REVISIÓN DE: “AIDS Patient Death Caused by Novel Cryptococcus neoformans × C. gattii Hybrid”.

Informe
Unidad 3: Laboratorio de Biotecnología

REVISIÓN DE: “AIDS Patient Death Caused by Novel Cryptococcus neoformans × C. gattii
Hybrid”

Juan David Villada1 – Laura María Vivas2

1
Estudiante de Octavo semestre de Química Farmacéutica y Química con concentración en Bioquímica,
Universidad Icesi. 2 Estudiante de octavo semestre en Química Farmacéutica, Universidad Icesi

Resumen

La diversidad genética se puede definir como la cantidad de características a nivel genético

pertenecientes a cada especie. Sin esta diversidad los organismos no podrían adaptarse a los cambios y
exigencias ambientales, llevando a su desaparición. En otras palabras, sin diversidad genética los
organismos son más propensos a desaparecer.

Hay diferentes maneras de determinar la diversidad genética, una de ellas es mediante la utilización de
marcadores moleculares. Estas herramientas, que se han desarrollado gracias al avance de la biología
molecular, son de gran utilidad gracias a su alta sensibilidad, capaz de detectar variaciones a nivel del
ADN.

Uno de las técnicas que permite analizar los marcadores moleculares es la AFLP, nombrado así por las
siglas en inglés de Amplificación de Fragmentos Polimórficos. En otras palabras, AFLP son fragmentos
de ADN que han sido amplificados empleando primers de genoma digerido. Esta técnica tiene una
amplia capacidad para detectar polimorfismos, además de ofrecer resultados relativamente rápido, una
ventaja invaluable.

Este es el caso que se trata en el artículo revisado, en el cual emplean AFLP aprovechando la diversidad
genética para identificar la especie del hongo que ha ocasionado la muerte a pacientes con SIDA en
Canadá. Se pudo constatar en este estudio, por medio de esta técnica que el agente etiológico causante
de estas muertes era un híbrido entre Cryptococcus neoformans y C. gattii.

Introducción

La diversidad genética tiene un alto impacto en la biodiversidad. Antiguamente la biodiversidad se

caracterizaba mediante el seguimiento de rasgos morfológicos, sin embargo estas características no
presentaban una fiel descripción de la variabilidad entre individuos, ya que, algunas diferencias no son
fácilmente observables o sólo aparecen bajo ciertas condiciones ambientales (Somasundaram &
Kalaiselvam).

Debido a la problemática que se presentaba, se han desarrollado técnicas que, aprovechando los
diferentes marcadores genéticos, permiten evaluar la variabilidad genética; y por ende, la biodiversidad.
Estas herramientas moleculares brindan información sobre las variaciones en el ADN de los individuos,

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se puede diferenciar entre géneros, especies e incluso individuos de una misma especie, dependiendo de
la sensibilidad de la técnica empleada (Somasundaram & Kalaiselvam).

Existen una gran cantidad de este tipo de técnicas, las cuál van a variar según el tipo de material que se
necesite y de la información que aporta, es por ello que los investigadores se planteen bien el objetivo de
sus estudios para así lograr escoger la más adecuada.

Como ya se mencionó, estas nuevas técnicas que evalúan la variabilidad genética, se fundamentan en la
identificación de marcadores moleculares, los cuales son genes o simplemente segmentos de ADN que
no se conoce que codifiquen y que pertenecen a determinado genotipo y por ende son útiles para la
identificación de biodiversidad. Algunas de estas técnicas son:

 RFLP (polimorfismo en la longitud de restricción): debido a mutaciones, los segmentos de corte

de las enzimas de restricción varían de un individuo a otro, creando polimorfismos que al ser
digeridos por enzimas de restricción tendrán diferentes tamaños, los cuales podrán ser
diferenciados en una electroforesis y así determinar la variabilidad genética (Laboratorio de
Biotecnología, 2011).
 RAPD (Amplificación al azar de ADN polimórfico): consiste en emplear cebadores de pequeño
tamaño para que amplifiquen, mediante PCR, fragmentos al azar del genoma de interés y
posteriormente observarlos gracias a la electroforesis y así poder determinar diferencias
(Laboratorio de Biotecnología, 2011).
 AFLP (Amplificación de Fragmentos polimórficos): en esta técnica el ADN de interés es
digerido por enzimas de restricción y posteriormente estos segmentos son amplificados
utilizando adaptadores que se unen a los extremos cortados y que van a permitir la unión de
primers para que se pueda llevar a cabo la PCR. La ventaja de esta herramienta es que puede
brindar información sobre un genoma completo (Laboratorio de Biotecnología, 2011).

En el artículo revisado, se empleó la técnica de AFLP, la cual su principal ventaja es que puede generar
una gran cantidad de polimorfismos. Lo anterior permite que esta técnica sea capaz de diferenciar entre
individuos y por ello es ampliamente empleada para realizar pruebas de paternidad, estudios de flujo
genético; además, no se necesita realizar secuenciación, la PCR es rápida, lo que lo hace un método
sencillo y económico (Somasundaram & Kalaiselvam).

La amplificación selectiva de los fragmentos polimórficos se obtiene empleando cebadores que se

pueden extender sobre los segmentos de restricción. De esta manera sólo se amplificarán aquellos
fragmentos a los que se hayan acoplado estos cebadores, los cuales están diseñados para coincidir con
los nucleótidos de los segmentos de restricción. Esta técnica permite que se realice un amplificación
simultánea de varios fragmentos de restricción específicos (Vos, y otros, 1995).

En el artículo que se revisó, se muestra una importante aplicación de la AFLP, la cual resulta de gran
utilidad al momento de identificar y caracterizar el organismo patógeno que está causando la muerte a
enfermos de SIDA en Canadá. Como bien se sabe la inmunodeficiencia de estos pacientes facilita que
microorganismos, que no son comunes en los seres humanos, puedan proliferar y colonizar a estas
personas.

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Materiales y métodos

Obtención y determinación de ploidía y serotipo de la Cepa CBS10496

La cepa CBS10496 fue aislada de un paciente con SIDA, en Montreal, Quebec, Canadá. La ploidía fue
determinada por citometría diferencial. Para esto, se usaron como referencia las cepas haploides
CBS8710 y CBS10510. Los núcleos fueron visualizados con el colorante 4’,6 diamidino-2-fenilindol.
La coloración de las colonias que crecieron en el medio canavanine-glycinebromotimol fue determinada
después de una incubación a 24°C por 6 y 15 días. El serotipo de CBS10496 se determinó usando el kit
de serotipificación CryptoCheck (Latron Laboratories, Tokio, Japón). Para identificar el pareo de la cepa
se realizaron PCR específicos; uno con primers MATα y MATα Serotipo A, MATa y MATa serotipo A,
y MATa y MATa Serotipo B (Bovers M. , y otros, 2008).

AFLP

Diez colonias de CBS10496 fueron usadas para la extracción de DNA. El ADN de estas colonias fue
utilizada para un estudio de amplificación de fragmentos polimórficos (AFLP). La secuencia parcial de
6 regiones nucleares fue seleccionada para las cepas de referencia aisladas CBS10488-CBS104890,
CBS1622, CBS6992 y el híbrido aislado CBS10496. Estas secuencias son, el espaciador transcrito
interno (ITS), una región espaciadora intergénica, la secuencia de la enzima Laccasa (CNLAC1), 2
secuencias de subunidades de la RNA polimerasas II (RPB1 y RPB2) y el factor de traducción y
elongación factor 1α (TEF1α) (Bovers M. , y otros, 2008).

Resultados

El contenido del ADN de la cepa hibrida CBS10496 fue comprada por citometría de flujo con las cepas
haploides CBS8710 y CBS10510. Como se observa en el anexo 1, el pico G1 de la cepa hibrida consiste
con el pico G2 de las cepas haploides, lo que permite deducir que esta nueva cepa posee
aproximadamente el doble de cantidad de ADN que las haploides indicando que ésta es diploide o
aneuploide. Además, la coloración con 4’,6-diamidino-2-fenilindol indica que la cepa CBS10496 es
monocariótica (Bovers M. , y otros, 2008).

La coloración negativa de la cepa CBS10496 en medio CGB indica que ésta corresponde a la especie
C.neoformans. El kit de serotipo mostró aglutinación en el factor 5 y 7, los cuales corresponden a los
serotipos B y A, respectivamente; indicando que la cepa posee el serotipo AB. El PCR específico solo
mostró resultados para el pareo MATα serotipo A, lo que indica que el híbrido posee o está compuesto
de una cepa con este pareo. Se esperaba encontrar en la cepa hibrida otra secuencia con el pareo
contrario (MATa Serotipo B), sin embargo, éste no se obtuvo, lo que muestra que en la hibridación se
perdió este alelo, es decir que se presentó aneuploidía (Bovers M. , y otros, 2008).

La huella de AFLP de la cepa CBS10496 no concordó con ninguna de las cepas de referencia: CBS8710
y CBS9172 pertenecientes a AFLP1/VNI y CBS10510 que son AFLP4/VGI. La huella de AFLP de la
cepa de estudio mostró fragmentos de ambas huellas (AFLP1/VNI y AFLP4/VGI). La huella
AFLP1/VNI corresponde a la especie C. neoformans var. Grubii y la de AFLP4/VGI a la especie C.

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gattii. Es importante mencionar que durante el experimento solo se encontró un alelo de las secuencias
seleccionadas (ITS y TEF1α), lo que demuestra la pérdida de material genético. El estudio también
encontró que el C. gattii parental tiene el serotipo AB, lo que resulta común de todos los otros híbridos
reportados de estas 2 especies. Esto indica una preferencia de este subgrupo a formar estos híbridos
(Bovers M. , y otros, 2008) .

Discusión

El principal hallazgo del artículo revisado fue el descubrimiento de un nuevo híbrido entre Cryptococcus
neoformans × C. gattii, el cual no había sido reportado en la bibliografía anteriormente cuando se
realizaron estudios completos de estos organismos (Bovers M. , Hagen, Kuramae, & Díaz, 2006). Este
nuevo híbrido presentaba rasgos de las huellas AFLP de ambas especies (C. neoformans y C. gatti),
además se perdía un alelo y su serotipo era AB, lo que confirma que se trata de un híbrido, no descrito,
entre estos dos hongos (Bovers M. , y otros, 2008).

Este hallazgo fue descubierto gracias a la utilización de la técnica AFLP. Este método ha sido
ampliamente empleado para la genotipificación de bacterias, plantas, hongos y animales, también se
utiliza para crear mapas genéticos. El gran número de bandas que genera el AFLP, comparado con
técnicas como RAPD, muestra la lata sensibilidad del método y por ende su gran aplicabilidad en la
diferenciación de cepas genéticamente relacionadas. Esta caracterización de especies resulta de gran
importancia porque permite identificar la virulencia, resistencia y patogenicidad de las mismas, lo que
podría llevar al desarrollo y mejora de los tratamientos para las enfermedades causadas por estos agentes
patógenos (Boekhout, y otros, 2001). Por tal motivo, se considera que AFLP es método idóneo para la
identificación de estas especies, en otras palabras, que la metodología realizada en el artículo revisado
fue asertiva y oportuna con los objetivos del mismo.

La hibridación es un fenómeno muy común en los hongos debido a que esto representa una ventaja
biológica para ellos. Por ejemplo los híbridos entre las dos especies mencionadas pueden resultar en
organismos superpatógenos, debido a que se presenta duplicación en sus genes y esto les permite
desarrollar nuevas funciones que los hace más capacitados para afrontar cualquier condición ambiental.
Lo anterior se demostró en un estudio con Sacharomyces cerevisiae en el cual se encontraron genes con
funciones diferentes a los de sus genes ancestrales (Kellis, Bruce, Birrem, & Lander, 2004).

Las dos especies formadoras del híbrido estudiado pueden causar meningoencefalitis, la diferencia es
que C. neoformans puede encontrarse alrededor del mundo, mientras que C. gattii es predominante en
regiones tropicales. Sin embargo, recientemente se han encontrado brotes de C. gattii en climas
templados como Canadá, Italia, Grecia y España. Por un lado C. neoformans se considera como un
agente patógeno, ya que sólo infecta personas inmunocomprometidas; mientras que C. gattii sí puede
infectar personas sanas (Speed & Dunt, 1995).

El descubrimiento de este nuevo híbrido es muy importante debido a que luego de identificado se puede
considerar el desarrollo de una terapia que ataque específicamente este patógeno aprovechando la
información nueva que se ha obtenido de él y de ésta manera prevenir las muertes que éste puede causar
en pacientes inmunosuprimidos. Además no se puede descartar que este superpatógeno pueda infectar

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personas sanas, debido a que uno de sus parentales es capaz de infectar personas con su sistema inmune
en condiciones normales.

Bibliografía

Boekhout, T., Theelen, B., Días, M., Fell, J., Hop, W., Abeln, E., y otros. (2001). Hybrid gnotypes in the
pathogenic yeast Cryptococcus neoformans. Microbiology, 147(4), 891-907.

Bovers, M., Hagen, F., Kuramae, E., & Díaz, M. (2006). Unique hybrids between the fungal pathogens
Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gatti. FEMS. Yeast Research, 6(4), 599-607.

Bovers, M., Hagen, F., Kuramae, E., Hoogveld, H., Dromer, F., St-Germain, G., y otros. (2008). AIDS
Patient Death Caused by Novel Cryptococcus neoformans × C. gattii Hybrid. Emerging
Infectious Diseases, 14(7), 1105-1108.

Kellis, M., Bruce, W., Birrem, W., & Lander, E. (2004). Proof and evolution analysis of ancient genome
duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Nature, 428, 617-624.

Laboratorio de Biotecnología. (2011). Unidad 3: Otros marcadores genéticos y moleculares. Laboratorio

2: Uso de otras secuencias de ADN para estudios filogenéticos taxonómicos, contaminación
ambiental, regiones génicas e interintergénicas nucleares, mitocondrial y cloroplástica. En L. F.
Fory (Ed.). Cali: Universidad Icesi.

Somasundaram, S., & Kalaiselvam, M. (s.f.). Molecular Tools for Assessing Genetic Diversity.
Annamalai Nagar: Centre of Advanced Study in Marine Biology.

Speed, B., & Dunt, D. (1995). Clinical and host differences between infections with the two varieties of
Cryptococcus neoformans. Clin Infect Dis, 21, 28-34.

Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, T. v., Hornes, M., Friters, A., y otros. (1995). AFLP: a new
technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, Oxford Journals, 23(21), 4407-4414.

Villada, J.D.; Vivas, L.M. Página 5

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Anexo 1

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