ESPECTROFOTOMETRÍA BIOQUÍMICA

PRACTICA N° 3: ESPECTROFOTOMETRÍA

I. INTRODUCCIÓN

Al observar una solución acuosa de un colorante a trasluz, observamos una leve coloración, la cual se
debe a la interacción entre las moléculas del colorante y la luz que atraviesa la disolución. Además en
caso de tener varias soluciones de distintas concentraciones es posible determinar un gradiente de
concentración a partir de la intensidad de la coloración. Estas observaciones dan origen a una serie de
prácticas analíticas llamada Espectrofotometría, basada en la interacción de las moléculas y las
radiaciones electromagnéticas.

Una radiación electromagnética se puede describir como un flujo de partículas llamadas fotones, o bien
como una onda propagándose en el espacio. De esta última descripción se toma el concepto de longitud
de onda, definiéndolo como la distancia entre dos máximos consecutivos de la onda. La longitud de onda
es inversamente proporcional a la energía de la misma, de tal manera que el espectro de radiaciones
electromagnéticas abarca un amplio rango de energías, las de menor energía son las ondas de radio y las
de mayor energía son las llamadas radiación gamma.

El estado energético de una molécula se puede alterar por la absorción de radiación electromagnética a
determinada longitud de onda, lo que se puede medir para realizar un estudio cuali o cuantitativo, este
fenómeno es el fundamento de la espectrofotometría. Cuando un haz de luz incide sobre un medio
homogéneo parte de la radiación es absorbida y parte transmitida, la fracción de luz que se absorbe y se
transmite dependerá de la cantidad de moléculas presentes en el medio (de la concentración) los que nos
permite cuantificar una sustancia

Las principales ventajas de la espectrofotometría son:

Sensibilidad relativa elevada.

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Facilidad para realizar mediciones rápidas.

Grado de especificidad relativamente elevado.

Para obtener la máxima sensibilidad en una determinación debe conocerse la longitud de onda de mayor
absorción de la sustancia analizada, que no deberá coincidir con una alta absorción de otras sustancias
presentes en la reacción.

Sea I la intensidad de una radiación que atraviesa un medio homogéneo, parte de la radiación es
absorbida por la muestra y otra parte es transmitida, ambas con una intensidad, i, de tal manera que se
define transmitancia de una muestra como la relación entre la radiación transmitida i versus la intensidad
luminosa incidente I, multiplicado x 100:

% T = ( i / I) x 100

La absorbancia es una medida de la cantidad de Energía luminosa incidente absorbida por una sustancia
en solución. Está relacionada con Transmitancia por medio de :

A= - Log T A= log ( 100 / %T)

La Ley de Lambert y Beer expresa que la absorbancia de una solución es directamente proporcional al
camino recorrido por la radiación electromagnética y a la concentración de la solución.

A= abc
A: absorbancia
a: absortividad específica de cada soluto
b: distancia recorrida por el haz de luz en cm
c: concentración de la solución
La absortividad es la constante de proporcionalidad que nos permite igualar la ecuación, sus unidades
dependerán de b y c, ya que la absorbancia no tiene unidades; si b está en centímetros y c en moles por
litro, la absortividad estará en litros / mol centímetro y se denomina coeficiente de absorción molar (E).

Requerimientos para poder aplicar la Ley:

- La medición del % de T es realizada con luz monocromática
- La medición del % de T es realizada a una región de absorción del componente a estudiar.

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- La referencia es elegida de tal manera que C=0 cuando T= 100% o A= 0%

- La naturaleza de la solución debe ser tal que su transmisión responda a variaciones de C.

Espectrofotómetro
Los aparatos de medida de la absorción de la radiación electromagnética se denominan
espectrofotómetros y pueden representarse de forma sencilla mediante el siguiente esquema:

La luz procedente de la fuente se hace pasar a través del monocromador, que la desdobla en haces
monocromáticos. El colimador tiene una rendija de ajuste variable, y según su abertura se obtiene luz de
una determinada longitud de onda.La longitud de onda que se desee utilizar se selecciona variando la
posición del monocromador. La luz que sale del colimador se hace pasar por la solución y luego incide
sobre el fototubo, donde se detecta. La señal se envía a un registrador, el cual puede ser la escala de un
galvanómetro calibrado.

Calibración del espectrofotómetro

Prender el equipo llevando la llave hacia arriba. Esperar 15 minutos para que los circuitos alcancen
temperatura.
Elegir la longitud de onda deseada con el selector.
Verificar 0% de T. Se realiza en modo transmitancia y colocando un cuerpo negro en reemplazo del tubo

Espectro de absorción
Consiste en un gráfico que representa el % T o la Absorbancia en función de la Longitud de onda a la cual
se realiza la medición, para un amplio rango de longitudes de onda y para una misma concentración c de
la muestra.
Permite determinar las longitudes de onda óptimas de absorción y las concentraciones adecuadas de
trabajo. La longitud de onda optima será aquella en el que el valor de absorbancia sea máximo

Los pasos para realizar un espectro de absorción son:

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Seleccionar la longitud de onda.

Ajustar 100 % T o 0 % A con el Blanco de reactivos.
Reemplazar el blanco por la muestra y leer absorbancia.
Seleccionar una nueva longitud de onda y repetir las operaciones.
Graficar Absorbancia vs longitud de onda y seleccionar aquella donde la A sea máxima.

Curva de calibración

Permite determinar la concentración de una muestra incógnita. Consiste en medir una serie de soluciones
concentración conocida de la sustancia de la muestra incógnita. Se grafican esos puntos y se emplea dicho
grafico para calcular la muestra problema.

Los pasos para realizar una curva de calibración son:

Medir la A de las soluciones de concentración conocida.
Medir la A de la muestra problema.
Graficar Absorbancia vs. concentración.

Si la sustancia cumple con la Ley de Lambert y Beer el gráfico será una recta y será posible sacar un
factor ya que la pendiente de la recta será la misma en todos los puntos. Así se podrá calcular la
concentración de la muestra problema.

Si la sustancia no cumple la Ley, el gráfico será una curva y se extrapolará dentro de un rango apropiado
para calcular el valor de la muestra problema.rminar nitritos en próximas muestras? Justificar.

II. OBJETIVOS
 Aplicar los conceptos de la espectrofotometría UV – VIS
 Representar los resultados de las curvas espectral y estándar del
KMn O4.
 Hallar la concentración de una muestra desconocida de KMn O4 usando
la curva estándar o de trabajo .
III. MATERIALES Y REACTIVOS
 Balanza analítica
 Espectrofotómetro

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 Solución de permanganato de potasio (KMnO4 ) 4 mg/litro.

 Tubos de vidrio.
 Fiolas
 Gradillas
 Pipetas
 Piscetas

IV. RESULTADOS Y CÁLCULOS

V. INTERPRETACIÓN
VI. DISCUSIÓN
VII. CUESTIONARIO
1. DIBUJE Y SEÑALE LAS PARTES DE UN ESPECTROFOTÓMETRO.
 Fuente de luz
 Monocromador
 Compartimiento
de muestra
 Detector
 Fotodetectores
 Celdas
 Colimador
 Registrador

2. ¿CUÁLES SON LOS CROMÓFOROS DE LAS PROTEÍNAS QUE

ABSORBEN LA LUZ DE 280NM?

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Las proteínas absorben luz en la región UV con dos máximos a 280nm (menor
energía) y 200 nm (mayor energía). Los electrones que bsorven menor energía
(280nm) son los ubicados en los anillos aromáticos de ciertos ainoácidos como la
fenilalanina, triptófano y tirosina. Todas las proteínas pueden ser detectadas, sin
embargo solo ciertos residuos de aa son los que se leen en la región del UV. Se
encuentran dentro, los aa cuya cadena lateral posee un anillo aromático.
 FENILALANINA:
Es el menos importante cuantitativamente, aunque muestra un espectro
complejo con múltiples bandas diferenciadas en torno a 250-260nm. Presenta
también bandas de mayor energía que solapan con el espectro del enlace
peptídico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por encima de 280
nm su contribución al espectro en la zona del ultravioleta cercano de
proteínas suele ser pequeña.
 TIROSINA:
Presenta un máximo a 275nm con un hombro a 285nm. La banda se desplaza
a mayores longitudes de onda cuando se produce la desprotonación del OH
del anillo aromático.
 TRIPTÓFANO:
Agrupa al menos tres bandas diferentes bajo el espectro centrado a 280nm.
También presenta bandas en la zona del UV lejano.

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3. ¿CUÁLES SON LOS RANGOS DE ENERGÍA DE LA REGIÓN

ULTRAVIOLETA UV, INFRARROJA IR Y QUE APLICACIÓN MÉDICA
CONSIDERA USTED QUE ÉSTAS TENDRÍAN?
Los 2 tipos principales de energía en espectrofotometría son:
 LA LUZ ULTRAVIOLETA:
La luz solar antiguamente fue utilizado en el tratamiento empírico de artritis,
edemas, ictericias, trastornos de la piel, tuberculosis y raquitismo. Estos
beneficios han sido atribuidos de alguna manera a la presencia de rayos
ultravioletas, por la capacidad de producir reacciones fotobioquímicos cuando
actúan con el organismo y su capacidad bactericida.
 Radiación UV-A
 Presenta longitud de onda entre 320 y 400nm.
 Produce bronceado inmediato por oxidación de la melanina.
 Radiación UV-B
 Longitud de onda entre 290 – 320nm.
 Efecto fototóxico.
 2000 veces más riesgoso de quemaduras que la UV-A.
 Radiación UV-C
 Longitud de onda entre 200 – 290nm.
 Gran poder bactericida.

EFECTOS EN MEDICINA:
 Estímulo de la glándula
tiroides.
 Aumento del metabolismo
proteico.
 Aumento de la absorción
intestinal de calcio y fósforo.
 Acción sobre el metabolismo
de la vitamina D.
 Disminución del glucógeno
hepático y músculos.

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 LA LUZ INFRARROJA:
Su longitud de onda va desde 700 a 780 nm, limitando con el color rojo en la
zona visible del espectro, hasta los 10000 y 15000 nm limitando con los
microondas. Se tiene 3 bandas de IR.
 IR – A: 780 – 1400 nm.
 IR – B: 1400 – 3000 nm.
 IR – C: 3000 – 10000 nm.
EFECTOS EN MEDICINA:
 Se produce sedación y relajación generalizada del organismo, debido a la
acción del calor ligero sobre todas las terminaciones nerviosas.
 Se presenta un efecto antiinflamatorio.
 Disminución de la presión arterial, aumento de la frecuencia cardíaca y
aumento del pH sanguíneo.
 Produce alteración de arterias, capilares y venas.
 Se produce relajación muscular con un efecto antiespasmódico ,así como
el aumento de la velocidad de conducción de los nervios periféricos.

4. EXPLIQUE LA LEY DE LAMBERT Y BEER

Ley de Lambert
La ley de Lambert trata sobre la iluminancia de una superficie situada a
una cierta distancia de una fuente de luz. Determina que la iluminación
producida por una fuente luminosa sobre una superficie es directamente
proporcional a la intensidad de la fuente y al coseno del si ángulo que
forma la normal a la superficie con la dirección de los rayos de luz y es
inversamente proporcional al cuadrado de la distancia a dicha fuente.
Ley de Lambert-Beer
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La ley de Lambert-Beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un

cuerpo depende de la concentración en la solución.
Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azúcar disuelta y en
otro vaso tenemos la misma cantidad de agua pero con mayor cantidad de
azúcar en solución. El detector es una celda fotoeléctrica, y lo que se mide
es la concentración de la solución de azúcar.
Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el
primer vaso, la cantidad de luz que saldría del otro lado sería mayor que si
repitiéramos esto en el segundo, ya que en este último las ondas
electromagnéticas chocan contra un mayor número
2
de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.
Ley de Bouguer-Beer-Lambert
Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (también
conocida como ley de Lambert Bouguer y Beer), la cual es solo una
combinación de las citadas anteriormente.

VIII. CONCLUSIONES
IX. BIBLIOGRAFÍA
X. WEBGRAFÍA
 https://es.wikipedia.org/wiki/Ley_de_Beer-Lambert
 http://repositorio.innovacionumh.es/Proyectos/P_22CursoMateriales
/Miguel_Angel_Sogorb/Wimba/Espectroscopia_05.htm
 https://es.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometría
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 http://usoespectrofotometro.blogspot.pe/p/introduccion.html

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