UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PANAMÁ

FACULTAD DE INGENIERÍA MECÁNICA

Asignatura:
CIENCIAS DE LOS MATERIALES

“Proyecto Final”

“Cría masiva, identificación molecular de la mosca blanca un vector

de virus emergentes y realización de Pesticidas para Plantas de
Tomate”

Presentado por:

Grupo:
- Lic. Ingeniería de Energía y Ambiente 1EM311 -

Profesor en curso:
Jovanny Díaz

Fecha de entrega:
SÁBADO 9 DE DICIEMBRE DEL 2017

1
Índice
Introducción ........................................................................................................................................ 3
Objetivos ............................................................................................................................................. 4
Objetivo General ............................................................................................................................. 4
Objetivos Específico ........................................................................................................................ 4
Formulación de las hipótesis y definición de las variables.................................................................. 4
Marco teórico y conceptual o temático .............................................................................................. 4
Metodología ........................................................................................................................................ 6
Actividades realizadas ..................................................................................................................... 6
Recolección de las moscas .......................................................................................................... 6
Cría de Mosca Blanca .................................................................................................................. 6
Liberación de las Mosca Blanca................................................................................................... 7
Diagnóstico Molecular de especie .............................................................................................. 7
Discusión y análisis, interpretación y aplicación de los resultados ..................................................... 9
Conclusiones ..................................................................................................................................... 14

2
Introducción

El tomate o tomatera, Solanum lycopersicum, es una planta perenne que se encuentra dentro

de las hortalizas de fruto de la familia botánica de las Solanáceas, igual que la patata o papa,

la berenjena y el pimiento. Aunque es originario de América del sur, no se sabe con seguridad

el lugar concreto del origen del tomate. Eso sí, el cultivo del tomate hoy en día está muy

extendido por todo el mundo y sería muy poco frecuente ver un huerto urbano sin alguna de

las diferentes variedades de tomates que hay. Durante el cultivo del tomate puede ser común

que aparezcan algunas plagas. El estudio se realizó en el Centro de Investigación

Agropecuaria Central (CIAC), del Instituto de Investigación Agropecuaria de Panamá

(IDIAP) y el insectario del MIDA localizado en Divisa. La recolecta del material biológico

en campo se realizó el 5 de junio de 2017 en el cultivo de tomate Variedad IDIAP - T9, el

cual se localizó en la Estación Experimental del IDIAP, en el Ejido de Los Santos. Una vez

en el laboratorio se siguió la metodología de cría establecida para tal fin, con modificaciones

y proceder a la realización del pesticida para las plantas de tomate. El resultado de la cría es

importante debido a que permitirá el desarrollo de experimentos con productos biológicos,

bioecología, transmisión de resistencia que pueden ser incorporados en planes de manejo

integrado del insecto, que permitan contribuir a disminuir el impacto en el cultivo de tomate.

3
Objetivos
Objetivo General
 Contribuir al conocimiento y capacidad de manejo de las moscas blancas, plaga

emergente que afecta los cultivos de hortalizas en Panamá.

Objetivos Específico
 Establecer una cría de moscas blancas para uso en el experimento en investigación

científica.

 Analizar molecularmente las especies de mosca blancas y virus que trasmiten.

 Crear pesticidas para los cultivos de tomate.

Formulación de las hipótesis y definición de las variables

Tales antecedentes sugieren el siguiente problema: ¿Cómo contribuir al manejo integrado

de B. tabaci para lograr disminuir el número de aplicaciones de plaguicidas sintéticos y

elevar la calidad del fruto de tomate?

Para dar solución a este problema se propone la hipótesis siguiente:

Si se logra establecer una cría masiva y análisis molecular de B. tabaci virulifera permitirá la

caracterización biológica y evaluación de nuevos productos químicos sintéticos y biológicos,

selección de cultivares resistentes y estudios de trasmisión. Lo cual contribuirá al manejo

integrado de la mosca blanca bajo condiciones agroecológicas de Panamá.

Marco teórico y conceptual o temático

El tomate industrial tiene gran importancia económica en la zona central de Panamá,

conocida como arco seco, y conformada por las provincias de Coclé, Herrera y Los Santos

(Valderrama et al, 2002). Las pérdidas de tomate industrial atribuidas a la alta población de

4
moscas blancas y a la infección del ToLCV-Pa en el arco seco se han estimado en 2184 kg/ha

por año (Valderrama et al, 2002).

Esto ha motivado varios estudios, sobre los virus que atacan a esta planta de gran importancia

económica en Panamá y otros lugares.

En las provincias centrales de la República de Panamá, se analizaron 14 distritos de 51, con

un total de análisis de 319 de plantas de tomate, encontrándose genes de tres especies de virus

Begomovirus, en el 42,3% de las muestras (Herrera-Vásquez et al, 2016).

Herrera-Vásquez et al (2016), registraron la presencia de diferentes síntomas en plantas

infectadas con Potato yellow mosaic Panama virus (PYMPV), Tomato leaf curl Sinaloa virus

(ToLCSiV) o con ambos, pero similares a los síntomas con otros virus como: Potyviridae y

Tobamoviridae, mostrando un alto nivel de recombinación molecular, produciendo nuevos

begomoviruses, con diferentes propiedades comparados con los virus parientes ancestrales,

del mismo. Sin embargo, en algunas plantas infectadas con virus pseudocombinantes,

producidas por ToLCV y PYMV, tienen síntomas sistemáticos (Engel et al, 1998).

El begomoviruses, es transmitido por el complejo mosca blanca. El complejo mosca blanca

se encuentra distribuido en gran parte del territorio nacional. Es un complejo B. tabaci,

morfológicamente indistinguibles especies. Estas especies se distinguen por métodos

moleculares debido a dificultades en la detección de diferencias morfológicas y biológicas.

Esperamos que las ideas y aportes presentados en las investigaciones realizadas en diferentes

laboratorios realizados en IDIAP con el personal especializado sirvan de apoyo en el logro

de los objetivos propuesto y facilitar al agricultor panameño una herramienta práctica que

contribuya a mejorar la productividad del cultivo de tomate.

5
Metodología
El estudio se realizó en el laboratorio de Protección Vegetal del Centro de Investigación

Agropecuaria Central del IDIAP, localizado en Divisa en la provincia de Herrera. Las

actividades de campo (recolecta de moscas blancas) para el establecimiento de cría, se realizó

en cultivo de tomate del IDIAP, variedad IDIAP - T9, localizado en la Estación Experimental

El Ejido, provincia de Los Santos, el 5 de junio de 2017.

La ejecución de actividades fue distribuida en dos etapas. 1) Establecimiento de cría de

insecto y puesta a punto de experimento 2)

Actividades realizadas

Recolección de las moscas

Se utilizaron aspiradores entomológicos, los adultos fueron recolectados del envés de las

hojas y llevados en envases plásticos de 100 ml, luego trasladados al insectario para su

liberación. Se recolectaron aproximadamente 500 moscas en el cultivo de tomate, para su

liberación en insectario. La recolección se realizó entre 8 y 11 am (Figura 3).

Cría de Mosca Blanca

Para la cría de insectos se utilizó el protocolo de Polston y Capobianco (2013), con

modificaciones que a continuación se describen:

Condiciones ambientales: la colonia de mosca blanca se estableció en el insectario localizado

en Departamento de Protección Vegetal del MIDA en Divisa (Figura 4). Las condiciones de

temperatura de 28 ° C, 70-80% aprox. de humedad relativa, y un fotoperiodo de 12 horas dio

lugar a una colonia que se desarrolla desde el huevo hasta la emergencia del adulto en 18

días. Como planta hospedante utilizamos la variedad de tomate de IDIAP – T6. Se realizaron

semilleros semanales para asegurar hospedantes suficientes para la mosca blanca. El sustrato

6
de semilleros de RibaSmith ® y para trasplante en maceta la mezcla de Miracle.Gro®, que

proporcionó los nutrientes requeridos para un buen desarrollo de la planta de tomate. Los

semilleros fueron colocados aislados en un anaquel acondicionado con luz artificial de

lámparas de 1200 lúmenes por 3 LED 3600 lúmenes, que le proporciona luminosidad ideal

para el crecimiento de la planta, 12 horas de fotoperiodo (Figura 5). A los 15 días de realizado

el semillero se realizó el trasplante a macetas plásticas hasta para luego ser utilizadas como

hospedante de la mosca. Las plantas fueron colocadas dentro de una jaula con mallas que las

protegían de otros insectos y animales (Figura 4). Las plantas sirvieron de hospedante para

evaluar los experimentos en estudio (Figura 5).

Jaulas: Las jaulas utilizadas tienen dimensiones de 60 x 60 x 60 cm., fueron construidas de

aluminio y malla anti – insectos que permiten la ventilación, la facilidad de acceso, capacidad

de impedir la fuga de la mosca blanca, y capacidad para albergar 6 macetas (Figura 6).

Liberación de las Mosca Blanca

El manejo de dispositivos de aspiración para recolección y manejo de moscas blancas

requeridos para fines experimentales dentro del insectario son similares a los descritos por

Polston y Capobianco, (2013) (Figura 7).

Prueba de dispositivo para uso en experimentos: Se diseñaron y realizaron dispositivos

(pequeñas jaulas), para uso en experimentos con botellas transparente de dos litros.,

acondicionados con tela de organza, que permite la circulación del aire (Figura 8). En total

se fabricaron 25 jaulas, cinco repeticiones de cada tratamiento a evaluar.

Diagnóstico Molecular de especie

Para la identificación molecular de la especie se utilizó el protocolo descrito por De la Rúa y

colaboradores (2006). El cual se describe a continuación:

7
Extracción de ADN total con CHELEX
1. Transferir a un vidrio de reloj un grupo de moscas blancas con la ayuda de un gotero,

colocando un insecto sobre el papel toalla para eliminar el exceso de alcohol.

Transferir el resto del insecto al vial correspondiente.

2. Transferir el insecto a un tubo de 1.5 ml.

3. Anadir 20 µl de CHELEX® 100(resina) 5% (BioRap) para mosca blanca y 40µl para

acido. Homogenizar el CHELEX antes de añadirlo.

4. Triturar el insecto con una punta de 200µl y mezclar con una pipeta.

5. Incubar en hielo inmediatamente agitar con vortex.

6. Incubar a 56ºc durante 15 min y 99ºc durante 3 min (Moscas Blancas) o 54ºc durante

15 min y 98. 8º c durante 7 min. Mantener a 4º c hasta que las muestras sean

recuperadas.

7. Incubar a -20ºc durante 5 min (se puede dejar más tiempo y no pasa nada).

8. Centrifugar a 10 min a 1400 rpm, 4ºc.

9. Recuperar a 10µl del sobrenadante de moscas blancas (con cuidado de no disturbar

el precipitado).

10. Almacenar a -20ºc.

Soluciones necesarias
CHELEX 5%

Para 100 ml disolver 5g de CHELEX® 100 (resina) (BioRad) en 80 ml de H2O destilada

estéril.

Cuando esté completamente disuelto lleve a un volumen de 100 ml. Almacenar a -20ºc en

alícuotas.

8
Observaciones
 El CHELEX es una resina y se puede almacenar a temperatura ambiente. No obstante,

una vez Re suspendido en H2O se debe almacenar a -20ºc en alícuotas, ya que se

degrada con el calor.

 Existen en el mercado varios tipos de CHELEX, pero el ideal para extracción de

insectos es el CHELEX® 100(resina), 200-400 mesh (BioRad).

 El volumen de CHELEX a añadir depende del tamaño del insecto.

 Las moscas blancas se almacenan muy bien en etanol al 96-98 % a temperatura

ambiente o en etanol al 70% a -20ºc.

A partir de las extracciones realizada, siguiendo el protocolo de De la Rua et al (2006), se

obtuvieron las muestras

Pesticidas
El tabaco para acabar con las plagas
Uno de los usos más comunes y eficaces es su efectividad como insecticida agrícola y esto

se debe precisamente a la presencia de nicotina en la planta. Mientras que los productos

químicos provocan efectos negativos en el medio ambiente, el tabaco ataca a las plagas sin

dañarlas a ellas, ni a las tierras donde se encuentren. Hay quienes recomiendan utilizarlo con

moderación, especialmente cuando se utiliza el tabaco de los cigarrillos, debido a que este es

mucho más tóxico que las hojas sin procesar y puede afectar también a los insectos que son

beneficio para las plantas. Las propiedades del tabaco como insecticidas son conocidas por

actuar en contra de las plagas como mosca blanca, gusanos y cochinillas que perjudican las

plantas. Pero, además, si lo combinas con otros productos, como el jabón, el efecto será

mayor y actuará también sobre hongos y otros bichos.

9
Se puede considerar que la hoja del tabaco está constituida por dos componentes esenciales:

el agua y la materia seca. El agua representa más del 80% del peso total de la hoja antes de

ser cortada y un 8% después del curado. La materia seca o ceniza está formada por

compuestos orgánicos (75%-80%) e inorgánicos (-25%) muy variados. La nicotina es el

principal alcaloide del humo y el determinante de la dependencia farmacológica, es uno de

los pocos alcaloides no oxigenados, y es incolora, oleaginosa, volátil e intensamente alcalina.

EL tabaco en polvo es un excelente abono orgánico, así como un producto repelente 100%

natural contra las plagas. Pero también es un producto insecticida, acaricida y fungicida ya

que se ha comprobado experimentalmente que la nicotina su principio activo, es tóxica para

una gran variedad de insectos, a los cuales mata por contacto.

Receta

Tome el tabaco, mejor si se trata de una variedad que sea fuerte, y hiérvalo en agua, luego

aplíquelo en las plantas con un atomizador, también se puede hacer directamente en las hojas,

para matar a los insectos. Antes de hacerlo asegúrese que la mezcla haya enfriado. Esta es

quizás la manera más sencilla de hacerlo

Fungicida Casero a base de hojas de Papayo (Carica De Papaya)

Las hojas de la papaya contienen sustancias lechosas, muy poco estudiadas, que al ser

aplicadas sobre las plantas inhiben o evitan el desarrollo de los hongos; a esto se suma el

hecho que, al prevenir de una fuente natural, no genera residuos de productos químicos sobre

los cultivos, pues se descomponen a los pocos días de su aplicación. Sin embargo, para evitar

que las sustancias fúngicas afecten a las personas más sensibles al consumir las hortalizas, se

debe evitar su aplicación hasta una semana antes de su consumo.

10
Materiales en insumos:

• 4 hojas frescas de papayo

• 1 litro de agua

• 1 colador

• 1 rociador de mano

• 1 Botella de plástico descartable de 1L

Modo de Preparación:

Se lavan las hojas para poder retirar el polvo que, a veces, suelen tener en su superficie; luego

se procede a cortarlas en trozos pequeños, estos se colocan en un envase y se cubre con agua

hasta completar litro, luego se tapa y se deja reposar o macerar por todo un día.

Una vez macerado se procede a tamizar la mezcla (separar la parte líquida de la sólida) con

un colador, de modo que se pueda aprovechar el líquido, el cual es de color amarillento; el

resto se puede utilizar como abono, enterrándolo en el suelo para que termine de

descomponerse.

Macerado de hojas de papaya

Este preparado se puede guardar dentro de la refrigerado por varios días en caso que se utilice

en su totalidad, sin embargo; sus propiedades curativas no van a ser las mismas que si se

utilizará fresco. Antes de usarlo se debe agitar para uniformizar la consistencia de la solución.

Para el uso de esta preparación se debe colocar el líquido dentro del rociador para que las

gotas finas se puedan adherir sobre los tejidos vegetales.

11
Para una correcta aplicación:

Este preparado se puede aplicar como preventivo (evita que la planta se enferme) o curativo

(apenas se observa la presencia de los hongos, pues aplicada en estadios iniciales es más

efectivo).

Se recomienda aplicar 1-2 veces cada semana cuando se observa la presencia del hongo, o

una vez por semana si es que se quiere evitar la presencia del hongo. Los resultados se van a

apreciar a los pocos.

La aplicación se debe realizar en las primeras horas de la mañana o últimas horas de la tarde,

para evitar que los rayos solares sequen el preparado y no logre proteger a la planta.

Durante la aplicación se debe aplicar en forma uniforme la parte superior de las hojas (haz)

y la parte inferior (envés); pues los hongos se desarrollan en ambas caras y muchas veces

esto no se toma en cuenta, por lo que no se logra un buen control.

12
Discusión y análisis, interpretación y aplicación de los resultados
Se logró el establecer una cría de mosca blanca virulífera, en Panamá. La identificación

taxonómica y molecular indica que la mosca criada en el insectario en plantas de tomate

corresponde a B. tabaci.

El virus que transmite fue identificado como Virus del Mosaico Amarillo de la Papa de

Panamá (PYMPV).

Estos virus no se multiplican en su vector, sin embargo, se mueven fácilmente a partir de una

planta a otra por la mosca blanca adulta por diversos medios (Cohen, 1990., Lapido, 2007).

Para la mayoría de estos virus depende de la alimentación de la mosca blanca y se requiere

para la adquisición e inoculación y muchos de estos virus no pueden ser fácilmente

transmitidos por otros medios (Polston y Capobianco, 2013). Por lo tanto, el mantenimiento

de moscas viruliferas para investigaciones en ecología, transmisión y evaluación de

insecticidas sintéticos, biológicos, selección de cultivares resistentes en programas de

mejoramiento, requieren del uso de la transmisión de virus por B. tabaci, por lo que este

producto es un aporte importante del presente trabajo.

Amplificación de fragmento de ~880-pb a la secuencia parcial de B. tabaci, respectivamente.

Línea 1, agua ultrapura estéril; Línea 2-4, organismos procedentes de la Provincia de

Chiriquí; Líneas 5-7 organismos procedentes de la Región de Azuero, Línea M, marcador de

peso molecular de 100-pb (AMRESCO).

13
Conclusiones

 La especie criada fue identificada molecularmente como B. tabaci.

 El virus que transmite la mosca criada es el Virus del Mosaico Amarillo de la Papa

de Panamá (PYMPV).

 Al terminar con los análisis de la mosca, los pesticidas que mejor resultados nos

dieron fue el fungicida a base de hoja de papaya y el de tabaco.

14
 Anexos

Figura 1 Imagen amplificación de fragmento de ~880-pb a la secuencia parcial de B. tabaci,

respectivamente. Línea 1, agua ultrapura estéril; Línea 2-4, organismos procedentes de la
Provincia de Chiriquí; Líneas 5-7 organismos procedentes de la Región de Azuero, Línea
M, marcador de peso molecular de 100-pb (AMRESCO).

Figura 2 Amplificación de fragmento de 743-pb correspondientes a la secuencia parcial de

la proteína de cubierta (CP) de PYMPV. Línea 1, agua ultrapura estéril; Línea 2, organismo
sano de B. tabaci; Líneas 3, organismo de B. tabaci con presencia de Virus utilizado como
control +; Líneas 4-6, organismos de B. tabaci procedentes de la Provincia de Chiriquí;

15
Líneas 7-9, Organismos B. tabaci procedentes de la Península de Azuero; Línea M,
marcador de peso molecular de 100-pb (AMRESCO).

Figura 3. Procedimiento de recolección de adultos de B. tabaci, con aspirador

Entomológico.

Figura 4. Vista del Infraestructura (insectario), lugar establecimiento de la cría de Bemisia

tabaci.

16
 Figura 5. Dispositivo de protección de semillero (de Tomate Variedad IDIAP – T6, hospedante de B.

tabaci) y crecimiento de plántulas.

(a) (b)

Figura 6. A) Vista de trasplante de plántulas de tomate variedad IDIAP – T6, hospedante de B. tabaci. B) Plantas
de tomate después de 2 semanas y media, para uso en experimento.

17
 (a) (b)

Figura 7. Vista de Plantas en diferentes etapas fenológicas A) Vegetativa B) Tutoreo, fuente de

alimentación y reproducción de B. tabaco.

Figura 8. Jaula de Aluminio utilizada para multiplicación de B. tabaci – hospedante planta de Tomate IDIAP –
T6.

18
 (a) (b)

Figura 9. Figura 7. A) Diferentes estados biológicos de B. tabaci ninfas y adultos en el envés de la hoja de
tomate (insectario) B) Aspirador Captura de adultos de Mosca blanca.

Figura 10. Modelo de mini jaula utilizada para las moscas blancas, uso en Bionsayos.

19
 (a)

(b) (c)
Figura 11 Figura.9. Vista de proceso de Diagnóstico Molecular junto al técnico del laboratorio. A) Recolecta
insectos y Extracción ADN B) PCR C) Electroforesis en Gel.

20
 Referencias
ABBOTT, W. S., 1925: A method of computing the effectiveness of an insecticide. J. Econ.

Entomoi, 18:265-267

Alvarado, L. Sánchez, J. Zachrisson, B. Fernandez, O. 2004. Distribución del biotipo B de

Bemisia tabaci en la zona central de Panamá. Rev. Manejo Integrado de Plagas y

Agroecología (Costa Rica). (2004). 71: 67-72 p.

Cohen, S. 1990. Epidemiology of whitefly-transmitted viruses. Whiteflies: Their Bionomics,

Pest Status and Management. Gerling, D. Intercept. 211-225 (1990).

De la Rua P, Simon B, Cifuentes D, Martines-Mora C, Cenis JL. 2006. New insights into

the mitochondrial phylogeny of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: aleyrodidade) in the

Mediterranean Basin. JZS (2006) 44 (1), 25-33.

Duffus, J. E. Whitefly-borne viruses. Bemisia: 1995 Taxonomy, Biology, Damage, Control

and Management. Gerling, D., Mayer, R. Intercept Limited. United Kingdom. 255-288

(1996).

Herrera-Vásquez, J. A., Ortega, D., Romero, A. B., Davino, S., Mejía, L. C., Panno, S. and

Davino, M. (2016), Begomoviruses Infecting Tomato Crops in Panama. J Phytopathol, 164:

102–113. doi:10.1111/jph.12436

Engel M, Fernández O, Jeske H, Frischmuth T. J. Gen. Virol. 1998. 79(10):2313-2317

doi:10.1099/0022-1317-79-10-2313.

Herrera-Vásquez JA, Ortega D, Romero AB, Davino S, Mejía LC, Panno S, Davino M, 2015.

First report of Tomato leaf curl Sinaloa virus infecting tomato crops in Panama. New Disease

Reports 31, 30. [http://dx.doi.org/10.5197/j.2044-0588.2015.031.030]

21
Lapidot, M. Screening for TYLCV-resistant plants using whitefly-mediated inoculation.

Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease. Czosnek, H. 329-342 (2007).

Lee W, Park J, Lee G-S, Lee S, Akimoto S-i (2013) Taxonomic Status of the Bemisia tabaci

Complex (Hemiptera: Aleyrodidae) and Reassessment of the Number of Its Constituent

Species. PLoS ONE 8(5): e63817. doi:10.1371/journal.pone.0063817

Polston, J. E., Capobianco, H. Transmitting Plant Viruses Using Whiteflies. J. Vis. Exp. (81),

e4332, doi:10.3791/4332 (2013).

Valderrama A, Velasquez A, Fernandez, O. 2002. Infección del Virus del rizado de las hojas

del tomate (ToLCV-Pan) por Bemisia tabaci en Panamá. Rev. Manejo Integrado de Plagas

y Agroecología (Costa Rica) No. 64 . 6 7 - 7 1 p.

22