Laboratorio de Bioquímica General
Práctica: Aislamiento de DNA de origen vegetal y su
caracterización espectrofotométrica, identificación de
bases púricas y pirimídicas por cromatografía en capa fina
Introducción
El DNA y RNA son polímeros lineales largos
llamados ácidos nucleicos, que contienen
información de tal forma que puede ser
transmitida de una generación a la siguiente.
Estas macromoléculas están formadas por un
gran número de nucleótidos unidos, formados
por 1 base nitrogenada (purina o pirimidina,
una pentosa (D-ribosa en el caso del RNA y 2-
desoxi-D-ribosa en el caso del DNA) y de uno,
dos o tres fosfatos.
La composición de las bases purínicas tanto
para el DNA y el RNA es de Adenina(A) y
Guanina(G), mientras que las bases
pirimidicas para el DNA es de Citosina(C) y
Timina (T) y para el RNA es de Citosina y
Uracilo(U). Uniéndose Citosina con Guanina y
Adenina con Timina (DNA), Adenina con
Uracilo (RNA).
Por su parte el DNA adopta la forma de doble
hélice, una forma helicoidal constituida por dos
hebras completas de ácidos nucleicos. Entre
las principales funciones del DNA es codificar
la síntesis de las proteínas que participan en
las tareas estructurales o funcionales de una
célula y actuar como la unidad básica de la
herencia al transmitirse a través de las
generaciones
Objetivos
● Aislar, purificar y caracterizar DNA de
una guayaba.
● Identificar bases púricas y pirimídicas
por medio de cromatografía en capa
fina.
Análisis de la técnica (aislamiento de DNA
de guayaba)
Se realizó la trituración de 15 g de vegetal, en
este caso, guayaba en un mortero al que se le
adicionó 5 mL de
Tris/EDTA/NaCl. En los vegetales podemos
encontrar diversas enzimas, entre ellas, las
DNasas y RNasas (nucleasas) las cuales son
responsables de llevar a cabo la degradación
del DNA y RNA. Estas enzimas tienen como
cofactores a los iones Ca2+. Al agregar el
EDTA, las nucleasas se quedan sin Ca2+ ya
que esta solución es un agente quelante
(“secuestra” cationes), por lo que se detiene la
degradación ya que actúa como un inhibidor. El
NaCl es una solución salina isotónica, la cual
ayuda en el desgarramiento de las membranas
celulares. Y el Tris es un amortiguador por lo
que mantiene a nuestra muestra en un pH de
8.5. En este valor de pH, el DNA se mantiene
con carga negativa al igual que lo estaría a pH
fisiológico.
Pasados 5 min de trituración se agregó 0.3 mL
de amilasa con el objetivo de degradar los
polisacáridos presentes, como el almidón. La
amilosa se degrada ya que cuenta con enlaces
α-1,4 pero la celulosa no, pues presenta
enlaces β-1,4. Para este proceso de dejó
incubar la muestra 10 min a temperatura
ambiente
Posteriormente se adiciona 15 mL de una
solución saturada de NaCl la cual desnaturaliza
las proteínas por efecto “Salting Out” y 5 mL de
SDS al 10% el cual es un detergente que causa
la degradación de membranas plasmáticas,
entre ellas la de los organelos de las células
(mitocondria, aparato de Golgi, retículo
endoplasmático, etc.) por la trituración
realizada anteriormente. Se realizó la trituración
con los dos últimos reactivos mencionados
durante 5 min.
Concluido los 5 min se traspasó el
homogeneizado a un tubo Falcon el cual se
llevó a centrifugación para eliminar proteínas,
restos celulares y otras moléculas que hayan
precipitado. El DNA se mantiene estructurado
300 0.32
debido a la unión por interacciones con las
histonas (histidina la cual posee cargas
positivas). Posteriormente con los resultados obtenidos
Después de la centrifugación, al sobrenadante con el espectrofotómetro se realizó una gráfica,
se le adicionó 15 mL de la mezcla cloroformo: Absorbancia vs Longitud de onda (Gráfica 1).
alcohol isoamílico (24:1) con el fin de disminuir Gráfica 1. Absorbancia vs Longitud de onda
la constante dieléctrica del medio y provocar la Anexada al final del reporte.
precipitación de las histonas, pero no del DNA.
Además de que el alcohol isoamílico atrajo a A su vez se calculó la pureza del extracto del
los lípidos para lograr su separación. La DNA de guayaba así como la concentración en
posterior agitación se realizó para separar las la que se encontraba.
histonas del DNA. Pureza:
Se realizó una segunda centrifugación a 4000
rpm por 10 min, donde el sobrenadante se 𝐴𝑏𝑠260𝑛𝑚
recuperó y traspasó a un frasco con 30mL de 𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 =
alcohol 96° frío. La temperatura baja permitió 𝐴𝑏𝑠280𝑛𝑚
una rápida precipitación del ADN. De esta
segunda precipitación se obtuvo DNA, RNA y
almidón.
0.120
𝑃𝑢𝑟𝑒𝑧𝑎 = = 2.18
Resultados
0.055
Por medio de un espectrofotómetro se logró
Concentración:
obtener las siguientes absorbancias del DNA
de una guayaba:
[𝐷𝑁𝐴]
Tabla 1. Resultados del espectrofotómetro
𝐴𝑏𝑠260𝑛𝑚
Longitud de onda (nm) Absorbancia =
22500(𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛)
230 0.023

240 0.063
0.120
250 0.072 [𝐷𝑁𝐴] =
22500(30)
260 0.120

270 0.063 [𝐷𝑁𝐴] = 1.7𝑥10−7 𝑔/𝑚𝐿

280 0.55
Por su parte,por cromatografía en placa fina se
290 0.40 identificaron las bases púricas y pirimidínicas
de DNApool (D) y RNApool (R), comparadas
con muestras puras de Adenina (A), Timina (T),
Citosina (C), Guanina (G) y Uracilo (U).(Imagen
1)
 Muestra Rf Muestra Rf

Adenina 0.595 Citosina 0.473

(DNApool)

Guanina 0.541 Timina 0.770

(DNApool)

Citosina 0.486 Adenina 0.577

(RNApool)

Timina 0.747 Guanina

(RNApool)
-
Uracilo 0.685 Citosina 0.456
(RNApool)

Adenina 0.595 Uracilo

(DNApool) (RNApool)
-
D A G C T U
Guanina 0.527
R (DNApool)
Imagen 1. Cromatograma obtenido

Dicho cromatograma obtenido, se Análisis de resultados

comparó con el cromatograma En el caso del DNA aislado de una guayaba, se
de otro equipo, pero con pudo observar que efectivamente el punto más
DNAhidrolizado (DH) y alto de absorbancia (0.120) corresponde a la
RNAhidrolizado (RH). (Imagen 2) longitud de onda de 260nm, debido a que en
este punto el DNA (las bases) tiene un máximo
de absorción de la luz UV, mientras que a
280nm algunas proteínas absorben la luz UV
cuantificando se con una absorbancia de 0.055.
Por otra parte al calcular la pureza, se pudo
observar que rebasa por 0.1 el intervalo
aceptable (1.8-2) debiéndose posiblemente a
que alguna impureza (estructura de la célula
diferente al DNA) no se eliminó correctamente
al momento de extraer el DNA o posiblemente
al momento extracción del DNA del frasco con
alcohol, se pudo tomar de más alguna proteína.
Por su parte gracias a la cromatografía en
placa fina se pudo observar y comparar la
DH presencia de Adenina, Guanina, Citosina,
Timina y Uracilo, correspondientemente,en las
RH
soluciones de DNA y RNA proporcionadas, en
Imagen 2. Cromatograma de otro equipo estas soluciones coinciden o difieren por
mínimas cantidades con las mismas bases
Se calcularon los RF’s de cada base pura y la puras, aseverando esta respuesta gracias a los
base en la muestra de DNA y RNA. rf’s calculados.

Tabla 2. RF’s
A su vez se pudo observar la diferencia entre
ADN y ARN hidrolizado y ADN y ARN pool, en
este caso las soluciones que se encuentran
hidrolizadas presentan más impurezas debido a
que al momento de realizar un hidrolizado, la
mayoría de los enlaces se rompen sin distinguir
el compuesto, por lo que lo hace más
inespecífico, por su parte el pool, es una
mezcla de las bases, estando puras y sin
“impurezas” por lo que las manchas
presentadas en la cromatografía se ven mucho
más definidas. Sin embargo el RNApool
presentó impurezas esto debiéndose
posiblemente, a la gran cantidad de usos que
ha tenido en los diferentes grupos, así que
posiblemente en el transcurso de estas se llegó
a contaminar.

Conclusiones
● Se aisló de forma correcta DNA de
guayaba, presentando algunas
impurezas y obteniendo una
concentración de 1.7x10-7.
● Se identificó la presencia de Adenina,
Guanina, Citosina y Timina en DNA.
● Se identificó la presencia de Adenina,
Guanina, Citosina y Uracilo en RNA,

Bibliografía:
1. Nelson D.L., Cox M.M.. (2015).
Lehninger Principios de bioquímica.
Editorial Omega. sexta edición.
Pag:281-283.