AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE

I. OBEJTIVOS
 Conocer los diferentes ecosistemas de los microorganismos
 Conocer los diferentes comportamientos de los microorganismos en diferentes
medios de cultivo.
II. INTRODUCCION

En la naturaleza, la mayoría de los microorganismos no se encuentran aislados, sino

integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos
microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar
con especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros.

Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo tipo de microorganismo y que
procede generalmente de una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio
sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe el nombre de colonia.

Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de una población microbiana mixta, se
utilizan las denominadas técnicas de aislamiento, que fueron desarrolladas durante el
siglo XIX. En un principio, Lister utilizó diluciones seriadas en medio li ́quido con esta
finalidad, pero la presencia de contaminación, es decir, de microorganismos no desea-
dos, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert Koch introdujo los medios só lidos,
complementa- dos con agar, y las placas de Petri en Bacteriologi ́a, permitiendo asi ́ la
separación fi ́sica de las colonias sobre la superficie del medio de cultivo o en el interior
del mismo.

El aspecto de las colonias sirve para diferenciar distintas especies microbianas.

III. MARCO TEORICO

En todos los ambientes naturales habitan múltiples microorganismos de diversos tipos
y actividad fisiológica. Para efectuar el estudio de un organismo particular es necesario
separarlo de la población mixta en la que se encuentra. Para tal fin se emplean
técnicas de aislamiento que conduzcan a la obtención de un cultivo puro. De manera
general los métodos de aislamiento incluyen:
1. Separación física de los microorganismos mediante:
a) Diluciones seriadas y siembra por vertido en placa.
b) Siembra por agotamiento.
2. Utilización de medios de cultivos selectivos y diferenciales.
3. Aprovechamiento de características particulares de los microorganismos, tales
como la formación de esporas, el metabolismo anaerobio y/ o facultativo, la
capacidad para utilizar sustratos poco comunes, etc. Para facilitar el proceso de
aislamiento y obtener mejores resultados, frecuentemente se emplean
combinaciones de las técnicas anteriores.
Técnicas de aislamiento. Se realiza un aislamiento de los microorganismos presentes
en un cultivo mixto en caldo ordinario, sobre agar nutritivo.
Estas técnicas pretenden diluir la carga microbiana que se deposita sobre el medio
de cultivo de forma que, en los últimos trazos de la siembra, haya tan pocas células
que queden suficientemente separadas unas de otras y puedan desarrollar colonias
independientes.
Técnica de aislamiento y recuento: el banco de diluciones. Se realizan una serie de
diluciones seriadas a partir del cultivo mixto Con esta técnica conseguimos además
de aislar colonias, obtener un recuento del número de bacterias que tenemos en el
cultivo.
TECNICAS

Estría múltiple en superficie

Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de
microorganismos y se extiende sobre un área pequeña de la superficie de la placa
con agar nutritivo, en forma de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para no
dañar el agar.
Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la siembra realizada previamente, se
extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este proceso se
repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas
siembras en estría. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre
en posición invertida.
Mediante esta técnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que
contenga un elevado número de bacterias.

Dilución en masa

En una placa de Petri vacía se deposita un pequeño volumen conocido de muestra y

a continuación se añade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado
aproximadamente a 45oC. Se mezclan ambos por rotación suave de la placa. De esta
forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el medio de
cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
Otra variación de esta técnica consiste en inocular.

Extensión en superficie con cayado

Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de
una determina- da dilución del cultivo de microorganismos problema y extenderlo
con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que
esté completamente seco. Incubar la placa, en posición invertida, a la temperatura
deseada (durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de micro- organismo. La posición
invertida evitará que el agua de condensación se deposite sobre la superficie del
medio, dificultando la obtención de colonias aisladas. Es una técnica usada para el
aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en
la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.
 IV. MATERIALES Y EQUIPOS
1. Muestra de suelo, insectos (cucarachas, moscas y hormigas).
2. Mechero bunsen.
3. Asa bacteriológica.
4. Set de coloración gram
5. Placas con agar Mc Conkey.
V. METODOLOGIA
a) Emulsionar las muestras de suelo o insectos en una cierta cantidad de chicha
de jora.
b) Sembrar por diseminación y agotamiento en los diferentes medios de cultivo
requerido.
c) Incubar a 37°C
VI. RESULTADOS
a) Analisis cualitativo

Bacteria 1 T 50°C 2 T 75°C 3 T 100°C 4 T 75°C 5 T 50°C 6 T 100°C

Forma Circular Circular Irregular Circular Irregular Irregular
Borde Entero Semi Lobular Ondulado Filamentoso Ondulado
ondulado irregular
Elevación Convexa Plana Muy elevado Plana Convexa Cráter
Superficie Lisa Lisa Ligeramente Con pliegues Rugosa Con
rugosa pliegues
Consistencia Seca y frágil Seca y frágil Viscosa Cremosa Viscosa Viscosa
Color Blanco Gris metálico Amarillo Blanco Naranja Amarillo
crema crema claro lechoso transparente mostaza
Luz Opaca Transparente Opaca Trasparente Traslucida Traslucida
transmitida
Luz reflejada Brillante Brillante Brillante Poco Opaco Opaco
brillante

b) Análisis cuantitativo.

Como se observa en la imagen para contabilizar la cantidad de bacterias se

dividió en 4 partes iguales y se contabilizo una de ellas.
56 X 9 X 4 X 103 = 2016 X 103 UFC/ml.

Como se observa en la imagen para contabilizar la cantidad de bacterias se

dividió en 4 partes iguales y se contabilizo una de ellas.
56 X 9 X 4 X 103 = 2016 X 103 UFC/ml.
 VII. CONCLUSION

Durante los cultivos que realizamos pudimos observar que en nuestro organismo
existen bacterias, en la cual se demostró que en la piel tenemos defensa contra los
efectos de estos microorganismos que se encuentran alrededor, lo que hay que
mantener una buena higiene y saber eliminar los desechos para evitar la
contaminación.

VIII. CUESTIONARIO

1. ¿En la coloración Gram realizada que tipo de microorganismo se observó?

La tinción diferencial
requiere el uso de al menos
3 reactivos químicos que se
aplican en secuencia a un
frotis fijado por calor. El
primer reactivo es llamado
tinción primaria o colorante
primario. Su función es
impartir color a todas las
células. Con el objetivo de
establecer un contraste de
color, el segundo reactivo
usado es un agente
decolorante, el cual puede
decolorar la célula completa
o solo parte de ella. El reactivo final, el colorante de contraste, le da a las células decoloradas un
color que contrasta con el del colorante primario. El colorante de contraste no puede ser absorbido
por células que no han perdido el colorante primario. De esta manera, tipos de células o sus
estructuras se pueden distinguir unas de otras en función del colorante que es absorbido.

 Tinción Primaria: Se utiliza Cristal Violeta, que tiñe todas las células moradas.
 Mordiente: Yodo o lugol. El yodo, aparte de matar bacterias, incrementa la afinidad del
colorante primario con la célula, formando complejos insolubles con este. El complejo cristal
violeta-yodo sirve para intensificar el color del tenido.
 Agente decolorante: Se utiliza alcohol etílico al 95%. El etanol tiene doble función:
deshidratante de proteínas y solvente de lípidos. El alcohol disuelve los lípidos de la parte
externa de la pared celular Gram-negativa, haciendo la pared más porosa. De esta manera,
el complejo Cristal violeta-yodo es removido de la capa de mureina más fina de las bacterias
Gramnegativas, mientras que la pared más gruesa de las Gram-positivas retiene el tinte en
su interior.
  Tinción de Contraste: Safranina. Este tinte se utiliza para teñir de rojo las células
previamente decoloradas, o sea, las Gram-negativas.1

2. Indique que microorganismo podemos encontrar en los suelos contaminados.

Algunos microorganismos tienen la habilidad de desarrollarse en ambientes extremadamente

contaminados y pueden ser capaces de alterar el estado químico, la forma o distribución de los EPTs
(elementos potencialmente tóxicos) en el suelo. Como resultado, éstos deben considerarse en los
diferentes procesos de recuperación de áreas contaminadas. Aun cuando los microorganismos
incluyen menos de 3% del carbono orgánico del suelo y ocupan sólo 0.001% del volumen del suelo,
ellos son la maquinaria bioquímica que maneja los procesos químicos de transformación, secuestro y
acumulación de los EPTs en el suelo. Las bacterias y los hongos son los que principalmente se
involucran en la mayoría de los procesos del suelo, así como en la degradación de compuestos
orgánicos y la transformación de EPTs. Las bacterias representan la mayor diversidad en el suelo y se
distribuyen en todos los ambientes vivos. Su rápido crecimiento y metabolismo las ubican como
importante alternativa en el proceso de recuperación. Las bacterias tienen, en general, una amplia
capacidad para acumular metales en su biomasa. Por otro lado, los hongos filamentosos tienen,
además, la característica de invadir el suelo por medio de la extensión de su micelio e incrementar la
superficie de exploración y acción. Aunque los actinomicetos, hongos micorrízicos arbusculares y las
cianobacterias forman parte del complejo microbiano de suelos altamente contaminados,
relativamente poca investigación se conduce en estos grupos microbianos y, por lo tanto, poco se
conoce de su participación en los procesos de descontaminación de los EPTs y otros compuestos
tóxicos. Estos grupos microbianos se asocian con las raíces de las plantas, en consecuencia su
influencia no debería ignorarse.

Resulta relevante hacer énfasis que ciertos grupos microbianos tienen múltiples funciones y
propiedades que ofrecen dentro de la biotecnología de la recuperación de suelos, como, por
ejemplo: su capacidad para fijar nitrógeno atmosférico, solubilizar fósforo, producir antibióticos,
sustancias promotoras del crecimiento, sideróforos y sustancias con actividad surfactante. Esto
permite a la planta obtener ventajas adicionales de la asociación con estos microorganismos. Es
posible aislar bacterias tolerantes de suelos con altas concentraciones de EPTs, ya sea por
contaminación humana o de origen natural. Las bacterias más comúnmente aisladas de ambientes
contaminados por el hombre con EPTs son: Burkholderia pickettii, B. solanacearum y Alcaligenes
eutrophus. Las bacterias aisladas de suelos naturalmente contaminados con EPTs, pertenecen a
varios géneros. Algunos ejemplos son: Burkholderia, Hafnia, Pseudomonas, Acinetobacter,
adicionales de la asociación con estos Comamonas y Agrobacterium. Especies Gram positivas
también se encuentran en estos ambientes, por ejemplo: Arthorobacter ramousus y A. aurescens.
Sizova et al. (2001) concluyeron que el uso de especies de Pseudomonas (P. fluorescens 38a, P.
putida 53a y P. aureofaciens BS1393) incrementaron la supervivencia de sorgo en un suelo
contaminado con arsenito. Estas bacterias también presentaron la característica de ser antagonistas
contra un amplio número de hongos fitopatógenos y ser promotoras del crecimiento de esta planta.

Recientemente, ante la búsqueda de tecnologías novedosas para la expedita remediación de

suelos contaminados con EPTs, el uso de productos microbianos se plantea como una biotecnología

1
http://www.pucmmsti.edu.do/websise/estudiante/materias/201220132/ST-BIO-231-P-071/BIO-
231%20PRACTICA%202%202-12-13.pdf
más para remover estos contaminantes presentes en el suelo. Por ejemplo, los sideróforos, los
cuales son componentes extracelulares de microorganismos, que secuestran y solubilizan hierro; sin
embargo, en adición al Fe, otros metales como el Cd, Cu, Ni, Pb y Zn pueden ser enlazados y formar
complejos estables. Otro ejemplo son los surfactantes que también tienen la capacidad de remover
EPTs del suelo. Maier (1995) demostró que Pseudomonas aeruginosa produce biosurfactantes que
acomplejan Cd, Pb y Zn, tanto de soluciones, como del suelo. 2

3. ¿En insectos como moscas y cucarachas que microorganismos podemos encontrar?

Especies de bacterias transmitidas por las cucarachas y enfermedades que provocan:

Fuente 3

2
http://www.redalyc.org/pdf/573/57323104.pdf
3
http://www.scielo.org.co/pdf/rudca/v13n2/v13n2a04
 Bacterias
 Citrobacter freundii
 Klebsiella pneumoniae
 Serratia marcenscens
 Escherichia coli
 Providencia rettgeri
 Enterobacter cloacae
 Enterobacter
aerogenes
 Acinetobacter
calcoaceticus
 Salmonella sp.
 Klebsiella oxytoca
 Enterobacter gergoviae
 Yersinia enterocolitica
Parásitos Hongos
 Aspergillus
 Entamoeba coli
fumigatus
 Entamoeba histolytica
 Penicillium sp.
 Endolimax nana
 Rhizopus sp.
 Blastocystis hominis
 Criptococcus sp.
 Iodamoeba butschlii
 Candida sp.
 Entamoeba hartmanii
 Fusarium sp.

4. ¿Qué medios de cultivo son los más indicados para los microorganismos ambientales y
enterobacterias?

Enterobacterias:

 Agar Sulfito Bismuto conocido como: SB

 Agar Salmonella-Shigella conocido como: SS
 Agar Xilosa, Lisina, Desoxicolato, conocido como: XLD
 Agar XLD
 Agar Rojo de Violeta con Bilis y Dextrosa, conocido como: VRBD
 Agar Eosina Azul de Metileno conocido como: EMB
 Agar Mac Conkey conocido como: MC
 Agar Verde Brillante conocido como: VB
 Agar verde brillante

Microorganismos ambientales

- Caldo Bilis-Verde Brillante 2%: E.coli

- Agar citrato de Simmons: enterobacterias y algunos hongos
- Caldo EC: microorganismos coliformes y E.coli
- Agar Hierro de Kligler: Bacilos entéricos Gram-negativos
 - Caldo LB (Luria-Bertoni): E.coli
- Agar MacConkey: microorganismos coliformes
- Agar Mueller-Hinton: gonococos y meningococos
- Agar Base de Urea: bacilos entéricos y bacterias capaces de producir ureasa

5. Indique el fundamento de los medios de cultivo para los microorganismos mencionados

en la pregunta 3

BACTERIAS
 Klebsiella pneumoniae: Agar Mac Conkey
 Serratia marcenscens: Agar hektoen
 Escherichia coli: Agar hektoen
 Enterobacter cloacae: Agar levine
 Acinetobacter calcoaceticus: agar MacConkey
PARASITOS
 Entamoeba coli: el medio de DOBELL
 Entamoeba histolytica: medio de Dobell y Laidlaw
HONGOS
 Criptococcus sp: agar Sabouraud sin cicloheximida
 Candida sp: Agar- Glucosa Sabouraud (Gibco)
 Fusarium sp: medio de cultivo CLA (agar hojas de clave)

6. Discutir los resultados del análisis cuantitativo y cualitativo de las muestras

mencionadas

En el análisis cuantitativo se pudo observar una menor cantidad de colonias de

microorganismos al verse mayor proporción de sustancia en el cultivo debido a que solo
unos cuantos pudieron adaptarse a esa condición; en cambio cuando existe una mayor
cantidad de colonias de microorganismos, es debido a que hay una menor proporción de
sustancia en el cultivo.

En el análisis cualitativo se pudo observar una variación de cantidad de microorganismos

con respecto a su temperatura:

Cuando se presenta a 50 °C hay una menor cantidad de colonias, en comparación a la

anterior y es debido que en esta placa solo se encontraran las bacterias termófilas teniendo
su temperatura óptima de crecimiento a 50°C

Cuando se presentan a 70°C hay casi 50% menos de colonias que la anterior y es a causa de
que aquí se encuentran bacterias termófilas pero no se encuentran a su temperatura
óptima de crecimiento.
Y finalmente cuando se presentan a 100 °C ya se refleja menor cantidad y es debido que
son bacterias termófilas y está aún más lejos de su temperatura óptima de crecimiento.