UNIVERSIDAD PRIVADA DE TACNA BIOTECNOLOGIA AMBIENTAL

SECUENCIACION DEL ADN

CONCEPTO
La secuenciación determina la secuencia de los nucleótidos de un oligonucleótido de ADN atreves
de diferentes métodos o tecnología de las cuatro bases nucleótidos: timina, guanina, citosina y
adenina; para ser llamada secuenciación debe ver por lo menos cuatro sucesiones de nucleótidos. Al
transcurrir el tiempo la tecnología que se empleaba en para obtener la secuenciación de ADN ha ido
mejorando logrando obtener secuencias completas de genomas de numerosos tipos y especies de seres
vivos, incluyendo el genoma humano, animales, vegetales y especies microbianas.(Metzker, 2015)
DESARROLLO DE LA HISTORIA
En el transcurso del tiempo gracias al aporte descubrimiento de la estructura del ADN por los
científicos Watson y Crick, el estudio del ADN en fue avanzando por los diferentes científicos en el
transcurso del tiempo que idearon métodos y técnicas para ver más detalladamente como es la
secuenciación del ADN, se produjeron millones de secuencias de especies de arqueas, bacterias y
eucariontes.(Valdelamar & Díaz, 2014)
Empezaron a ver estudios sobre el genoma de la levadura S. cerevisae en cual se usó el método
bioquímico de hidrolisis parcial con enzimas y fraccionamiento de los productos generados en
columnas de intercambio iónico o electroforesis en papel, fue así como se empezó a desarrollas los
principales protocolos de secuenciación de ácidos nucleicos. Se le da reconocimiento al científico M.
Maxan y Walter Gilbert quienes establecieron el proceso de digestión química del DNA para
determinar la secuencia de nucleótidos del ADN. Consiste en marcar en los extremos 5´ o 3´ de una
o puede ser de ambas hebras con el isótopo radiactivo del fósforo, el 32P. La muestra tomada del
ADN se divide en cuatro alicuotas y dando origen a cuatro reacciones químicas distintas. Para los
nucleótidos de Ademina y Guanina, se metilan con DMS y se trabaja en un medio alcalino, logrando
asi el fragmento de las cadenas en las purinas metiladas. En cambio, para los nucleótidos de la
Citosina y Timina, se trabajan con hidracina y luego con piperidina que logra el fragmento de ambas
pirimidinas. Luego con los fragmentos de obtenidos del ADN generados se separan en geles de
acrilaminda por vía electroforesis en cuatro vías distintas según sea el tamaño, por las bandas
generadas por medio autoradiografia. Sabiendo con que nucleótido se realizaron los cortes, es factible
la ver la naturaleza de los nucleótidos y logrando inferir la secuencia de la molecula original.Esta
técnica permitió conocer y hacer lectura de unas 100 bases de secuencia, logrando determinar la
secuencia desde la primera base.(Buermans, 2017)
En 1977 se dio a conocer un nuevo método de secuenciación que se le dio el nombre de
“secuenciación enzimática de Sanger” , que revolucionaria la biología molecular como se la conocía
en ese entonces. Este nuevo protocolo su objetivo es hacer cuatro reacciones diferentes de síntesis de
ADN utilizando la función propia del ADN polimerasa, empleando un didesoxinucleotido y un
nucleótido marcado radiactivamente con Dntp, diferente en cada tubo. Se vierte el ADN polimerasa
a la mezcla, empezara añadir nucleótidos a la cadena complementaria hasta que, por haber añadido
un ddNTP, se neutralice la síntesis de la hebra complementaria por no presentar un extremo 3′, se
puedan seguir añadiendo nucleótidos a la hebra complementaria. La incorporación de los ddNTPs es
al azar, para asi tener muestras de fracmentos de todos los tamaños posibles que terminan en un
residuo específico. Después, estos fragmentos se pueden separar en un gel de poliacrilamida vía
electroforesis en cuatro carriles distintos para hacer lectura de abajo a arriba, la secuencia de la hebra
de origen. Este método se pudo determinar secuencias de 80 nucleotidos, para tener mayores

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longitudes es necesario partir de 15 cebadores que empiecen a formar una nueva reacción a una
separación de 80 nucleotidos después y asi sucesivamente. (Buermans, 2017)
Al transcurrir el tiempo este método de Sanger se automatizo por Leroy Hood, Michael Hunkapiller
y Lloyd Smith. En 1986, se dio la comercialización del primer secuenciador automático del método
Sanger, el Applied Biosystems 370A, un secuenciador automatizado con gel tipo “slab” o gel en
vertical que nos permitía lograg obtener 200 bases por muestra/ hora. Existían otros secuenciadores
de geles “slab” son el ASTRAL o el LI-COR Modelo 4200, que producían mayor información por
medio de la realización de variaciones térmicas en su construcción. Luego en la siguiente generación
se incorporo la electroforeis capilar, resaltando el equipo ABI PRISM 3700. fue empleado para llevar
a cabo la secuenciación del genoma humano planteado en el Proyecto Genoma Humano (1985-2003).
Este método era muy caro y demandaba mucho tiempo determinar el genoma humano, es por eso que
se dio el origen de la conocida como Next Generation Sequencing (NGS), ultrasecuenciación o
tecnología de secuenciación masiva,realiza multiples secuencias cortas, logrando obtener millones de
lecturas en el mismo tiempo y el costo era bajo a comparación de otro métodos.(Valdelamar & Díaz,
2014)
Luego hubo una segunda generación se basan en la técnica se centra en la preparación del DNA a
secuenciar y el protocolo empleado en la secuenciación. Según la técnica empleada en la preparación
del DNA como puede ser de dos tipos PCR en emulsion y PCR en puente.(Truman, 2017)
Secuenciadores de tercera generación son desarrollados por las plataformas Pacific Biosciences y
Oxford Nanopore. llevan a cabo la llamada secuenciación a tiempo real (SMRT) que usa adaptadores
circulares y a través de un tipo especial de chips en donde se logra verificar el cambio de actividad
sufrida por la DNA polimerasa tras la adicción del nucleótido marcado con fluoróforo en el caso de
Pacific Biosience, o puede ser por la detección de una variacion de voltaje producido por el paso de
la secuencia de DNA por algún poro, composición del DNA a secuenciar, tanto de una cadena en
sentido foward, el caso de Oxford Nanopore, cuya idea innovadora se reconocer a la figura de George
M. Church.(Metzker, 2015)
LA PIROSECUENCIACION
Es el método de secuenciación de ADN, basado en la fuga de pirofosfatos a partir de sus dNTPs en
una reacción de polimerización del ADN. En este método requiere la presencia de una molecula mono
cateriana de ácido desoxirribonucleico el cual se hibrida con un pequeño cebador. Al pasar el tiempo
se ira sintetizando la cadena se obtendrá una serie de picos de señal en el pirograma en cual
lograremos obtener la secuencia.(Valdelamar & Díaz, 2014)
BIBLIOGRAFIA
Buermans, H. (2017, enero 19). De Sanger a NGS, breve historia de la secuenciación del
DNA. Recuperado 30 de marzo de 2019, de una biologia en la cocina website:
https://unabiologaenlacocina.wordpress.com/2017/01/19/de-sanger-a-ngs-breve-historia-de-
la-secuenciacion-del-dna/
Metzker, J. M. (2015, noviembre 16). Secuenciación del ADN - National Human Genome
Research Institute (NHGRI). Recuperado 30 de marzo de 2019, de National Human Genome
Research Institute website: https://www.genome.gov/27563183/secuenciacin-del-adn/
Truman. (2017, noviembre 17). La secuenciación de ADN cumple 40 años - Genética Médica
News. Recuperado 30 de marzo de 2019, de Genetica Medica website:
https://revistageneticamedica.com/2017/11/17/secuenciacion-del-adn-40-anos/

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Valdelamar, L., & Díaz, A. S. (2014). Secuenciación de fragmentos de ADN. 20.Recuperado

de http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/secuenciacion.pdf

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