Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Guia Argentina Valid Metod Micro PDF
Guia Argentina Valid Metod Micro PDF
TÍTULO:
RESUMEN: Este documento describe las actividades para la validación de Métodos de Ensayo
Microbiológicos que soliciten su acreditación ante el Organismo Argentino de Acreditación.
Este documento se distribuye como copia no controlada. Debe confirmarse su vigencia antes de hacer
uso de esta versión, por si ha sido modificada.
Página 2 de 17
OAA Código: GUI-LE-05
Organismo GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE Versión: 1
Argentino de MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Acreditación Fecha de entrada en
vigencia: 26-junio-2013
1. OBJETIVO .......................................................................................................... 3
2. ALCANCE ........................................................................................................... 3
3. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA .............................................................. 3
4. ABREVIA TURAS Y DEFINICIONES ................................................................. 4
5. RESPONSABILIDADES ..................................................................................... 8
6. DESCRIPCIÓN ................................................................................................... 8
6.1. Requisitos generales para las actividades de validación y para la estimación de
la incertidumbre de medición..................................................................................... 8
6.2. Validación de los métodos................................................................................ 10
6.3. Estimación de la incertidumbre de medición .................................................... 14
6.4. Expresión de la Incertidumbre de medición en los informes de ensayo ........... 16
7. DOCUMENTACIÓN RELACIONADA ............................................................... 16
8. Anexo I - Parámetros de validación y expresiones para su cálculo .................. 17
Página 3 de 17
OAA Código: GUI-LE-05
Organismo GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE Versión: 1
Argentino de MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Acreditación Fecha de entrada en
vigencia: 26-junio-2013
1. OBJETIVO
Establecer una guía, de aplicación no obligatoria, para la validación de métodos de ensayo
no normalizados, desarrollados o diseñados por el Laboratorio, métodos normalizados
empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que puede aplicar
correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos. Establecer
los principios y los requisitos para la evaluación de la incertidumbre de medida en los
ensayos y para la expresión de dicha incertidumbre. Esta guía está dirigida a Laboratorios
que realizan ensayos microbiológicos utilizados en el análisis de agua y de alimentos
destinados al consumo humano y la alimentación animal, a muestras ambientales en el
ámbito de la producción y manipulación de alimentos y, en productos farmacéuticos o
cosméticos.
2. ALCANCE
Esta guía la pueden aplicar los laboratorios de ensayo acreditados ante el OAA, los
laboratorios que solicitan su acreditación, y los evaluadores y expertos técnicos que actúan
en los procesos de acreditación.
3. DOCUMENTACIÓN DE REFERENCIA
3.1. Norma IRAM 301 vigente (ISO/IEC 17025: vigente), Requisitos generales para la
competencia de los laboratorios de ensayo / calibración.
3.2. Norma ISO 9000 vigente. Sistemas de Gestión de la Calidad - Fundamentos y
vocabulario.
3.3. Norma ISO 16140: 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for
the validation of alternative methods.
3.4. Norma ISO/TR 13843 vigente. Water quality - Guidance on validation of microbiological
methods.
3.5. Norma ISO/TS 19036:2006. Microbiology of food and animal feeding stuffs –
Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations.
ISO/TS 19036:2006/Amd 1:2009. Measurement uncertainty for low counts.
3.6. Norma ISO 17994 vigente. Water quality -- Criteria for establishing equivalence
between microbiological methods.
3.7. Norma ISO 5725-2 vigente. Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results -- Part 2: Basic method for the determination of repeatability and
reproducibility of a standard measurement method.
3.8. Norma ISO 5725-3 vigente. Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results -- Part 3: Intermediate measures of the precision of a standard
measurement method
3.9. Norma ISO 8199 vigente. Water quality -- General guidance on the enumeration of
micro-organisms by culture.
3.10. Norma ISO 11133-2 vigente. Microbiology of food and animal feeding stuffs --
Guidelines on preparation and production of culture media -- Part 2: Practical guidelines on
performance testing of culture media
Página 4 de 17
OAA Código: GUI-LE-05
Organismo GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE Versión: 1
Argentino de MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Acreditación Fecha de entrada en
vigencia: 26-junio-2013
Exactitud relativa: Grado de concordancia entre los resultados del método evaluado y los
obtenidos utilizando un método de referencia reconocido (3.3).
Nota: En lo posible deben utilizarse muestras idénticas. Sin embargo, cuando se utilizan
diferentes pre-enriquecimientos, se hace necesario la duplicación de las muestras.
Factor de cobertura (k): factor numérico utilizado como multiplicador de la incertidumbre
de medida para obtener una incertidumbre expandida de medición. (3.5).
Nota: Típicamente su valor se encuentra entre 2 y 3
Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición, que
caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al
mensurando (3.5).
Nota: El parámetro puede ser, por ejemplo, una desviación estándar (o un múltiplo de ella),
o la mitad de un intervalo de un nivel de confianza determinado.
Incertidumbre combinada, uc (y): incertidumbre estándar de un resultado, y, de una
medición cuando ese resultado es obtenido a partir de valores de otras cantidades, que es
igual a la raíz cuadrada positiva de la suma de los términos, siendo estos términos, las
varianzas o covarianzas de esas cantidades divididas por los resultados de esas
mediciones (3.5).
Incertidumbre estándar, u (xi): incertidumbre del resultado xi de una medición expresada
como una desviación estándar (3.5).
Incertidumbre expandida (U): cantidad que define a un intervalo en torno al resultado de
una medición que puede esperarse que incluya una fracción grande de la distribución de
los valores que pueden atribuirse razonablemente al mensurando (3.5).
Inclusividad/ Exclusividad: inclusividad es la capacidad de un método alternativo de
detectar el microorganismo diana a partir de un amplio rango de cepas. Exclusividad es la
falta de interferencia, en un método alternativo, a partir de un rango amplio de cepas no-
diana (3.3).
Nota: La exclusividad expresa la capacidad del método de no detectar a los
microorganismos no - diana, es decir aquellos que pueden presentar reacciones cruzadas
con el microorganismo diana. La inclusividad es el rango de cepas que refleja la diversidad
genética y / o serológica del microorganismo diana que el método puede detectar.
La inclusividad y la exclusividad se determinan sobre un amplio rango de cultivos puros de
cepas diana y no - diana, mientras que la sensibilidad/especificidad se determinan en
matrices contaminadas. La inclusividad/exclusividad da una medida de la selectividad del
método.
Este requisito no es aplicable al recuento total de microorganismos viables, recuento de
hongos y levaduras o métodos de enumeración que no están dirigidos contra
microorganismos específicos.
Límite de detección: aplicado a ensayos microbiológicos cualitativos, es el número
mínimo de microorganismos que pueden ser detectados, pero en cantidades que no
pueden estimarse con precisión (3.13).
Límite de cuantificación: aplicado a ensayos microbiológicos cuantitativos, es el número
mínimo de microorganismos dentro de una variabilidad definida que puede determinarse
en las condiciones experimentales del método evaluado (3.13).
Página 6 de 17
OAA Código: GUI-LE-05
Organismo GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE Versión: 1
Argentino de MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Acreditación Fecha de entrada en
vigencia: 26-junio-2013
Nota: Este conjunto de condiciones incluye el mismo procedimiento de medida, los mismos
operadores, el mismo sistema de medida, las mismas condiciones de operación y el mismo
lugar, así como mediciones repetidas del mismo objeto o de un objeto similar en un periodo
corto de tiempo.
Reproducibilidad: precisión de medida bajo un conjunto de condiciones de
reproducibilidad (3.15).
Nota: Este conjunto de condiciones incluye diferentes lugares, operadores, sistemas de
medida y mediciones repetidas de los mismos objetos u objetos similares. Los diferentes
sistemas de medición pueden utilizar diferentes procedimientos de medida. En la práctica,
conviene que toda especificación relativa a las condiciones incluya las condiciones que
varían y las que no.
Robustez: capacidad de un método para mantenerse sin cambios ante pequeñas pero
deliberadas variaciones en los parámetros del método, que provee una indicación de su
confiabilidad durante el uso normal (3.18).
Nota; las variaciones a las que hace referencia la definición son por ejemplo, cambios en
las condiciones ambientales, en las condiciones de incubación (tiempo/temperatura),
calidad y vida útil de medios de cultivo y reactivos, pH, etc. La información de la prueba de
robustez puede utilizarse para especificar las condiciones en que debe ser aplicado el
método
Sensibilidad (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): Fracción del número
total de cultivos o colonias positivos que son correctamente asignados con el método
utilizado (3.4).
También puede definirse como la capacidad de un método de detectar el microorganismo
diana, cuando este está presente.
Tasa de Falsos Positivos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): es la
probabilidad o frecuencia con que la muestra sea asignada como positiva cuando en
realidad es negativa. Falsos Positivos son aquellos que han sido asignados como tales
conociendo que en realidad son negativos. La incidencia de falsos positivos es igual a: 1
menos la especificidad (3.11).
Tasa de Falsos Negativos (para un tipo de matriz y un nivel de inoculación dado): es la
probabilidad o frecuencia con que una muestra conocida como positiva, sea asignada
como negativa por el método. La incidencia de falsos negativos es igual a 1 menos la
sensibilidad (3.11).
Validación: Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista (3.2).
Verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos especificados. (3.2).
Veracidad: proximidad entre la media de un número infinito de valores medidos repetidos
y un valor de referencia (3.15).
Nota: El verdadero valor de una cantidad es un concepto teórico y, en general, no puede
ser conocido exactamente. En la práctica el valor de referencia aceptado puede sustituir al
valor verdadero. La veracidad se expresa habitualmente en términos de sesgo o bias. Es
aceptado, en los ensayos microbiológicos cuantitativos, que no se tenga en cuenta al
sesgo, en la estimación de la incertidumbre de medición debido a la naturaleza empírica de
Página 8 de 17
OAA Código: GUI-LE-05
Organismo GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE Versión: 1
Argentino de MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Acreditación Fecha de entrada en
vigencia: 26-junio-2013
antes de su uso, los medios de cultivo evaluados y controlados, etc. Ver lo dispuesto en el
documento CE-LE-06 Criterios específicos para la evaluación y acreditación de laboratorio
que llevan a cabo ensayos microbiológicos.
b) Para la validación/verificación de los métodos, el número y categoría de matrices a
analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y debe basarse en
referencias bibliográficas o estándares reconocidos, por ejemplo el anexo B de la norma
ISO 16140 o el anexo B del documento Final Report and Executive Summaries from the
AOAC International Presidential Task Force on Best Practices in Microbiological
Methodology.
c) Para la estimación de la incertidumbre, debe tenerse en cuenta: el tipo de matriz (o
grupo consistente de matrices), el microorganismo (o grupo consistente de
microorganismos, por ejemplo, coliformes) y el método empleado. El número y categoría
de matrices a analizar debe justificarse de acuerdo al alcance de la acreditación y debe
basarse en referencias bibliográficas o estándares reconocidos, por ejemplo la norma
ISO/TS 19036.
d) Las actividades de validación y las de estimación de incertidumbre de medición deben
reflejar las condiciones reales de la aplicación de los métodos de ensayo, es decir, deben
tener en cuenta las condiciones encontradas en la práctica diaria. Por ello pueden
utilizarse: de preferencia muestras naturalmente contaminadas, contaminadas por mezcla,
o en su defecto muestras inoculadas o materiales de referencia. El Anexo C de la norma
ISO 16140 sirve como referencia para alimentos. Una guía para la preparación de
muestras de agua, se encuentra en la referencia 3.14 de este documento. Cuando se
utilice la inoculación, debe tenerse en cuenta que según la naturaleza del método y de la
matriz, se hace necesario considerar la presencia de la flora acompañante a fin de evaluar
posibles interferencias. Para ello se pueden utilizar matrices estériles inoculadas, con el
microorganismo diana y con cepas distintas a la diana en concentraciones superiores.
También pueden utilizarse muestras no esterilizadas inoculadas, que hayan demostrado
previamente la ausencia del microorganismo diana. Para la selección de los
microorganismos a utilizar puede servir como referencia lo indicado en el Anexo G de la
norma ISO 16140 o en la norma ISO 11133-2. El nivel del inóculo debe ser acorde a lo
analizado por el laboratorio en la práctica diaria y lo especificado por el método de ensayo,
por ejemplo el análisis de muestras de alimentos con alta carga y baja carga en la
determinación de Salmonella. También debe tenerse en cuenta el estado fisiológico del/los
microorganismo (s) de acuerdo a las matrices analizadas.
e) Tanto en la validación como en el cálculo de la incertidumbre de medición se debe
tener en cuenta el rango de trabajo que emplee el Laboratorio en sus análisis de rutina.
f) Para los modelos descriptos en 6.3.2.1 y 6.3.2.2, la incertidumbre debe recalcularse
cuando se produzcan cambios significativos en las condiciones: por ejemplo, cambio en los
equipos, en los analistas, en los medios de cultivo, etc. Si se necesita estimar la
incertidumbre para un cliente o para la interpretación de un resultado en contra de una
especificación, y el cálculo no se ha actualizado en los últimos 6 meses, es recomendable
que se lo revise.
g) Se debe designar a un Responsable que tenga las calificaciones y la competencia
necesarias, para evaluar el diseño experimental y los resultados obtenidos, tanto en la
validación de los métodos como en la estimación de la incertidumbre de medición. Éste
Página 10 de 17
OAA Código: GUI-LE-05
Organismo GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE Versión: 1
Argentino de MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Acreditación Fecha de entrada en
vigencia: 26-junio-2013
decidirá además las acciones a seguir en caso que no se obtengan los resultados
esperados.
h) La participación en Ensayos de Aptitud (EA), no puede ser utilizada como único método
para la validación ni para la estimación de la incertidumbre de medición, debido a las
siguientes limitaciones:
en las rondas de EA, las matrices, en muchos casos, son diferentes a las que analiza el
Laboratorio en su rutina diaria y no tienen en cuenta la presencia de flora acompañante;
las muestras distribuidas durante la ronda, han sido especialmente homogeneizadas y
estabilizadas;
los niveles de microorganismos en las muestras del EA, pueden no ser aquellos que el
laboratorio analiza rutinariamente y pueden no cubrir el rango encontrado en el trabajo
diario;
los laboratorios participantes, utilizan una variedad de métodos empíricos para obtener
su resultado, por lo cual para evaluar el resultado de la ronda se utilizan valores de
consenso.
Sin embargo la participación en EA, puede utilizarse como actividades complementarias a
la validación y pueden dar una indicación de la precisión obtenida para un método en
particular.
La participación en EA puede utilizarse en la estimación de la incertidumbre de medición
bajo las condiciones estipuladas en la norma ISO/TS 19036 vigente.
1
Método empírico: es un método que determina un valor al que sólo se puede llegar en términos del
método en cuestión y que, por definición, sirve como el único método para establecer el valor
aceptado del parámetro medido (AOAC). Un método de ensayo diferente (a menudo para el mismo
analito) puede dar un resultado diferente, dado que el mensurando se define en los términos del
método. Por esta razón, en los métodos microbiológicos cuantitativos, el sesgo o “bias” no
contribuye a la incertidumbre del método, dado que los resultados dependen de las condiciones
definidas en el método, tales como, la temperatura y tiempo de incubación, los medios de cultivo,
etc. Es por ello que la utilización de materiales de referencia certificados, cuyo valor se obtiene
también de métodos empíricos, constituye una herramienta útil para demostrar la competencia del
laboratorio, pero no deben ser utilizados para cuantificar el sesgo.
Página 15 de 17
OAA Código: GUI-LE-05
Organismo GUIA PARA LA VALIDACIÓN DE Versión: 1
Argentino de MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Acreditación Fecha de entrada en
vigencia: 26-junio-2013