Técnicas Avanzadas

en Biología Celular
Cuaderno de Prácticas

María Angustias Martín Estepa

 1) DETERMINACIÓN DE HLA – G MEDIANTE TÉCNICA
INMUNOHISTOQUÍMICA.
El antígeno leucocitario humano G (HLA – G) es un antígeno de clase I del complejo
principal de histocompatibilidad codificado por un gen situado en el cromosoma 6p21.
Se diferencia de las moléculas clásicas de HLA clase I por su distribución tisular
restringida y su limitado polimorfismo en la región codificante (Alegre et. al., 2014).

Podemos distinguir entre 4 isoformas de membrana (HLA – G1, HLA – G2, HLA – G3 y
HLA – G4) y 3 isoformas solubles (HLA – G5, HLA – G6 y HLA – G7), siendo las más
estudiadas las isoformas HLA – G5 y HLA – G1, y tanto una como otra son capaces de
inhibir la función de las células NK, así como la respuesta de las células T CD4 y CD8
(Valdés, 2009).

En el experimento realizado, la determinación de HLA – G se llevó a cabo en muestras

de individuos trasplantados de corazón y muestras de individuos afectados por cáncer
de mama, utilizándose diferentes isoformas de dicha molécula, HLA – G de membrana
y HLA – G soluble.

Cada muestra tratada y posteriormente observada al microscopio óptico pertenece a

distintos pacientes en el caso de las muestras de cáncer de mama.

RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DE TRASPLANTE DE CORAZÓN:

En el caso de pacientes trasplantados de corazón la alta expresión de HLA – G de

membrana supone un buen pronóstico, siendo esta indicativa de una menor
probabilidad de que se produzca un rechazo. Sin embargo, si se produce una baja
expresión de esta molécula existe una mayor probabilidad de que se produzca
rechazo. Además la HLA – G de membrana suele expresarse en el propio miocardio
(Luque-Moruno, 2008). Por otra parte, durante el primer mes tras el trasplante, si los
niveles de HLA – G soluble son altos existe una menor probabilidad de que se produzca
rechazo, pero si estos niveles son bajos la probabilidad de que se produzca rechazo
será más alta. A medida que transcurre el tiempo los niveles de HLA – G soluble irán
disminuyendo si son altos hasta alcanzar los niveles presentes antes de que se llevara a
cabo el trasplante, o bien si son bajos permanecerán bajos y similares a los presentes
antes del trasplante (Luque-Moruno, 2008). .

En el caso de nuestros resultados observamos mayor expresión de HLA – G de

membrana que de HLA – G soluble, dado que no disponemos de información acerca de
cuándo se tomaron las muestras no podemos saber si existe alta o baja probabilidad
de que se produzca rechazo, por lo anteriormente explicado, es decir, no podemos
saber si los niveles de HLA – G soluble eran bajos desde el principio o son bajos porque
se han recogido las muestras tiempo después. Aun así podemos decir que la expresión
de HLA – G de membrana es indicativa de un buen pronóstico.
HLA – G de membrana: HLA – G soluble:

RESULTADOS DE LAS MUESTRAS DE CÁNCER DE MAMA:

El HLA-G, cuya expresión genera señales inhibitorias en varias células inmunitarias,

puede representar un mecanismo utilizado por las células tumorales para escapar del
sistema inmunitario (Ramos et. al., 2010), de manera que una elevada expresion de
esta molécula representa un mal pronóstico en el caso de padecer cáncer. Algunos
estudios han investigado las posibles implicaciones en clínicas de la expresión de HLA –
G en relacion con la presencia de cancer de mama, detectando niveles
significativamente más altos de HLA – G en pacientes con cancer de mama en
comparación con controles sanos (Che et. al., 2010; He et. al., 2010; Provatopoulou et.
al., 2012; Sayed et. al.,2010).

En este caso, nuestras muestras pertenecen a pacientes con cáncer de mama ductal, y
se ha demostrado que el HLA – G se expresa preferentemente en el caso de pacientes
con cáncer de mama ductal que en pacientes con cáncer de mama lobulillar
(Provatopoulou et. al., 2012; Tripathi y Agrawal, 2006).

Diversos estudios han correlacionado significativamente la expresión de HLA – G con el

tamaño del tumor, el estado ganglionar y el estadio avanzado de la enfermedad,
además aquellos pacientes que presentan una expresión positiva de HLA – G tienen
una tasa de supervivencia general más baja que aquellos con expresión negativa (Che
et. al., 2010; He et. al., 2010). Por otro lado, un analisis comparativo de la expresión de
ambos tipos de HLA – G (de membrana y soluble) en muestras de tejido mamario
afectado por un tumor utilizando citométria de flujo, llevado a cabo en otro estudio,
puso de manifiesto una mayor expresión del HLA – G (40%) de membrana que de HLA
– G soluble (24,4%) (Sayed et. al., 2010). En el caso de nuestros cortes tambien parece
apreciarse una mayor expresión de HLA – G de membrana que de HLA – G soluble, tal y
como se puede observar en las fotografias inferiores, aunque al tratarse de muestras
de diferentes pacientes esa podría ser la causa de que la expresión de las distintas
isoformas sea diferente.

HLA – G de membrana: HLA – G soluble:

 2) CULTIVOS DE EXPLANTES DE EPICARDIO PARA ENSAYOS DE TIME –
LAPSE
Este experimento se llevó a cabo con tejido cardiaco, obtenido mediante la extracción
del corazón de diversos fetos de ratón, y la posterior colocación de los órganos en un
medio propicio. Transcurridas 72 horas, dichos corazones se retiraron y se pudo
observar la presencia de una monocapa de epicardio, sin embargo se dejó crecer
durante unos días más y finalmente se llevó a microscopia confocal para llevar a cabo
los ensayos de time-lapse (imágenes inferiores en color rojo) en los que se pueden
observar la migración de las células mencionadas así como la proliferación de las
mismas.

Para explicar los resultados obtenidos habría que exponer como se produce el
desarrollo del epicardio:

Al principio del desarrollo, el corazón embrionario consta de solo dos capas: el

miocardio y el endocardio. El epicardio, que aún no está presente en esta etapa del
corazón tubular, se deriva de un cúmulo de células mesoteliales cardiacas conocido
como proepicardio (PE) (Smits et. al., 2018). En el ratón, el PE se hace visible desde el
día embrionario 8,5 como un grupo de células transitorias ubicadas en la base del
tracto venoso de entrada del corazón en desarrollo. Las células de la PE se sitúan de
forma adyacente al tubo cardíaco primitivo, pero no interactúan directamente con el
mesodermo cardiogénico que formará el futuro miocardio (Bressan et. al., 2013).

Una vez que el corazón embrionario se haya enrollado, el tubo del corazón desnudo se
cubrirá con una capa epicárdica de células derivadas del PE que se trasladarán al
corazón a través de diferentes mecanismos. Por ejemplo, en los ratones se forman
islas de células del PE ya que se separan de las vellosidades o se liberan como vesículas
flotantes (Rodgers et. al., 2008). La cobertura epicárdica se produce en el ratón entre
los días embrionarios 9,5 y 10,5. Además, el ventrículo izquierdo se cubre primero y
con una capa más densa en comparación con el ventrículo derecho (Vicente-Steijn et.
al., 2015).

Una vez establecido el epicardio, las células epicárdicas comenzarán a participar

directamente en la formación de la composición celular del miocardio. Un subconjunto
de células epicárdicas se someterá a un proceso conocido como transición epitelial a
mesenquimatosa (EMT), que comienza con células epicárdicas que pierden
características epiteliales, como su polaridad apical-basal y sus contactos célula-célula,
al reducir la expresión de las proteínas de adhesión transmembrana E-cadherina y
zónula occludens-1 (ZO-1) (Von Gise y Pu, 2012).

La migración de las células epicárdicas al miocardio es importante para el desarrollo

adecuado del miocardio y está controlada por un conjunto de factores de transcripción
como Nfatc1 y MRTF. Nfatc1 se expresa en un subconjunto de células epicárdicas y,
cuando se eliminan, produce niveles reducidos de enzimas que degradan la matriz y
una posterior alteración de la migración de las células derivadas del epicardio al
miocardio (Combs et. al., 2011).

La participación de todos estos factores de manera temporal y espacial controlada

para regular la EMT epicárdica y la migración de las células derivadas del epicardio al
miocardio es crucial para el desarrollo adecuado de la pared miocárdica (Smits et. al.,
2018).

Así, en las fotografías inferiores tomadas del time-lapse realizado se puede observar la
migración de las células epicárdicas anteriormente explicada.
 3) TÉCNICA INMUNOHISTOQUÍMICA EN TEJIDO IN VIVO
En este experimento utilizamos muestras de corazón y cabeza de rata, las cuales
mantuvimos en condiciones in vivo y llevamos a cabo una técnica inmunohistoquímica
con la utilización de dos anticuerpos primarios.

En primer lugar, se fijó el tejido con paraformaldehído para mantener las condiciones
in vivo y para una mejor adhesión al sustrato. A continuación, se realizó una técnica de
permeabilización que abre los canales de la membrana de las células de modo que
pueda producirse la unión antígeno – anticuerpo.

Anticuerpos primarios utilizados:

- Troponina (cabra o goat): cardioespecífica

- PCNA (ratón o mousse): proliferación celular
- KI-67 (conejo o rabbit): proliferación celular

Esto anticuerpos se diluyeron en una solución de bloqueo y se distribuyeron en los

distintos pocillos. A todos los pocillos se les añadió 2 anticuerpos primarios, quedando
2 de estos pocillos como controles, uno de ellos sin troponina pero con KI-67 y otro
solo con PBS sin ningún anticuerpo:
1 2 3 4 5 6
TP TP TP TP TP
PCNA PCNA PCNA PCNA PCNA KI-67
7 8 9 10 11 12
TP TP TP TP TP
KI-67 KI-67 KI-67 KI-67 KI-67 PBS

A continuación se prepararon 3 anticuerpos secundarios diferentes:

- Anti – mousse: Reconoce la PCNA unida a otro fluorocromo.

- Anti – goat: Reconoce la troponina unida a otro fluorocromo.
- Anti – rabbit: Reconoce la KI-67 unida a otro fluorocromo.

Estos anticuerpos secundarios se diluyeron en la misma solución de bloqueo en la que

se diluyeron los primarios y se añadieron en los pocillos correspondientes.

A continuación, se lavaron y se añadió DAPI, que es un colorante fluorescente que tiñe

de azul los núcleos.

Finalmente se observaron las muestras al microscopio de fluorescencia, obteniendo

como resultado imágenes como la inferior. Donde los diferentes colores representan:

- Azul  DAPI (marcador de núcleos celulares)

- Rojo  PCNA y KI-67 (marcadores de proliferación celular)
- Verde  Troponina (presencia de cardiomiocitos)
Además se pueden observar colocalizaciones:

- Amarillo (mezcla de rojo y verde)  Proliferación celular + presencia de

cardiomiocitos
- Azul claro (mezcla de verde y azul) Presencia de cardiomiocitos + núcleos
celulares
- Magenta (mezcla de rojo y azul)  Proliferación celular + núcleos celulares

Tal y como se ha indicado la troponina puede utilizarse para comprobar la presencia de

cardiomiocitos y DAPI se utiliza como marcador celular dado que tiñe los núcleos
(Cerrada-Serra, 2012). Por otra parte, PCNA y Ki-67 son marcadores de proliferación
celular. La ausencia de la proteína Ki-67 en las células en reposo y su expresión en
todas las células en proliferación, ya sean células normales o tumorales, hace que el
anticuerpo Ki-67 sea una gran herramienta para determinar la fracción de crecimiento
de cualquier población celular humana dada. En cuanto a PCNA, su expresión celular
se encuentra significativamente elevada durante las fases S y G2 del ciclo celular, pero
es muy baja en células en reposo, lo cual hace que esta proteína sea un buen marcador
de proliferación celular (Juríková et. al., 2016).

Por lo tanto, nuestra imagen nos muestra la presencia de cardiomiocitos (marcados en

verde) y de otros tipos celulares cuyos núcleos han sido marcados con DAPI (azul
oscuro), junto con los propios cardiomiocitos cuyo núcleo ha sido marcado también
(azul claro). Además, existe proliferación celular tanto de los cardiomiocitos (amarillo)
como del resto de especies celulares (magenta).
 4) ESTUDIO DE VIABILIDAD CELULAR
Muestras control:
Muestras tratadas con etanol:
Muestras tratadas con UV:
Porcentaje de células viables según el tratamiento al que han sido sometidas las
muestras:

CONTROL ETANOL UV
42,3 % 42,2 % 29,9 %

En este experimento se utilizaron cultivos de células HeLa en un medio RPMI, y se

introdujeron en placas con diversos pocillos, cada una de las placas se sometió a
distintos tratamientos, una de ellas fue tratada con etanol, otra con radiaciones
ultravioleta y otra no se sometió a ningún tratamiento.

La viabilidad celular entre las muestras que no han sido sometidas a ningún
tratamiento y las que se han tratado con etanol es muy similar, sin embargo en el caso
de la luz ultravioleta la viabilidad es inferior.

La radiación UV puede inducir la degradación del ADN y causar daño celular a través de
la producción de especies reactivas de oxígeno, lo que lleva a la muerte celular
programada. A su vez también puede producir disfunción mitocondrial y daño en el
ADN (Tringali et. al., 2016).

La disminución de la viabilidad celular aumenta a medida que lo hace el tiempo de

exposición a las radiaciones ultravioletas, generándose a su vez mayor cantidad de
especies reactivas de oxígeno, además de empezar a activarse los genes apoptóticos lo
cual se acompaña de una disminución en el gen anti-apoptótico Bcl-2 y una pérdida de
señales apoptóticas. Estos procesos pueden desencadenar una necrosis si transcurren
varias horas con un tratamiento continuo de radiaciones UV (Tringali et. al., 2016).

En este caso no se ha aplicado radiación ultravioleta de forma prolongada, sino

durante unos segundos, aun así tal y como se puede comprobar en los resultados
obtenidos, existe un menor porcentaje de células viables en la muestra tratada con
radiaciones UV, por lo tanto se han visto afectadas por las mismas, pudiendo haberse
producido lo anteriormente mencionado.
 5) ESTUDIO DE PROLIFERACIÓN CELULAR
El estudio de proliferación celular se ha llevado a cabo con cultivos de células Jurkat y
células HeLa, las cuales fueron introducidas respectivamente en los medios DMEM y
RPMI. Se colocaron en 3 placas de 96 pocillos y cada una de las cuales se expuso a un
tratamiento distinto, una se trató con etanol, otra con radiaciones ultravioleta y otra
no tuvo ningún tratamiento. Se llevó a cabo una prueba de ELISA para cada una de las
placas y un revelado con DAPI, añadiendo a cada muestra bromodeoxiuridina, puesto
que es un indicativo de proliferación celular, dado que a mayor acumulación de esta
mayor será la proliferación celular, y para la localización de este se añadió además un
anticuerpo secundario.

Valores corregidos (Absorbancia 450 nm):

CONTROL ETANOL UV
0,0651 0,1184 0,5243
0,0570 0,1557 0,3881
0,0613 0,1400 0,4585
0,0561 0,1148 0,6193
0,0695 0,3185 -

Prueba de Kruskal-Wallis
Tamaño de Muestra Rango Promedio
Control 5 3,0
Etanol 5 8,0
UV 4 12,5
Estadístico = 11,5714 Valor-P = 0,00307112

intervalos de confianza del 95,0%

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites
Control - Etanol -5,0 6,33389
Control - UV * -9,5 6,7181
Etanol - UV -4,5 6,7181
* indica una diferencia significativa.

El StatAdvisor
La prueba de Kruskal-Wallis evalúa la hipótesis nula de que las medianas dentro de
cada una de las 3 columnas es la misma. Primero se combinan los datos de todas las
columnas y se ordenan de menor a mayor. Después, se calcula el rango (rank)
promedio para los datos de cada columna. Puesto que el valor-P es menor que 0,05,
existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medianas con un nivel del
95,0% de confianza.
En cuanto a la absorbancia obtenida en cada caso, a menor número de células mayor
será la absorbancia, dado que cuantas menos células haya mayor luz se transmitirá.
Por lo tanto, podemos observar que tanto en el caso de las células tratadas con etanol
como las tratadas con radiación ultravioleta, se puede decir que un menor número de
células dado que la absorbancia es mayor que la de las muestras control. Sin embargo,
resulta mucho más significativa la diferencia de absorbancias entre las muestras
control y las tratadas con radiación ultravioleta.

A su vez, se realizó una prueba estadística (kruskal-wallis) la cual también pone de

manifiesto que existen diferencias significativas entre la muestra control y la muestra
tratada con radiación ultravioleta, tal y como se puede observar arriba. Por otra parte,
no existen diferencias significativas entre las muestras tratadas con etanol y las
muestras control, ni entre las muestras tratadas con etanol y las tratadas con radiación
ultravioleta.

Existen estudios que han demostrado que la radiación ultravioleta induce la muerte
celular programada o apoptosis en células donde se aplica (Banerjee et.al., 2005;
Callegari y Kelly, 2006), lo cual generaría una disminución en la proliferación celular.
Esto podría explicar los resultados obtenidos en esta práctica.
 6) CONTROL DEL CICLO CELULAR CON CÉLULAS HeLa
Muestras control:
Muestras tratadas con etanol:
Muestras tratadas con UV:
 Porcentaje de células según el tratamiento empleado
correspondiente a cada fase del ciclo celular
Fase del ciclo CONTROL ETANOL UV
celular
G0 - G1 50,7 % 12,9 % 31,6 %
S 12,1 % 4,7 % 13,1 %
G2 - M 12 % 22, 9 % 20,4 %

CONTROL ETANOL UV
PORCENTAJE
TOTAL DE CÉLULAS
CAPTADAS POR EL 76,2 % 43 % 66,8 %
CITOMETRO

Se ha llevado a cabo el análisis del ciclo celular de células HeLa sometidas a distintas
condiciones mediante citometría de flujo. Esta técnica se basa en la capacidad del
colorante ioduro de propidio de emitir fluorescencia una vez se ha unido al ADN.
Teniendo en cuenta que la carga de ADN de una célula varía a lo largo del ciclo celular,
la cuantificación de la fluorescencia del ioduro de propidio permite realizar un
seguimiento del porcentaje de células en cada una de las fases del ciclo celular
(Peropadre, 2014).

De acuerdo con los gráficos superiores podemos determinar si existe aneuploidía,

poliploidía o ninguna afección en cada uno de los casos. Si encontramos un pico que
se encuentre delante de los picos que representan cada una de las fases, entonces
tendríamos aneuploidía, si no encontramos ningún pico adicional no habría ninguna
afección y si encontramos un pico posterior a los tres picos correspondientes a las
fases del ciclo celular, tendríamos poliploidía. Tras esto, podemos decir que en el caso
de la muestra control y la tratada con radiaciones UV, no existe ninguna afección. Sin
embargo, las muestras tratadas con etanol presentan aneuploidía.

El etanol puede afectar la progresión del ciclo celular al interrumpir la señalización del
factor de crecimiento. Esto puede estar mediado por la inhibición de los factores de
crecimiento promitogénicos o la potenciación de agentes antimitogénicos. Además,
bloquea la acción de los factores de crecimiento de modo que se generan menos
células (Hicks et. al., 2010), lo cual explica que el porcentaje total de células contadas
por el citómetro sea mucho más bajo que el correspondiente a la muestra control.

La progresión del ciclo celular presenta varios puntos de control, uno entre las fases
G1 y S del ciclo celular y otro entre las fases G2 y M (Callegari y Kelly, 2006). Cada
punto de control está regulado por factores de transcripción y proteínas quinasas que
inactivan los complejos de ciclina / quinasa dependiente de ciclina (Cdk). El etanol
afecta la expresión de proteínas reguladoras necesarias para la progresión a través del
ciclo celular, incluidas las ciclinas, los Cdks asociados y los inhibidores de Cdk. El
alargamiento de G1 inducido por etanol está asociado con la expresión alterada de
ciclina D1 y Cdk2 (Siegenthaler y Miller 2005). El etanol también afecta la expresión de
p53, las actividades mediadas por p53 y los reguladores aguas abajo de p53. Dichas
alteraciones pueden retrasar la activación del primer punto de control anteriormente
mencionado inducida por etanol, lo que lleva a un retraso en el ciclo celular (Hicks et.
al., 2010).

Estos estudios demuestran que la exposición de las células a etanol provocan

alteraciones en el ciclo celular, tal y como nos ha ocurrido en nuestro caso, aunque
esto no explica porque se produce aneuploidía al aplicar un tratamiento de etanol. Sin
embargo el pico adicional que encontramos previamente a la fase G1 podría deberse
al alargamiento de dicha fase mencionado anteriormente.

Por otra parte, otros estudios muestran que la exposición prolongada de las células a
radiaciones UV induce daños en el ADN, pero existen genes que promueven la
reparación de este (Hockberger, 2002).

El dímero de pirimidina es la forma más habitual de daño en el ADN provocada por

radicación UV, la cual se elimina por escisión de nucleótidos. Si estos dímeros de
pirimidina están presentes durante la fase S, causan brechas en las hebras de ADN
hijas (Lopes et. al., 2006). Además, se han observado varias respuestas del ciclo
celular eucariótico después de la irradiación elevada y prolongada con UV. Por un
lado, puede producir una alteración en la fase G2 retrasando el inicio de la mitosis, lo
cual representa un punto de control que no permite continuar el ciclo al existir un
daño en el ADN, retrasando la continuación del mismo hasta haber reparado el daño.
También existe otro punto de control entre las fases G1 y S que alarga la primera
retrasando el inicio de la segunda cuando se produce una irradiación prolongada de
UV, de modo que p53, además de producir ese retraso en la entrada en la fase S,
elimine las células dañadas mediante apoptosis y facilite la reparación por escisión de
nucleótidos (Callegari y Kelly, 2006).

Sin embargo, si las muestras se exponen a una dosis UV comparable a la exposición a

la luz solar, encontramos que las células no retrasan el ciclo celular en la etapa en que
se irradiaron (Callegari y Kelly, 2006), por lo tanto, eso es lo que ocurre en nuestro
caso, no se produce ninguna alteración notable en el ciclo porque la exposición de las
muestras no ha sido prolongada ni elevada. Pero sí que encontramos un menor
porcentaje de células total, lo cual puede deberse a la apoptosis generada por p53 en
los puntos de control para eliminar las células que han debido ser dañadas.
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