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2º Congreso Nacional de Química Médica Padierna-Mota y col.

MECANISMO DE EVASIÓN DE LA RESPUESTA


INMUNE POR CÉLULAS DE CÁNCER CERVICAL:
APOPTOSIS INDUCIDA SOBRE CÉLULAS
LINFOIDES.
Laura Padierna Mota1,2, Paula Figueroa-Arredondo1, Fernando Enríquez-Rincón2. 1Lab. de
Microbiología Molecular, Programa Institucional de Biomedicina Molecular. ENMyH-IPN.
Gmo. Masssieu Helguera #239. La Escalera Ticomán, 07320. México, D.F.
2
figueroapaula@hotmail.com Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de
Estudios Avanzados. Av. IPN # 2508, 07360, Zacatenco, México DF.
fenriqz@cell.cinvestav.mx

RESUMEN

El linfocito T es una de las células del sistema inmune que se encargan de la


vigilancia inmunológica, induce muerte programada en células neoplásicas, infectadas,
senescentes o indiferenciadas. El mecanismo por el que se lleva a cabo esta
eliminación comprende dos vías principales: la exocitosis granular mediada por
perforina y granzimas y la vía de Fas/FasL, desembocando ambas en la apoptosis. En
ésta última, el proceso se activa cuando el receptor Fas de las células blanco se une a
su ligando (FasL) expresado en células T citotóxicas y células NK. Algunas células
neoplásicas (de vejiga, colon, hígado, pulmón, ovario, tiroides, riñón, sarcoma y
melanoma) siendo anormales y atípicas, expresan en su membrana el FasL como
mecanismo de contraataque para inducir apoptosis a las células del sistema inmune.
Concordando con tales datos, nuestro grupo ha detectado la presencia del FasL en
líneas celulares de cáncer cervical (SiHa, CaSki, HeLa y C-33 A). El objetivo de este
trabajo fue demostrar que las células de cáncer cervical no solamente expresan el
ligando de Fas sino que este es funcionalmente capaz de inducir apoptosis de
linfocitos T (células Jurkat) in vitro. Nuestros resultados experimentales ponen de
manifiesto que no solo el contacto con las células derivadas de cáncer cervical sino
también los sobrenadantes de sus cultivos fueron capaces de inducir apoptosis
medida mediante los ensayos de anexina V y por la prueba de TUNEL en células
Jurkat. Adicionalmente logramos bloquear el efecto apoptótico de los sobrenadantes
utilizando inhibidores del procesamiento proteolítico del FasL. Para corroborar la
participación de FasL, incubamos las líneas tumorales y las células Jurkat en
presencia de anticuerpos anti-FasL, lo cual neutralizó el efecto. Conocer el mecanismo
anterior y evitar la expresión genética del FasL es uno de los objetivos que sigue
nuestro laboratorio para idear una terapia génica anti-tumoral.

Palabras clave: Apoptosis, FasL, escape inmunológico.

INTRODUCCIÓN

El carcinoma del cuello uterino y sus lesiones precancerosas constituyen la


segunda causa de muerte relacionada al cáncer en mujeres a nivel mundial. En
México así como en otros países en vías de desarrollo ocupa el primer lugar. La
infección con tipos oncogénicos del virus del papiloma humano (VPH) es considerada
como el factor de riesgo principal para el desarrollo de tumores malignos en el cuello
uterino. Sin embargo, otros factores además del VPH contribuyen al proceso
carcinogénico entre los que se cuentan los factores ambientales y los propios del
hospedero (1). El sistema inmune del hospedero es el encargado de eliminar tanto
células infectadas por el virus como células cancerosas. La respuesta de anticuerpos
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específicos tiene una eficacia muy limitada a diferencia de la respuesta inmune


mediada por linfocitos T. El mecanismo principal de eliminación de células infectadas
por virus y células tumorales es a través de los linfocitos T citotóxicos que reconocen a
péptidos derivados de las proteínas virales asociados a las moléculas del complejo
principal de histocompatibilidad de clase I presentados en la superficie de las células
blanco. El mecanismo de citotoxicidad está mediado por dos vías: la liberación de
perforinas y granzimas que penetran a las células blanco causando los eventos
intracelulares que conducen a la apoptosis y la activación de receptores Fas que
también llevan a apoptosis a través de señales moleculares (2). Existen varios
ligandos de receptores relacionados a la muerte celular programada en las células
blanco. Uno de los más importantes es el ligando de Fas que se encuentra
normalmente expresado en las células citotóxicas (linfocitos T y células NK), sin
embargo, recientemente se descubrió la presencia de este ligando en células
tumorales de algunos tipos de cánceres como el de colon, pulmón, gástrico y en
astrocitoma (3). La demostración de la expresión de FasL en tejidos
inmunoprivilegiados como el ojo, asigna un papel preponderante al FasL en la
regulación de las respuestas inflamatorias necesarias para mantener la homeostasis
en el organismo. Durante la carcinogénesis, las células tumorales desarrollan múltiples
mecanismos para subvertir al sistema inmune y suprimir la respuesta antitumoral
(escape tumoral). La expresión de FasL en los tumores podría representar un
mecanismo de contraataque al inducir apoptosis en los linfocitos T que infiltran al
tumor y de esta forma escapar a la acción del sistema inmune (4). En nuestro
laboratorio detectamos la expresión del FasL en líneas celulares provenientes de
cáncer cervical y en este trabajo demostramos la funcionalidad de este ligando sobre
cultivos de una línea de linfocitos T en los cuales demostramos apoptosis utilizando el
ensayo de anexina V y la técnica de TUNEL.

METODOLOGÍA

Las células Jurkat se co-cultivaron con monocapas de cada una de las tres
líneas celulares [CaSki (HPV-16), HeLa (HPV-18) y C-33A (HPV negativo)] o con sus
respectivos sobrenadantes, después de 24 horas de incubación, se colectaron para
someterlas a un ensayo de apoptosis.

La apoptosis de los linfocitos T (células Jurkat) se determinó mediante el


ensayo de anexina V-FITC/ioduro de propidio y el porcentaje de células apoptóticas se
obtuvo por citometría de flujo en un FACSCalibur (Beckton-Dickinson).

Para la determinación del FasL soluble, las células tumorales fueron tratadas
con un inhibidor de metaloproteasas de matriz extracelular (MMPI) la cual previene la
liberación del ligando (5).

Por otro lado, las células tumorales fueron tratadas con anticuerpos anti-FasL
para bloquear el efecto apoptótico y corroborar la participación de dicha molécula.

RESULTADOS

Todas las líneas tumorales derivadas de cáncer cervical empleadas en este


trabajo y sus sobrenadantes indujeron apoptosis en la línea celular Jurkat. El inhibidor
de metaloproteasas de matriz extracelular (MMPI) suprimió el efecto apoptótico de los
sobrenadantes de los cultivos. Esto sugiere que el ligando de Fas soluble es el factor
que participa en la inducción de apoptosis, ya que éste ligando se libera al medio por
acción de metaloproteasas expresadas por las células tumorales (Fig. 1).
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Para comprobar que el ligando de Fas es responsable del efecto apoptótico


inducido por las líneas celulares de cáncer cervical, sobre los linfocitos T (células
Jurkat), se utilizaron anticuerpos policlonales contra FasL (anti-human Fas
ligand/TNFSF6 antibody, R&D Systems, Inc.). El efecto apoptótico fue completamente
neutralizado cuando se usaron las monocapas de las líneas tumorales tratadas con el
inhibidor de metaloproteasas, MMPI (Fig. 2).

Figura 1. Apoptosis de células


Jurkat co-cultivadas durante 24 h
con las monocapas (M) o
sobrenadantes (S) de líneas
celulares de cáncer cérvico
uterino (HeLa, SiHa, CaSki y C-33
A). Controles de inducción de
apoptosis cuantificada por
citometría de flujo usando la
tinción de anexina V-FITC/Ioduro
de propidio: células Jurkat sin
tratamiento, tratadas con
actinomicina D 0.2 µg/mL, con
anticuerpos monoclonales anti-
CD95 0.5 µg/mL o incubadas con
el inhibidor de metaloproteasas
de matriz extracelular 10 µM
(MMPI). Las letras se refieren a:
M.- cultivo mixto de células Jurkat
con la monocapa que se indica.
S.- Incubación de células Jurkat
con el sobrenadante de la
monocapa que se indica. MMPI.-
Tratamiento con MMPI a la
monocapa que se indica. Se
hicieron tres repeticiones de este
experimento, la figura muestra un
ensayo representativo.

Los resultados de la Fig. 2 corresponden a las determinaciones de apoptosis


empleando la prueba de TUNEL. En la línea superior del panel a) muestra la apoptosis
inducida por las células CaSki (HPV16+) sobre la línea celular Jurkat en tres
condiciones experimentales. En este caso las células CaSki sin tratamiento inducen
apoptosis de las Jurkat por contacto directo en un 48%, en tanto que el CD95L en
forma soluble en el sobrenadante de los cultivos fue capaz de inducir apoptosis a las
Jurkat de forma más eficiente, en un 61%. Cuando en el experimento se trató a las
CaSki con su anticuerpo específico anti-CD95L a fin de bloquear su actividad, se
observó una inhibición significativa de la apoptosis sobre las Jurkat (el 12% de células
mostraron apoptosis).

En la Fig. 2 la línea inferior del panel a) muestra la apoptosis inducida sobre las
células Jurkat empleando sobrenadantes de la línea celular CaSki en tres condiciones
experimentales. El sobrenadante de las células CaSki sin tratamiento es capaz de
inducir apoptosis a un 59.3% de las células Jurkat. En cambio al someter los cultivos
de las células CaSki al tratamiento con el inhibidor de metaloproteasas MMPI, el
ligando de CD95L queda unido a la membrana de las células por lo que al emplear su
sobrenadante este solamente es capaz de inducir apoptosis a un 3% de las Jurkat. Al
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tratar a la línea CaSki con el anticuerpo específico contra el CD95L no se observó una
inhibición significativa de la apoptosis inducida por el sobrenadante (56% de las Jurkat
sufrieron apoptosis) a las concentraciones de anticuerpo (1:500) empleadas en estas
pruebas.

En el panel b) la línea superior muestra los experimentos de inducción de


apoptosis obtenidos mediante experimentos con las células C-33 (HPV-), con la línea
celular Jurkat bajo tres condiciones experimentales. En la primera línea horizontal se
observa que las células C-33 sin tratamiento inducen apoptosis eficientemente a las
Jurkat en un 57%, al tratar a las C-33 con el inhibidor MMPI, conservando el CD95L en
la membrana, la inducción de apoptosis se eleva hasta el 76.5%. Al bloquear a CD95L
con su anticuerpo específico solamente se observa un 25% de apoptosis inducida
sobre las Jurkat por las monocapas de esta línea. En cambio en el experimento de
inducción de apoptosis empleando los sobrenadantes de C-33 sin tratamiento, el 61%
de las Jurkat experimentaron apoptosis. El sobrenadante de las células tratadas con el
MMPI solamente conservó su actividad apoptótica en un 13.5% de las Jurkat.
Sorprendentemente al tratar el sobrenadante de las C-33 con el anticuerpo anti-CD95L
la apoptosis sobre las Jurkat aún fue del 48%, este resultado al parecer indica que a la
concentración de anticuerpo empleada en este experimento, el anti-CD95L no es
capaz de inhibir totalmente el efecto apoptótico inducido por el ligando soluble
contenido en el sobrenadante.

Figura 2. El ligando de CD95


anclado a la membrana de las
células de cáncer cervical
induce apoptosis en las
células Jurkat. En el panel a)
aparecen los resultados
obtenidos con la línea celular
CaSki (HPV-16+) y en el
panel b) los resultados de la
línea C-33 (HPV-). La primera
columna representa a las
células sin tratamiento, la
segunda son las células
tratadas con el inhibidor de
metaloproteasa MMPI y en la
tercera columna las células
recibieron tratamiento con el
inhibidor MMPI y con el anti-
CD95L. Se muestran los
valores obtenidos de la
inducción de apoptosis en las
células Jurkat valorada por la
tinción de TUNEL después
del cultivo mixto de las
células linfoides con las
monocapas (M) o los
sobrenadantes (S) que se
indican.
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CONCLUSIONES

Todas las líneas celulares de cáncer cervical empleadas así como sus
sobrenadantes, indujeron apoptosis en las células Jurkat aún en la línea tumoral en
donde no se detecta la presencia del genoma del HPV, lo que evidencia que una
molécula unida a membrana y otra soluble está interviniendo en el proceso.

El tratamiento con un inhibidor de metaloproteasas MMPI que no permite que


se lleve a cabo la proteólisis que liberaría la forma soluble del ligando de FAS (CD95L)
dio lugar a un aumento en el efecto apoptótico observado cuando las células de
cáncer cervical tienen contacto directo con las células Jurkat, en comparación con los
cultivos celulares sin tratamiento. Consistentemente con el resultado anterior, los
sobrenadantes de ambas líneas celulares perdieron su capacidad de inducir apoptosis
al someter las células a tratamiento con el MMPI.

El anticuerpo anti-CD95L bloqueó el efecto apoptótico del CD95L presente en


la membrana de las células tumorales, pero no se consiguió bloquear totalmente el
efecto apoptótico inducido por los sobrenadantes de la línea celular C-33 A.
Probablemente un exceso de anticuerpo podría lograr una completa inhibición, pero es
necesario llevar a cabo la comprobación de este resultado.

BIBLIOGRAFIA

1. zur Hausen H. 2002. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nature
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2. Andersen MH, Schrama D, Straten PT, Becker JC. 2006. Cytotoxic T cells. Journal of Investigative
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3. Houston A and O’Connell J. 2004. The Fas signaling pathway and its role in the pathogenesis of
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4. O’Connell J. 2002. Fas ligand and the fate of antitumor cytotoxic lymphocytes. Immunology. 263-266.
5. Stamenkovic I. 2000. Matrix metalloproteinases in tumor invasion and metastasis. Seminars in Cancer
Biology. 10:415-433.