Bacteriología Dr.

César Cevallos Columbus

UNIVERSIDAD NACIONAL “JORGE BASADRE GROHMANN” –TACNA

FACULTAD DE CIENCIAS: E.P DE BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA
CURSO: BACTERIOLOGÍA
PRÁCTICA DE LABORATORIO Nº 01

LA COLORACIÓN DE GRAM Y SU IMPORTANCIA EN EL DIAGNÓSTICO

BACTERIOLÓGICO

I. INTRODUCCIÓN

La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales
más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram
positivas y Gram negativas. La importancia de la coloración de Gram como herramienta diagnóstica es
muy relevante porque, en primera instancia, permite caracterizar tamaño, forma y/o agrupación
bacteriana, la reacción tintorial y el germen predominante en una infección o en muestras
contaminadas con biota normal. En la coloración Gram también es relevante considerar la presencia
de la respuesta leucocitaria o respuesta inflamatoria y otro tipo de células como las epiteliales, con el
fin de orientar la presencia de infección aguda o crónica y en algunos casos evaluar la calidad de la
muestra clínica como sucede con las muestras de esputo.

A pesar de que en algunas muestras clínicas esta tinción no tiene valor diagnóstico (faríngeas,
nasofaríngeas y con uso muy limitado en muestras de materia fecal), puede ser aplicada a diversos
especímenes clínicos como líquido cefalorraquídeo, exudados, orinas, esputo, abscesos y tejidos. La
coloración de Gram es en la actualidad, la prueba de laboratorio de microbiología más simple y con el
mejor costo efectividad, lo que representa un beneficio para el paciente, el clínico y el laboratorio.

Las características fenotípicas que presentan algunas bacterias contribuyen a su diagnóstico

presuntivo. Además de proveer al microbiólogo y al clínico las características fenotípicas de la bacteria
(tamaño, forma, agrupación y carácter tintorial), esta tinción es importantísima ya que en algunos
casos permite la instauración del tratamiento rápido y oportuno. Se debe tener un riguroso control de
calidad del frotis, la tinción y el procedimiento, con el fin de minimizar los errores técnicos y mejorar la
sensibilidad y especificidad de esta tinción como herramienta para el diagnóstico presuntivo del agente
infeccioso.

II. OBJETIVOS

1. Conocer la importancia de la coloración de Gram como herramienta diagnóstica.

2. Caracterizar e identificar a las bacterias Gram positivas y Gram negativas de acuerdo a sus
características morfotintoriales.
3. Evaluar la calidad de la muestra clínica en estudio.

III. MATERIALES

 Microscopios  Alcohol isoprópilico

 Cultivos bacterianos
 Muestras clínicas o biota
normal
 Mecheros
 Asas de platino
 Set Colorantes Gram
 Lámina portaobjetos
 Aceite de inmersión
 Gradilla porta láminas
 Pizeta con agua destilada
 Papel seda
 Hisopos
 Alcohol desinfectante
 Plumón indeleble.

Cultivos bacterianos: Lo que disponga el laboratorio y/o muestras a partir de los alumnos.
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OBTENCIÓN DE MUESTRAS FRESCAS

1. Dos o Tres alumnos voluntarios: tres días antes de la práctica no lavarse ni cepillarse la boca con
pasta dental u otra sustancia.
2. Dos o tres alumnos voluntarios deberán traer una muestra de sus propias heces.

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS

Primer caso: cada alumno voluntario deberá hacer un enjuague o lavado bucal con S.S.F.E. Si, se
observa detritus en el vaso de precipitación se hará un filtrado; luego, se procederá a la extensión en
una lámina portaobjetos y colorear con Gram.

Segundo caso: cada alumno voluntario diluirá las heces en tubos de ensayo con 5 mL de S.S.F.E o
agua destilada; luego, realizar filtrado de cada uno de las muestras y, finalmente, extender en lámina
portaobjetos y colorear con Gram.

IV. PROCEDIMIENTO

1. Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos.

2. Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente. Tomar material de la
colonia elegida, con un ansa previamente esterilizada a la llama y suspender este material en una
gota de agua colocada en la mitad del portaobjetos. Extender el material sobre toda la superficie
del portaobjeto.
3. Fijar con calor pasando el preparado por sobre la llama SIN QUEMARLO.
4. Cubrir el extendido con una solución del colorante cristal violeta. Dejar en contacto 60 segundos.
5. Decantar el colorante y lavar con chorro ligero.
6. Cubrir con solución de lugol. Dejar en contacto durante 2 minutos.
7. Decantar y lavar con chorro ligero
8. Decolorar con alcohol-acetona por 10 segundo. Lavar con agua.
9. Cubrir con safranina (colorante de contraste). Dejar en contacto 15 a 20 segundos. Lavar.
10. Secar y observar al microscopio óptico con objetivo de inmersión.

PRECAUCIONES

Para obtener una buena coloración Gram, es necesario tomar en cuenta algunas precauciones:

1. Extendido: Este paso es importante ya que la preparación debe ser fina y no gruesa.
2. Fijación: Si el extendido bacteriano no se fija adecuadamente, las células bacterianas se pierden
durante el proceso de tinción que involucra varios lavados y trae como consecuencia la ausencia
de bacterias teñidas.
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3. Observar varios campos hasta encontrar un campo que permita una identificación de la
morfología, estructura y reacción al Gram.

4. La solución VIOLETA DE CRISTAL Y SAFRANINA O FUCSINA BÁSICA son irritantes en contacto

con la piel, ojos y mucosas.
5. La solución ALCOHOL ACETONA y la solución SAFRANINA O FUSINA BÁSICA son inflamables,
por lo tanto, se debe tomar los cuidados requeridos para el manejo de productos inflamables en
laboratorio.
6. Las soluciones usadas y caducadas deben eliminarse como desechos especiales, debiendo
cumplir las regulaciones locales para el desecho de compuestos peligrosos.
7. Toda muestra biológica debe considerarse potencialmente peligrosa.

OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO

Figura 1. Coloración Gram. Izq. E. coli (orina). Der. Staphylococcus spp. (cultivo).

Figura 2. Coloración Gram. Izq. S. pneumponiae (esputo). Der. C. tetani (cultivo).

Figura 3. Coloración Gram. Izq. Gonococo (secreción uretral). Der. Hemocultivo en la que se observan bacilos
Gram negativos pertenecientes al género Burkholderia.
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V. RESULTADOS

Muestra: ………………………………………….. Muestra:………………………………………………..

Coloración:……………………………………….. . Coloración:…………………………………………….

Germen:………………………………………….. . Germen:……………………………………………….

Características:……………………………. . Características………………………………………..

……………………………………………………. . …………………………………………………………..

Otros:…………………………………………….. . Otros:…………………………………………………..

Muestra: ………………………………………….. Muestra:………………………………………………..

Coloración:……………………………………….. . Coloración:…………………………………………….

Germen:………………………………………….. . Germen:………………………………………………..

Forma y disposición:……………………………. . Forma y disposición………………………………….

……………………………………………………. . …………………………………………………………..

Otros:…………………………………………….. . Otros:……………………………………………………

……………………………………………………... …………………………………………………………..
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VI. CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles son las características que debe de tener un frotis bacteriano?

2. ¿Qué función cumple el yodo durante la tinción?
3. ¿Cuál es el punto crítico de la coloración Gram y porqué se le llama así?
4. Investiga qué tipo de variables pueden ocasionar que se obtengan resultados no deseables
cuando se realiza una tinción de Gram (por ejemplo, que una bacteria Gram negativa se coloree
de morado).
5. Busca en la literatura, a los microorganismos observados en la práctica y compara tus resultados
con lo observado.
6. Haz un dibujo de las paredes celulares de una bacteria Gram positiva y una Gram negativa
señalando las principales estructuras en ellas.
7. ¿Cuáles son las dos causas que determinan que la pared celular de las bacterias Gram negativas
sean más permeables al disolvente?

GLOSARIO. Define los siguientes términos.

1. Colorante
2. Mordente
3. Tinción diferencial
4. Tinción simple
5. Peptidoglucano
6. Ácido teicoico
7. Espacio periplásmico

Tacna, setiembre - 2018