a su vez estimula la glándula tiroides para secretar: L-
tiroxina (T4) y L-triyodotironina (T3) (fig. ). Pequeñas cantidades de T4 y T3
estimulan el metabolismo energético, especialmente en el hígado y en el
músculo. Estas hormonas se unen a un receptor proteico intracelular
específico; el complejo hormona-receptor activa algunos genes que
codifican enzimas que intervienen en la producción de energía,
incrementando su síntesis y, por tanto, incrementando la tasa metabólica
basal del animal.

II. COMPETENCIA.

Representa con gráficos el mecanismo de acción de las

hormonas a nivel de membrana.
 III. MATERIALES

a. Bibliografía del silabo de Bioquímica I

b. Bibliografía de carácter científico (revistas, manuales, etc.)
c. Retroproyector.
d. Videos VHS, etc

e. Libros y revistas

f. C D .Power point.

IV. PROCEDIMIENTO.

Se realizará de acuerdo a la técnica para elaborar representaciones

gráficas del mecanismo de acción de las hormonas a nivel de membrana
biológica y a nivel del nùcleo.

V.RESULTADOS.
Gráficos de los diferentes mecanismos de acción.

VI.CUESTIONARIO.
a. Elabora un gráfico sobre el mecanismo de acción de la adrenalina
b. ¿ Cuáles son las funciones del glucagón y de la adrenalina en el
organismo?
c. Elabore un mapa conceptual de los receptores de membrana.

VII.FUENTES DE INFORMACIÒN.

a. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.

b. Devlin TM.Bioquímica . 4ª ed. Barcelona. Reverte. 2004.

c. Lehninger .Principios de Bioquímica.4ª ed. Barcelona. Omega . 2006.

d. Mathews CK, Van Holde KE Bioquímica. 3a ed. Madrid.Addison Wesley.

2002.
 PRÀCTICA12

DETERMINACIÒN DE UREA POR MÈTODO ENZIMÀTICO

I.MARCO TEÒRICO.
La úrea es el metabolito final del metabolismo de las proteinas ,es excretada
en grandes cantidades por la orina. Su excreción es la función principal del
riñón, representando por sí sola bastante más de la mitad del residuo sólido
de la orina. Usualmente constituye del 80 al 90% del nitrógeno total; El cuerpo
produce en promedio 25 a 30 gramos de urea al día –algo más en personas
que comen dieta rica en proteínas, menos en personas con dieta pobre en
proteínas Toda esta urea debe eliminarse por orina; de lo contrario se
acumulará en líquidos corporales.
Los dos factores principales que establecen el ritmo de excreción de urea son:
1) la concentración de urea en el plasma, y
2) la intensidad de filtración glomerular.

Estos factores aumentan la concentración de úrea.

En general, la cantidad de úrea que pasa por los túbulos y va a la orina es

aproximadamente proporcional a la carga de úrea que penetra en los túbulos
proximales, en promedio 50 a 60%. Sin embargo, esto solo es cierto cuando la
intensidad de filtración glomerular es normal.

Cuando la intensidad de filtración glomerular es muy baja, el filtrado persiste

en los túbulos por largo tiempo, antes de acabar en la orina.

Como todos los túbulos son por lo menos ligeramente permeables a la urea,
cuanto más tiempo persista el liquido tubular en los túbulos, mayor
reabsorción de úrea hacia la sangre; la proporción de úrea filtrada que llega a
la orina disminuye considerablemente.

Por otra parte, cuando la filtración glomerular es muy intensa, el liquido pasa
a través del sistema tubular tan rápidamente que se reabsorbe muy poca
úrea. Por lo tanto con intensidad de filtración glomerular muy elevada, casi el
100% de úrea pasa a la orina.

Es importante destacar que en aquellos pacientes con insuficiencia renal se

debe conservar la intensidad de filtrado glomerular en valores altos, debido a
que cuando esta disminuye demasiado, se incrementa la úrea en sangre.

II.COMPETENCIA.

Determina la concentración de úrea tanto en suero sanguíneo como en orina

por el método enzimático de la ureasa.
III.MATERIALES Y REACTIVOS
-Equipos y materiales.
a. Espectrofotómetro.
b. Centrifuga.
c. Baño María regulado a 37º.
d. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodón.
e. Tubos de prueba de 13 x 100 mm.
f. Micropipetas de 0 a 50 uL., pipetas de 1 , 5 y 10 ml.
g. Gradillas, baguetas.

- Reactivos.
a. Reactivo 1: contiene fenol y nitroprusiato de sodio.
b. Reactivo 2: contiene una solución concentrada de
hipoclorito de sodio e hidróxido de sodio.
c. Ureasa en solución.
d. Standard de úrea solución de úrea 60 mg / dL.

IV.TÈCNICA OPERATORIA.
a. En una gradilla disponer 3 tubos de prueba de 13 x 100 ml.,
marcarlos con las letras S (standard ); P (problema ) y B (blanco ) y
proceder como sigue :

B S P
Standard - 20ul -
Suero - - 20ul
Ureasa I gota I gota Igota
Mezclar por agitación suave e incubar x 5 minutos a 37ºC
Luego agregar
Reactivo Nº 1 mL. 1 1 1
Reactivo Nº 2 mL. 1 1 1
Mezclar por agitación suave e incubar x 5 minutos a 37ºC
Luego agregar
Agua destilada mL 10 10 10

a. Mezclar por inversión. Reposos 10 minutos y leer a 540 nn.

 b. Calcular la concentración de úrea en mg/dL aplicando la
siguiente fórmula

mg / dL = lectura del problema x 60

lectura del Standard

13.4.1. Valores de referencia. De 20 a 45 mg / dL.

V.CUESTIONARIO.

a. Explique porque para obtener mg/dL, se multiplica por 60.

b. ¿ Cómo se convierte el N uréico en urea y, viceversa
c. Grafique la interrelación del ciclo de la urea con el ciclo de
Krebs.
d. Indique que enzimas actúan en la mitocondria, y cuáles en el
citoplasma, en el ciclo de la úrea.
e. Se requiere de ayuno para realizar la determinación de úrea en
sangre.

VI.FUENTES DE INFORMACIÒN.
a. Devlin T homas M. Bioquímica con Aplicaciones Clínicas.
tomos I y II. Barcelona. E Reverté Colombiana. S A. 2000.
b. David LN, Cox M M. Lehninger Principios de Bioquímica .
Barcelona. Omega. 2001.
c. Lozano – Galindo. Bioquímica para Ciencias de la Salud.
España. McGraw - Hill- Interamericana.
d. Luque L y Hermoza A. Biología Molecular e Ingeniería Genética.
Barcelona. Hartcourt. 2001.
 PRACTICA 13

DETERMINACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE ÁCIDO ÚRICO EN ORINA Y SUERO

SANGUÍNEO.

I. MARCO TEÒRICO.

El ácido úrico es el metabolito de excreción de las purinas.

II. COMPETENCIA.
Determina las concentraciones de ácido úrico tanto en suero sanguíneo como en orina, por el
método de la uricasa.

III. MATERIALES Y EQUIPOS.

a. Espectrofotómetro.
b. Centrifuga.
c. Baño María 37 ºC.
d. Gradilla.
e. Pipeta de 1, 5 y 10 mL.
f. Micropipeta de 10 a 50 uL
g. Micropipeta de 100 a 1000 uL
h. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
i. Ligaduras
j. Agujas 20 x 1”
k. Tips azules y amarillos

Reactivos.

l. Solución estándar de ácido úrico 10 mg/dL.

m. Reactivo Enzimático
n. Alcohol etílico absoluto
o. Agua destilada.
p. Algodón

IV. FUNDAMENTO DEL MÈTODO:

La determinación enzimática de àcido ùrico en suero sanguíneo se realiza utilizando 2 enzimas:

uricasa y peroxidasa, cuyas acciones catalíticas en presencia de apropiados reactivos químicos,
permitirán la formación de un compuesto coloreado que es directamente proporcional a la
glucosa existente en el medio de reacción.

Uricasa
Âcido Ùrico + H2O + 02 Alantoìna + H2O2

Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O
V. TÈCNICA OPERATORIA

Preparar los siguientes medios de ensayo:

B MP1 MP2 St

Suero o plasma ---- 10 L ----- -----

Orina diluida al 10 % ---- ---- 10uL -----
Standard ---- ---- ----- 10 uL
Reactivo de trabajo (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0

Incubar en baño maría a 37 ºC durante 10 minutos y leer en el espectrofotómetro a 505 nm.

VI. RESULTADOS.
Utilizando el método del factor de calibración, determinar la concentración de ácido úrico y
expresarla en mg/dL de suero, y por orina de 24 horas en el caso de la orina.

VII. CUESTIONARIO
1. Cuáles son los valores normales de àcido ùrico?
2. En qué condiciones debe tomarse la muestra?
3. Como procedería si la lectura en el caso de la orina diluida fuera mayor a 2?

VIII. FUENTES DE INFORMACIÒN

a. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.
b. Devlin TM.Bioquímica . 4ª ed. Barcelona. Reverte. 2004.
c. Lehninger .Principios de Bioquímica.4ª ed. Barcelona. Omega . 2006.
d. Mathews CK, Van Holde KE Bioquímica. 3a ed. Madrid.Addison Wesley. 2002.
 PRACTICA 14

DETERMINACION DE BILIRRUBINA TOTAL

Y FRACCIONADA SERICA

I. MARCO TEÒRICO.
La vida del hematíe es de 120 días, transcurridos los cuales las células del
sistema reticulo endotelial, especialmente del bazo , hígado y médula
fagocitan a éstos hematíes liberando hemoglobina, la cual es catabolizada
y convertida en biliverdina, la misma que al reducirse se convierte en
bilirrubina. La bilirrubina se une a la albúmina , y asi es transportada
desde las fuentes extrahepáticas, a los sinusoides, el complejo bilirrubina-
albúmina atraviesa las microvellosidades sinusoidales pasando a la célula
hepática. La albúmina se separa y la bilirrubina por acción de los
glucorónidos se convierte en diglucorónido de la bilirrubina. La bilirrubina
no conjugada y los glucorónidos de la bilirrubina son transportados a la
sangre

La conjugación para la formación del glucorónido es un prerrequisito para

la eliminació de la bilirrubina en la bilis, y sea un factor limitante en el
transporteLa bilirrubina conjugada se elimina más rapido que la no
conjugada

II. COMPETENCIA.

Determina la concentración de bilirrubina total y fraccionada en suero,

conceptualizando su importancia biológica

III. EQUIPOS Y MATERIALES

a. Espectrofotómetro.
b. Centrifuga
c. Baño de María a 37ºC.
d. Jeringas descartables d x 5mL, con aguja hipodérmica
descartable Nº 20 x 1 “.
e. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
f. Micropipetas de 0a 50uL; punteras de color amarillo.
g. Pipetas de 1, 5 y 10 mL.
h. Gradillas; baguetas; ligaduras.

Reactivos.

a. Reactivo A: Acido sulfanilico al 0.5 % con 6 mL de HCL

b. Nitrito de sodio al 2%.
 c. Reactivo B. Se prepara en el momento de usar mezclando 10
mL. de Reactivo A con 0.3 mL. de nitrito de sodio.
d. Standard de bilirrubina de 5 mg/dL.
e. Metanol. G.R.
f. Alcohol medicinal.
g. Agua destilada.

IV. TÈCNICA OPERATORIA.

a. En una gradilla disponer 4 tubos de prueba rotulados con las letras B (

blanco
BD ( bilirrubina directa ) , BT ( bilirrubina total ) y S ( standard ) luego
proceder como sigue:
b. Mezclar y dejar en reposo 5 minutos.

B S BD BT
Suero mL 0.3 - 0.3 0.3
St. de bilirrubina 5 mg /dL, mL. - 03 - -
Agua destilada mL. 4.5 - 4.5 -
Metanol - 4.5 - 4.5
Reactivo A mL 05 - - -
Reactivo B mL. - 0.5 0.5 0.5

a. Leer en el espectroofotómetro a 525 nn.

b. Para obtener la concentración de la bilirrubina y fracciones se aplican
las siguientes fórmulas.

mg /dL de BT= lectura BT x 5 ; mg / dL de BD = lectura de BD x 5

Lectura S lectura de S

mg / dL de BI = BT - BD

V. CUESTIONARIO.
a. Describa el fundamento y las reaciones que ocurren en la
determinación de bilirrubina. Porqué se utiliza metanol.
b. De qué otras fuentes que no sea los hematíes envejecidos ,
proviene la bilirrubina.
c. Qué concentraciones séricas de bilirrubina puede tener un neonato
con Rh positivo , con el hecho de que la madre tenga sangre Rh
negativo.
 d. Ud. Determinaría bilirrubina en un suero bemolizado. ¿ Porqué ?.

VI. FUENTES DE INFORMACIÒN.

a. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.

b. Devlin TM.Bioquímica . 4ª ed. Barcelona. Reverte. 2004.

c. Lehninger .Principios de Bioquímica.4ª ed. Barcelona. Omega . 2006.

d. Mathews CK, Van Holde KE Bioquímica. 3a ed. Madrid.Addison Wesley.

2000