INTRODUCCION

De gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes grupos de

bacterias (Gram+ y Gram-), según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica
en la diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: las bacterias Gram+ tienen
una gruesa capa de peptidoglicano en su pared, mientras que las bacterias Gram- tienen
una capa de peptidoglicano más fina y una capa lipopolisacarídica externa. Tras la tinción
con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al
colorante sólo en las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda
retenido y las células permanecerán azules. Las células Gram (-) se teñirán después con
un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.
La tinción de Gram es un tipo de tinción empleado en microbiología para la visualización
de las bacterias, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram que desarrolló un
método de tinción en 1884. (PR, 2009)
Por más de una centuria las bacterias han sido clasificadas a la reacción de Gram, la
habilidad de retener un complejo de iodo violeta cuando se trata con un solvente orgánico
tal como el alcohol o la acetona, las bacterias Gram positivas retienen la tintura y aparecen
de color violeta, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener y se tiñen de color
rojo para ser vistas con el microscopio. (Adelberg, 2008)

I. OBJETIVOS:

 Utilización de técnicas sencillas para la observación de microorganismos

 Conocer o manejo del microscopio óptico para la observación de bacterias
(importancia del objetivo de inmersión)
 Reconocimiento de distintos modelos de pared bacteriana.

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 II. FUNDAMIENTO TEORICO
2.1. Tinción:
Es el proceso por el cual las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie.
El uso de colorantes permite cambiar el color de las células de los microorganismos
y poder realizar la observación en microscopio óptico. Dado que las bacterias son casi
incoloras, no presentan contraste con el medio en el cual se encuentran suspendidas y
no pueden observarse claramente sin algún tratamiento previo. De acuerdo a la
reacción que ocurre, existen diferentes tipos de tinción:
a) Tinción simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología
celular.

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 b) Tinción diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre
células bacterianas o entre partes de una misma célula. Estas técnicas utilizan más de
un colorante o bien ciertos reactivos complementarios para la tinción. Ejemplos:
Tinción de Gram, Tinción de Ziehl-Neelsen, etc.
2.2. Colorantes Los colorantes más utilizados: azul de metileno, cristal violeta,
safranina, son catiónicos y se combinan fuertemente con componentes celulares
cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos (las
envueltas externas de los microorganismos están por lo general cargadas
negativamente). (PR, 2009)
2.3. Tinción diferencial de Gram: Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo
danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la
tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y
gramnegativos (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver
con carga eléctrico, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de
bacterias). Descripta en forma breve, la secuencia de la tinción es la siguiente: el
Frotis fijado con calor se tiñe 1 min con Violeta Cristal, se lava con agua, se cubre
con solución Yodada durante 1 - 2 min. y se lava de nuevo con agua, decolorar con
mezcla alcohol etílico/acetona. Escurrir y cubrir con Safranina (color de contraste)
durante 1 – 2 min. Lavar y secar.
Las bacterias gram-positivas y gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las
diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la célula
bacteriana sirve para dar su tamaño y forma al organismo así como para prevenir la
lisis osmótica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el
peptidoglicano. La pared de la célula gram-positiva es gruesa y consiste en varias
capas interconectadas de peptidoglicano así como algo de ácido técnico.
Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula gram-positiva es peptidoglicano. La
pared de la célula gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más
delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior
compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la
pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. (Adelberg, 2008)

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 Descripción de la tinción de GRAM: Las células fijadas al calor sobre un
portaobjetos se tiñen, primero con una solución de cristal violeta (otros colorantes
básicos no son tan efectivos) y son lavadas después para quitar el exceso de colorante.
En este estado, todas las células, tanto las grampositivas como las gramnegativos,
están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solución de yodo-
yoduro potásico. El ingrediente activo es aquí el I2; el KI simplemente hace soluble
el I2 en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el
cristal violeta. De nuevo tanto las células grampositivas como las gramnegativos se
encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la decoloración, usando
una mezcla de alcohol-acetona, sustancias en las que es soluble el complejo I2-cristal
violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se decoloran, mientras que otros
(gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de células está
por tanto en su resistencia a la decoloración; esta resistencia se debe probablemente
al hecho de que en el caso de bacterias gram-negativas, la mezcla de alcohol/acetona
es un solvente lipídico y disuelve la membrana exterior de la pared de la célula (y
también puede dañar la membrana citoplásmica a la que se une peptidoglicano). La
delgada capa de peptidoglicano es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-
yodo y la célula se decolora. Las células grampositivas, a causa de sus paredes
celulares más espesas (tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables
al disolvente, provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado
dentro de la pared celular. Después de la decoloración las células grampositivas son

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 todavía azules, pero las gramnegativos son incoloras. Para poner de manifiesto las
células gramnegativos se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la coloración
de contraste las células gramnegativos son rojas, mientras que las grampositivas
permanecen azules.

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 III. MATERIALES Y METODOS
3.1. Materiales
 Placa Petri
 Asa bacteriológica
 Tubos de ensayo
 Vaso de vidrio
 Mechero de bunsen
 Lujol
 Safranina
 Cristal violeta
 Agua oxigenada
 Ron de quemar
 Porta objeto y cubre objeto

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 3.2. Los Métodos.

 Primero paso: utilizar la

placa Petri con el asa
bacteriológica.

 Segundo paso: empezamos por el cultivo de

microorganismos por superficie

 Sacamos un poco del agar y lo

mezclamos con el agua destilada para
poder de ahí sacar un poco de muestra
y poner en la porta objeto.

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  Pasó tres: Al poner en el porta
objeto unas cuantas gotas y hacerlo
secar echamos sobre la muestra el
cristal de violeta.

 Paso cuatro: Tercero ya al echar

el cristal de violeta esperamos en
dos minutos y luego pasamos con
un chorro de agua lento a
enjuagar

 Paso Cinco: Al pasar los un

minutos lo enjuagamos con
alcohol acetona.

 Paso seis: Echamos el lugol en la

muestra y esperamos que pase 30s
y lo enjuagamos

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  Paso siete: Por último echamos el
colorante de contraste y lo
hacemos secar en el mechero de
alcohol para llevar al
microscopio

 Pasó ocho: Por último paso

llevamos al microscopio y
observamos.

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 IV. RESULTADOS
 Primeramente se terminó de aprender y conocer: la tercera técnica de siembra, que
es por estría.

TÉCNICA DE SIEMBRA POR

ESTRIA

Es usada para aislar cepas puras en una placa Petri a partir de un

inóculo o muestra con diferentes especies. La técnica consiste en,
mediante un asa de siembra previamente esterilizada, rayar la
superficie de cultivo de una placa Petri de forma que en cada pasada
sea menor el número de células depositado, las últimas pasadas
deberán depositar un número tan bajo de células que, una vez
incubadas, se formen colonias puras.

 Después de haber aprendido la técnica de siembra, se aprendió hacer coloraciones

Gram por lo cual se obtuvo las siguientes imágenes:

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 V. DISCOSIONES
 La dictaminarían que dé el químico al dar los resultados sobre un estudio de
Gram positiva o negativa es realmente importante para el diagnóstico y buen
tratamiento de la patología relacionada microorganismos es necesario saber
cómo influyen en las manifestaciones clínicas las diferencias existentes entre
la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas en su
detección y en el tratamiento. Porque existen componentes de la pared celular
que contribuyen a la virulencia delas bacterias protegiéndolas de las respuestas
inmunitarias. En el laboratorio se desearía eliminar de forma selectiva las
bacterias Gram positivas de una mezcla de bacterias Gram positivas y Gram
negativas.
 La tinción de Gram no es una prueba fiable de tinción de bacterias en medios
de cultivo con escasos nutrientes (p. ej., cultivos viejos o en fase estacionaria)
o tratados con antibióticos debido a la degradación del peptidoglicano por parte
de estos fármacos.

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 VI. CONCLUSIONES
Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren
mucho químicamente esta diferencia química es los que permite distinguir las
bacterias por Tinción, pues generalmente, el colorante reacciona con
la célula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.

Debido a eso la Tinción es importante para la microbiología debido a que:

 Proporciona contraste entre el microorganismo y el medio que lo rodea,

permitiendo diferenciar varios tipos morfológicos.
 Permite el estudio de las estructuras internas de la célula bacteriana, tales como
paredes celulares, vacuolas o cuerpos celulares.
 Permite el empleo de mayores amplificaciones.

VII. RECOMENDACIONES

 manejar con cuidado las láminas porta objetos al momento de

manipularlas y llevarles al fuego ya que son frágiles y de fáciles de
romperse.
 Las mesas deberán estar siempre limpias y desocupadas, tu mochila
debe ser colocada en el lugar indicado por el profesor.
 Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más
próximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo
del instrumental y de los medios de cultivo.
 Tener cuidado con los materiales de laboratorio.

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 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Adelberg, J. M. (2008). Microbiologia. (M. M. Ed., Ed.) 70 - 89.

 microbiología, D. y. (2009). Zárate, Mariela Soledad Dadamio, Jesica Alí,

Susana . Red Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana.

 PR, M. (2009). Microbiologia Medica. 24 - 34.

 Valencia, U. (2009 ). Observación de grupos microbianos . El Cid Editor |

apuntes.

 Valencia, U. (2009). Observación de grupos microbianos . El Cid Editor |

apuntes.

 Zárate, M. S. (2009). Desarrollo y evaluación de una muestra para control de

calidad en microbiología . Red Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana.

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