MEMORIA DE

PRÁCTICAS
MICROBIOLOGÍA

Elena Merino Pérez

1º Biotecnología

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 ÍNDICE

Sesión 1…………………………………………………………………………………………3-8

- Bacterias……………………………………………………………………….…….3-5
- Hongos filamentosos……………………………………………………………5-8

Sesión 2…………………………………………………………………………………………9-11

- Cálculo tiempo de generación………………………………………………….9-10

- Estudio de viabilidad en levaduras…………………………………………..10-11

Sesión 3………………………………………………………………………………………….12

- Tinción de microrganismos……………………………………………………...12

Sesión 4 y 5………………………………………………………………………………….13-15

- Pruebas bioquímicas………………………………………………………………..13
- Antibiograma……………………………………………………………………………14
- Fermentación de azúcares por levaduras..…………………………..…..14
- Estudio de hongos filamentosos………………………………………..……..15

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 Sesión 1: 18 febrero

Prácticas 1, 2 y 3
BACTERIAS

Bacilos subtilis

Bacteria Gram positiva aeróbica comúnmente encontrada en el suelo. Tiene la

habilidad para formar una resistente endospora protectora, permitiendo al
organismo tolerar condiciones ambientalmente extremas.

Recientemente, un grupo de investigadores españoles han descubierto que es

capaz de liberar al medio numerosas copias de su genoma de una forma
específica y no relacionada con la ruptura de la célula, lo que nos lleva a pensar
que este fenómeno tiene una función importante para la bacteria. Este
fenómeno se relaciona con la capacidad de captar e integrar en el propio
cromosoma de la bacteria un material genético externo. Así, en este caso
concreto, la función del ADN extracelular está relacionada con el intercambio
genético horizontal entre bacterias, es decir entre individuos de la misma
generación (no de padre a hijo).

No se trata de un patógeno humano pero sí puede contaminar los alimentos.

Se utiliza como fungicida para semillas de flores y de productos agrícolas, como

de algodón, hortalizas, soja.. La bacteria coloniza el sistema radicular de la
planta en desarrollo y por lo tanto compite con determinados organismos de la
enfermedad por hongos. También se emplea como agente biológico del control.

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Escherichia coli

Bacteria Gram-negativa, tienen forma de barra y pertenecen a la familia

Enterobacteriaceae. Es anaeróbico facultativo, móvil por flagelos
peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas y es capaz de
fermentar la glucosa y la lactosa.

Se trata de una bacteria con diversas variantes. Normalmente vive en el

intestino del hombre y de los animales formando parte de la flora
intestinal y ayudando así a la absorción de nutrientes. Sin embargo,
algunas cepas por intercambio de material genético, han adquirido la
capacidad de causar infecciones y provocar diarreas sangrantes.

También es la causa más frecuente de infección urinaria y, en menor

medida, de otras infecciones como meningitis en el neonato o infecciones
respiratorias. Las cepas de Escherichia coli patógeno entérico, y en
particular los EPEC son la causa principal de diarrea en los países pobres, y
llevan a la muerte de cerca de un millón de niños por año.

Klebsiella pneumoniae

Especie del género bacteriano Klebsiella, compuesto por bacterias

gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae, que desempeñan un
importante papel como causa de las enfermedades infecciosas
oportunista. La bacteria se encapsula, es decir, una capa de polisacárido
está presente fuera de la pared celular de la bacteria. Se puede sintetizar
ATP por la respiración aeróbica, pero también puede conmutar en una
fermentación anaeróbica para obtener energía. Por lo tanto, es un

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anaerobio facultativo, y tiene una característica de ser tanto aeróbica
como anaeróbica, dependiendo de la situación.

Causa neumonía en los seres humanos y otras infecciones en las zonas

intra abdominales y el tracto urinario. Es la segunda más patógeno
virulento, al lado de E. coli, que causa infección del tracto urinario.
Normalmente afecta a las personas con el sistema inmunológico bajo.

Pseudomonas fluorescens

Son bacterias gram-negativas con forma de bastón, que necesitan oxígeno

para vivir. En uno de sus extremos tienen varios flagelos, que son como
pelos que les permiten moverse por el suelo. Son conocidas por su
capacidad de estimular el crecimiento de las plantas que viven en
contacto con ellas produciendo antibióticos. Estos evitan que la planta se
enferme por la presencia de otras bacterias u hongos patógenos. Cuando
están presentes, las bacterias Pseudomonas fluorescens compiten con
estos patógenos e impiden su crecimiento. También tienen la capacidad
de acelerar la germinación y crecimiento de las plantas a través
hormonas, así como eliminar sustancias contaminantes del suelo y agua.

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 HONGOS FILAMENTOSOS

Botrytis cinerea

Hongo patógeno de muchas especies vegetales, animales y bacterias que

causa la enfermedad conocida como moho gris. Entre sus hospedadores
se incluyen una enorme variedad de plantas ornamentales, frutales y
verduras y hortalizas. La enfermedad puede afectar a frutos, flores, tallos,
semillas… Suelen ser los cultivos de vid los más perjudicados

En el ciclo de infección las esporas de B. cinerea pueden ser producidas

sobre cualquier material vegetal y transportadas grandes distancias por
corrientes de aire. Sobrevive como saprófito en restos vegetales. Sobre el
tejido infectado el patógeno produce una nueva generación de esporas
que pueden iniciar un nuevo ciclo de infección

Penicillium notatum

Pertenece a la clase de los Ascomicetos o Euascomycetes, hongos muy

variados ya que, pueden ser tanto unicelulares como pluricelulares.

Fue descubierto por Fleming, quien aisló la cepa de Penicillium notatum y

vio que producía 2 mg de penicilina por cada litro de cultivo.
Posteriormente se encontró que otros Penicillium eran mejores
productores de penicilina y se eligió a Penicillium chrysogenum como cepa
productora de este antibiótico.

Gracias a ella se salvó a la población mundial de pestes y enfermedades

tan epidémicas como la sífilis, la tuberculosis, entre otras, atacando

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agentes patógenos como el gonococo que produce la gonorrea y a
bacterias causantes de la meningitis.

Aspergillus niger

Hongo que produce un moho negro en vegetales -muy común en la

lechuga, el tomate o la acelga. Se ubican dentro de la división Ascomycota.
Son organismos heterotálicos y la unión de hifas de sexo diferente origina
la formación de ascas que contienen ascospora. Los hongos de este
género, tienen gran potencial biótico y son degradadores activos del
material orgánico y en consecuencia muy útiles en la ecología del planeta.
Sin embargo, causan enfermedades en el humano y animales por
diferentes mecanismos.

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Saccharamyces cerevisiae

Tipo de levadura, hongo unicelular, utilizado industrialmente en la

fabricación de pan, cerveza y vino. Las levaduras se reproducciones de
forma asexual por gemación, aunque en condiciones muy extremas puede
hacerlo sexualmente. Tiene una complejidad algo superior que la de la
bacteria, y además es un organismo eucariota. No es patógeno, con lo cual
se puede manipular sin tener que utilizar grandes precauciones.

Las utilidades industriales más importantes son la producción de cerveza,

pan y vino gracias a su capacidad de generar dióxido de carbono y etanol
durante el proceso de fermentación, en presencia de azúcares.

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Sesión 2: 25 febrero

Prácticas 3b, 5 y 6

CÁLCULO TIEMPO DE GENERACIÓN

El tiempo de generación celular se define como el intervalo de tiempo existente entre
el comienzo de dos divisiones consecutivas de una célula. Es el período de tiempo que
requieren las células de una población microbiana para crecer, dividirse, y dar lugar a
dos nuevas células por cada una de las que existían anteriormente.

Para medir el crecimiento vamos a utilizar un método directo que consiste en contar el
número de células que hay en un volumen determinado. Para ello, necesitamos una
cámara Neubauer.

Primeramente calculamos la concentración de muestra inicial de levadura

Saccharomyces cerevisiae. Las condiciones a las que se encuentra son temperatura de
30 ºC, medio YPD y 280 rpm. Tomamos un pequeño volumen para su recuento en
cámara Neubauer y lo añadimos a la cámara, entre ésta y el cubreobjetos. A través del
microscopio, realizamos un recuento.

La cámara consta de una cuadrícula formada por un cuadrado central y cuatro en los
vértices de 1 mm de lado cada uno de ellos. El central está divido de 25 cuadrados y a
su vez subdividido en 16 cuadraditos. Los de los vértices, que son los que vamos a
utilizar, están divididos en 16 cuadrados.

Contamos el número de células que hay en los 4 cuadrados que forman parte de la
diagonal para hacer la media de los 16.

Cuadrantes Nº de células
1 10
2 7
3 5
4 3

Nota: Las levaduras que estaban dividiéndose las hemos contado como 1, de igual
manera que las que se encontraban entre dos cuadrados. Además la muestra elegida
tenia una dilución de 10^-1 realizada previamente (100 µL de muestra y 100 µl de
H20).

El total de células contadas es de 25. Haciendo a media, (25*16)/4=100 levaduras.

La concentración de muestra inicial es

No: 100 * 10^4 * 10 = 10^7 celulas/mL

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Una vez que tenemos la concentración de muestra inicial, tomamos un pequeño
volumen del cultivo inoculado que habíamos dejado en crecimiento y de nuevo
realizamos el recuento. Previamente se realiza una dilución para que la muestra sea
10^-1 como la anterior. El tiempo transcurrido ha sido de 2 horas y 10 minutos (140
minutos).

De nuevo contamos las levaduras de los cuadrados que componen la diagonal:

Cuadrante Nº levaduras
1 3
2 2
3 3
4 9

El total de células es de 17, haciendo la media (17*16)/4= 68

La concentración de muestra final es

Nf= 68 * 10^4 * 10 = 6,8*10^6

Con los datos obtenidos calculamos el tiempo de generación (TG)

TG= tiempo transcurrido / NG= 140 / -0,556 = -251,62

NG= (logNf – logNo) / log2= -0,556

El resultado debe de dar positivo, ya que es imposible que el número de células

disminuya de No a Nf, por lo que probablemente haya habido un error de cálculo.

ESTUDIO DE VIABILIDAD EN LEVADURAS

Para medir el número de células viables de levaduras presentes en una muestra

utilizamos el Método del Azul de Metileno basado en unas enzimas que degradan el
azul de metileno. Así, las células muertas se tiñen, mientras que las vivas que son
activas lo degradan, y se quedan sin color.

Hacemos una dilución 10^-1 tomando 100 µl de la muestra y 900 µl de H2O. Después
añadimos 1 ml de azul de metileno y agitamos unos 10 minutos. Después, realizamos
el recuento en una cámara Neubauer.

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Cuadrantes Células vivas Muertas Totales
1 13 0 13
2 23 0 23
3 9 2 11
4 14 1 15

Media células vivas: (29*16)/4 = 236

Media células totales: (62*16)/4 = 248

236 * 10^4 * 10 * 2 = 4.72*10^7 nº células vivas/ml

248 * 10^4 * 10 * 2 = 4,96*10^7 nº células totales/ml

%viabilidad = (4,72*10^7 / 4,96*10^7) * 100 = 95,16 %

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Sesión 3: 18 marzo

Práctica 4
TINCIÓN DE MICROORGANISMOS

C) Tinción diferencial de Gram con las muestras de bacterias y las muestras aisladas
en la práctica 3:

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens y 4

bacterias aisladas en la tierra. En la tinción Gram, clasificamos a las bacterias en gram-
positivas o gram-negativas en función de la pared celular. Así, las gram-positivas se
tiñen de color violeta, debido a que tienen la pared de peptidoglucanos gruesa,
mientras que las otras se tiñen de color rosa ya que su pared es más fina y tiene una
alta proporción de lípidos típicos que la hacen muy impermeable y que no retenga el
colorante.

Bacteria Gram-positiva Gram-negativa

Tierra 1 Si
Tierra 2 Si
Tierra 3 Si
Tierra 4 Si
E. coli Si
K. pneumoniae Si
B. subtillis Si
P. fluorescens Si

B) Tinción simple de hongos filamentosos y levaduras con azul de metileno:

Botrytis cinerea, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Penicillium notatum

En todos los microrganismos se han observado esporas. Solo en el S. cerevisiae hemos

visto hifas.

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Sesión 4 y 5: 1 y 8 abril

Prácticas 7, 8, 9 y 11

Observación de las bacterias que se han cultivado en las prácticas 7,8, 9 y 11. Se ha
trabajado con 8 bacterias, 4 conocidas y 4 desconocidas, con dos levaduras y 3
antibioticos.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Las bacterias se han cultivado en amilasa, celulasa, agar leche, McConkey y TSI.
Observando los cambios que han realizado en el medio donde se ha cultivado,
podemos clasificarlas y conocer sus actividades metabólicas.

Género Catalasa Amilasa Celulasa Leche McConkey

B. subtilis + + - + -
K. + - - - +
pneumoniae
E. coli + - + - -
P. + + - + -
fluorescens
1 - - -
2 - - -
3 + - -
4 + - -

La prueba en medio McConkey se utiliza para la detección de enterobacterias. La

aparición de colonias indica que pertenecen a este grupo. La E. coli es una
enterobacteria, con lo cual el resultado no es acertado. También lo es la K.
pneumoniae y la P. fluorescens.

TSI

Género Fermentación Fermentación No Producción Producción

glucosa lactosa fermentación gas ácido
azúcares sulhídrico
E. coli + - - No Si
B. subtilis - - + No Si
K. + + - No Si
pneumoniae
P. - - + No Si
fluorescens

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 ANTIBIOGRAMA
En la realización del antibiograma, hemos sembrado E. coli por toda la superficie (con
un algodón estéril). Después, se ha procedido a la colocación de 3 discos de
antibióticos sobre la placa: amoxicillin 30 mg, gentamicin 10 mg y chloramphenicol 50
mg. Observamos los resultados estudiando si es sensible o no al antibiótico y si así es el
radio del halo de inhibición. Los resultados obtenidos han sido que los 3 han formado
halos, pero de diferentes tamaños: siendo el de mayor la C50 y el de menor el CN10.

FERMENTACIÓN DE AZÚCARES POR LEVADURAS

Las pruebas se considerarán positivas cuando se observe burbujas de gas recogidas en
el interior de la campana Durham y cuando la coloración pase de púrpura a amarillo
debido al marcador de ph que tienen los medios de fermentación.

Género Glucosa Lactosa Sacarosa

S. cerevisae + - +
M. pulcherrima + - +

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 ESTUDIO DE HONGOS FILAMENTOSOS
Se han observado dos hongos: Aspergillus niger y Penicillium notatum.

En A. niger la presencia de filamentos y su color negro es lo más característico. En P.

notatum predomina la forma de racimos.

A. niger P. notatum

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