Universidad Autónoma de Yucatán

Facultad de Ingeniería Química

Ingeniería en Biotecnología

Asignatura:
Microbiología Industrial

Practica No. 1: Efecto de las condiciones

ambientales en el crecimiento microbiano

​Equipo 2:

Gabriel Eduardo López Acopa

Angel Rafael Pool Cen
Norma Margarita Pech Baas

Fecha de entrega:
18 de Septiembre de 2018
 Efecto de las condiciones ambientales en el crecimiento microbiano
Resumen
En la naturaleza, así como en condiciones de laboratorio, la actividad de los microorganismos está regida por las
variables ambientales tales como: pH, temperatura, presión osmótica, humedad, radiaciones, tipo y concentración de
sustancias químicas. Por lo que el conocimiento del efecto de estas variables sobre el desarrollo de los
microorganismos permite controlar el crecimiento de los mismos, ya sea para favorecer o limitar su desarrollo o bien
para eliminarlos de un área o producto contaminado.
Introducción
Las condiciones ambientales influyen de manera
importante en el crecimiento de microorganismos. Por
lo tanto, al preparar un medio de cultivo es prioritario
asegurarse de que éste proporciona al microorganismo
los nutrientes y precursores que requiere para su
metabolismo.
No todos los microorganismos presentan la misma
reacción ante una determinada condición ambiental,
en consecuencia, ciertas condiciones que pueden ser
nocivas para un microorganismo en particular también
pueden ser beneficiosas para otro tipo de microbio.
Es posible identificar una gran cantidad de factores
ambientales que afectan de manera positiva o negativa
el crecimiento microbiano, no obstante, tres
condiciones destacan por su relevancia al controlar el
crecimiento: el pH, la temperatura y la disponibilidad
de oxígeno.
El género Lactobacillus es el género más grande y
quizás el más importante de las bacterias del ácido
láctico, cuyos representantes juegan un papel
importante en el tracto gastrointestinal humano y
animal. Además, los lactobacilos representan uno de
los principales grupos implicados en la fermentación y
contribuyen a la conservación de los alimentos
(Coeuret et al., 2003; Holzapfel 2002).
Dentro del género ​Lactobacillus, L. plantarum es una
especie heterogénea y versátil que se encuentra en
una variedad de nichos ambientales, que incluyen
productos lácteos, carne y muchas fermentaciones de
plantas o vegetales. Es de un grupo de lactobacilos
mesófilos que puede convertirse en el microorganismo
dominante en varios tipos de queso durante la
maduración (Hynes et al., 2003; Rantsiou et al., 2008;
Sánchez et al., 2005). Su predominio también se ha
documentado en diferentes productos lácteos
fermentados tradicionales africanos, como Ititu
(Kasseye et al., 1991), Gari (Kostinek et al., 2005b) y
Kule Naoto (Mathara et al., 2004, 2008). ​Lactobacillus
plantarum también tiene un papel como un potencial
organismo probiótico. Aunque las definiciones de
bacterias probióticas originalmente incluían cepas de
origen intestinal, actualmente, muchas bacterias
lácticas no iniciadoras, algunas no lácticas (Holzapfel
et al., 1998) y también algunas levaduras,
especialmente ​Saccharomyces boulardii,​ se usan en
productos probióticos comerciales. Por esta razón, la
búsqueda de cepas que muestran resistencia a las
barreras biológicas del tracto gastrointestinal humano y
que poseen características fisiológicas compatibles
con las propiedades probióticas puede conducir
finalmente al hallazgo de nuevas cepas probióticas
para los productos lácteos funcionales.
Objetivo
Evaluar la influencia del pH, temperatura y oxigenación
en el crecimiento microbiano del ​Lactobacillus
plantarum ATCC 8014​.
Metodología
La práctica se dividió en tres sesiones llevadas a cabo
los días, martes 4, jueves 6 y viernes 7 de septiembre.
Las muestras se tomaron, aproximadamente a las 0,
48 y 72 hrs.
En la primera sesión se llevó a cabo la inoculación y
posterior incubación. Se trabajó con 8 tubos (cada uno
con 10 mL de medio de cultivo) de los cuales 6 se
inocularon con 20μL del pre-cultivo de ​Lactobacillus
plantarum ATCC 8014 proporcionado por el
laboratorio. Los otros dos tubos fueron de control de
las diferentes condiciones ambientales.
Se llevaron a incubación los tubos inoculados de
acuerdo a las siguientes condiciones mostradas en el
cuadro 1.
 Resultados
Temperaturas:
pH: 7 Sin agitación
25, 35 y 45°C
Evaluación de pH
Temperaturas: Con agitación
pH: 7 Se determinó mediante el uso de tiras de ph,
25, 35 y 45°C (200 rpm)
obteniendo los resultados del cuadro 2.
Cuadro 1. Condiciones de cultivos.

pH

En cada tiempo se tomaron las siguientes muestras: 1

Muestra 0 hrs. 48 hrs. 72 hrs.
mL para la determinación de crecimiento por
turbidimetría y 1 mL para la determinación de proteína
(Método de Bradford). Para el tiempo cero, solo se Reposo 25°C 7 - 3.84
requirió tomar las muestras para la determinación de
proteína, Reposo 35°C 7 - 3.94

En la segunda sesión se realizó el segundo muestreo Reposo 45°C 7 - 6.64

para análisis de crecimiento por turbidimetría y de
determinación de proteína por el método de Bradford.
Agitación 25°C 7 - 3.94
de igual modo se midió el pH de los cultivos usando
tiras de pH.
Agitación 35°C 7 - 3.81
En la tercera y última sesión se realizó el muestreo
final, se realizaron los análisis de turbidimetría y Agitación 45°C 7 - 6.83
determinación de proteína por el método de Bradford y
se midió el pH de los cultivos usando tiras de pH y el Cuadro 2. pH obtenidos de las muestras de cultivos de ​Lactobacillus
potenciómetro para tener una idea más clara del pH plantarum ATCC 8014.​

verdadero.
Crecimiento celular
Para la turbidimetría se ajustó la absorbancia del
Se determinó el crecimiento celular por medio del
espectrofotómetro a 540 nm, se tomó 1 mL del medio
método de turbidimetría, se midieron absorbancias
de cultivo sin microorganismos y se ajustó a cero de
con un espectrofotómetro a 540 nm, los resultados se
absorbancia, posteriormente se tomaron las muestras
registraron en el cuadro 3.
de 1mL obtenidas en los tres días de muestreo, se
colocaron en el espectrofotómetro y se anotaron las Turbidimetría (absorbancia)
absorbancias obtenidas.
Muestra 0 hrs. 48 hrs. 72 hrs.
Para la cuantificación de proteínas por el método de
Bradford se tomaron los tubos eppendorf que
contenían 1 mL de muestra, y se centrifugaron a 1300 Reposo 25°C - 0.200 0.209
rpm por 10 minutos. Posteriormente se desechó el
sobrenadante. Se adicionó 1mL de NaOH a 0.5M y se Reposo 35°C - 0.110 0.102
resuspendieron las pastillas con ayuda del vortex, a
continuación se llevó a calentamiento térmico a 70°C Reposo 45°C - 0.014 0.032
por 5 min, al terminar se tomaron 100μL y se le agregó
1mL de reactivo de Bradford, para un volumen total de Agitación 25°C - 0.250 0.148
1.1mL, posteriormente se dejaron reaccionar por 10
min. evitando la exposición a la luz, al término del Agitación 35°C - 0.142 0.142
tiempo, se colocaron cada una de las muestras en el
espectrofotómetro previamente ajustado a 595 nm y se Agitación 45°C - 0.044 0.016
anotaron los resultados.
Cuadro 3. Absorbancias obtenidas de las muestras de cultivos de
Lactobacillus plantarum ATCC 8014.
Para una mejor comparación de los datos obtenidos se 6 20 0.497
realizó una representación gráfica de las muestras.
7 25 0.633
Como se puede observar en la figura 1 y 2.
Cuadro 4. Curva de calibración para la determinación de proteína.

Figura 1. Representación gráfica del crecimiento de ​Lactobacillus

plantarum ATCC 8014 en relación a la absorbancia respecto al Figura 3. Representación gráfica de la curva de calibración en
tiempo de las muestras en reposo.
relación a la absorbancia respecto a la concentración de BSA​.

El valor de la muestra 1 se omitió por ser un valor que

se aleja considerablemente de la curva.

La curva de calibración obtuvo una r​2 de 0.9941 lo que

Figura 2. Representación gráfica del crecimiento de ​Lactobacillus
plantarum ATCC 8014 en relación a la absorbancia respecto al
tiempo de las muestras en agitación.
nos dice que ésta es confiable porque las
probabilidades que sea errónea son del 0.59%, esto
quiere decir que ésta se puede usar para poder
determinar la cantidad de proteína presente en las
muestras, la ecuación para el cálculo de concentración
fue y = 0.0244x + 0.00828, donde “x” es la
concentración en μg/μL y “y” es la absorbancia
obtenida del muestreo.
Se determinó la absorbancia de cada muestra con
ayuda del espectrofotómetro a 595 nm:

Determinacion de proteina Determinación de proteína (absorbancia)

Para determinar la cantidad de proteína presentes en

Muestra 0 hrs. 48 hrs. 72 hrs.
la muestra, se efectuó una curva de calibración usando
albúmina sérica bovina (BSA):
Reposo 25°C - 1.470 1.528

Concentración de Absorbancia
Muestra Reposo 35°C - 1.116 1.424
BSA (μg/μL) (nm)

0 0 0.000 Reposo 45°C - 0.177 0.233

1 0.5 -0.310
Agitación 25°C - 1.650 1.270
2 1 0.039
3 5 0.147 Agitación 35°C - 1.545 1.547
4 10 0.257
Agitación 45°C - 0.219 0.220
5 15 0.338
Cuadro 5. Absorbancias obtenidas de las muestras de cultivos de
Lactobacillus plantarum ATCC 8014.
Una vez obtenida la ecuación de la curva de
calibración, se procedió a determinar los valores de la
concentración de proteínas en las muestras:
Concentración de proteína (μg/μL)
Muestra 48 hrs. 72 hrs.
Reposo 25°C 56.844 59.221
Reposo 35°C 42.336 54.959
Reposo 45°C 6.914 9.209
Agitación 25°C 64.221 48.648
Agitación 35°C 59.918 60.000
Agitación 45°C 8.635 8.676
Cuadro 6. Concentración de proteína en correspondientes a las
muestras​.
Discusiones
En la Figura 1 y 2 se reporta el crecimiento celular de
las diferentes muestras de ​Lactobacillus plantarum.
Se puede apreciar un aumento en los valores de
absorbancia con respecto al tiempo, teniendo en
algunos casos una fase estacionaria, que se relaciona
directamente con un incremento en la cantidad de
microorganismos en el medio de cultivo.
Se observa que las muestras que tuvieron un mayor
crecimiento celular fueron las que se encontraban en
reposo a temperatura de 25°C, sin embargo la
diferencia con las que estuvieron en agitación no varió
significativamente.
A las 48 horas, la producción de proteínas reportada
en el Cuadro 5 alcanzó su punto máximo, en ciertas
ciertas condiciones, en especial las que estuvieron en
agitación. Esto puede deberse a que al haber agitación
hay una mayor transferencia de masa que permite la
mejor asimilación de nutrientes. Sucede lo contrario a
las 72 horas, en el que pudimos observar que no hubo
aumento significativo y se mantuvo sin variación
alguna. Después de éste tiempo la producción de
proteína se ve favorecida en los cultivos en reposo, la
razón por la que se reportan estos resultados se debe
a que al formar estas células colonias y agregados
celulares es probable que se generen relaciones de
mutualismo y comensalismo entre las mismas células
incrementando la producción de proteínas​. Una
consecuencia directa de esto durante la fase
estacionaria es que la fuente de alimento se consumirá
más rápido, generando que estos microorganismos
comiencen a competir entre sí llegando a la fase de
muerte de forma acelerada como se reportan en la
Figura 1 y 2.
Respecto al pH, podemos ver una disminución
considerable entre la muestra del día cero a la del día
final, esto debido a la producción de ácido láctico por
parte del lactobacilo.
Conclusión
Fue posible evaluar la influencia de diferentes
parámetros en la producción de proteínas y
crecimiento celular en el microorganismo ​Lactobacillus
plantarum. ​Se concluye que para aumentar la
producción de proteínas en este microorganismo es
necesario la formación de agregados celulares.
Sin embargo si lo que se busca es un incremento en el
crecimiento celular, la formación de agregados
celulares traería como consecuencia un efecto
contrario al deseado. Por lo que sería necesario hacer
estudios posteriores según las necesidades del
experimento para optimizar la producción de proteínas
o crecimiento celular monitoreando la formación de
agregados celulares, los valores del pH, temperatura,
agitación y oxigenación con un mayor número de
ensayos a los reportados en este experimento.
Los resultados obtenidos al medir el pH sugieren que
L. plantarum es capaz de sobrevivir al pH del
estómago, esto podría resultar especialmente útil si se
busca diseñar algún tratamiento orientado a la
microbiota intestinal.
Bibliografía
“PRÁCTICA: CONDICIONES AMBIENTALES PARA
EL DESARROLLO, INHIBICIÓN Y DESTRUCCIÓN
DE LOS MICROORGANISMOS”
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/PRACTICA
DEFACTORESFISICOSYMETABOLISMO_22368.pdf

“Diversity and functional properties of Lactobacillus

plantarum-group strains isolated from Italian cheese
products”, M. Barbara Pisano & Francesca Patrignani
& Sofia Cosentino & M. Elisabetta Guerzoni & Charles
M. A. P. Franz & Wilhelm H. Holzapfel

Jurado-Gámez, H., & Ramírez T, C., & Martínez B, J.

(2013). Evaluación in vivo de Lactobacillus plantarum
como alternativa al uso de antibióticos en lechones.
Revista MVZ Córdoba, 18 , 3648-3657

Product Sheet: Lactobacillus plantarum (ATCC®

8014™)