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“Balance de fermentación.”
Integrantes:
Esquivel Arvizú Lizbeth
García Paredes Jazmín
Martínez Arce Claudia Lizethe
Morán Carpio Abigail
Vilchis Torrez Joel David
Grupo 5IV1
Sección 1
Profesores:
Susana Alfaro Aguilar
Eduardo Montoya Díaz
Diseño experimental.
Se realiza un micro-ensayo de fermentación con Saccharomyces cerevisiae, utilizando glucosa como sustrato,
en el cual se cuantificará los productos obtenidos: etanol y dióxido de carbón, así como la glucosa residual.
Método de Conway
Se basa en el poder oxidante del dicromato de potasio (K2Cr2O7) en ácido sulfúrico (H2SO4), el Cr2O7= de color
amarillo-naranja produce, por reducción, al ión cromoso de una tonalidad verde-azul que es oxidado
cuantitativamente ácido acético (CH3COOH) y agua.
El ión reducido es colorido, se puede leer en el espectro visible a 445nm debido a que ésta es la longitud de
onda máxima a la que absorbe el dicromato de potasio. Lo que se lee realmente es el dicromato que no
reaccionó, ya que al aumentar la concentración de etanol aumenta el cromato. La gráfica resulta ser una recta
cuya pendiente es negativa.
A partir de la formación de bicarbonato de sodio por la reacción del CO2 con el NaOH se pone a reaccionar con
BaCl2 se forma el precipitado BaCO3 que se recolecta en papel filtro y por diferencias de pesos entre el papel
filtro sin el precipitado y el papel filtro con el precipitado se obtiene la cantidad de precipitado que en base a la
conversión por un factor gravimétrico se cuantifica la cantidad de CO2 producido durante la fermentación.
CO2 BaCO3
Se realizara por medio del método del DNS. El cual se basa en la reducción del DNS (color amarillo) por la
Glucosa (azúcar reductor) al acido 3-amino-5-nitrosalicilico (Fig. 1) de color rojo previo calentamiento por 10
min en baño maría en ebullición. El cual el 3-amino-5-nitrosalicilico es equivalente a la concentración de
glucosa en el medio, siendo así que se leerá la absorbancia a 540nm en el espectrofotómetro.
Reactivo Función
Agua detilada libre de CO2 Realizar los lavados del precipitado formado por el método de
gravimetría para la determinación de CO2.
Cloruro de bario al 5% en agua Forma un precipitado (BaCO3) con el CO2, para ser determinado por
libre de CO2 gravimetría.
Dicromato de potasio Agente atrapante de etanol, este realiza una oxidación sobre el etanol
Glucosa 100 mg/mL Se realiza la curva tipo para determinar la glucosa residual.
Etanol 1500mg/mL Se realiza la curva tipo para la derminación de etanol por el método de
Conway.
Objetivos generales.
Realizar un micro ensayo para la fermentación de glucosa por la levadura Saccharomyces cerevisae
para la cuantificación de sus productos.
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Llevar a cabo un proceso de fermentación utilizando una levadura de uso industrial y conocer la
eficiencia de dicho proceso.
Objetivos específicos.
Cuantificar los productos de interés liberados durante un proceso de fermentación (etanol y dióxido
de carbono) a través del método de Conway, para el caso del etanol y gravimetría, para el caso de CO2.
Realizar un balance de fermentación utilizando los datos obtenidos experimentalmente.
Determinar la pérdida de carbono efectuada durante el proceso de fermentación de Saccharomyces
cerevisiae.
Registro de datos.
µg de etanol Absorbencia a
445nm
0 1.075
250 0.979
500 0.849
1000 0.691
1500 0.520
2000 0.432
2500 0.220
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Gráfica 1. Curva tipo de etanol preparada de 0 a 2500µg de
etanol para el método de Conway leído a 445nm.
1.200
1.000
y = -0.0003x + 1.0453
0.800
R² = 0.9899
A 445 nm
0.600
0.400
0.200
0.000
0 500 1000 1500 2000 2500
µg de etanol
µg de Absorbencia a
glucosa 540nm
0 0
100 0.188
200 0.405
300 0.656
400 0.883
5
500 1.098
y = 0.0022x - 0.0207
0.8 R² = 0.9986
A 540nm
0.6
0.4
0.2
0
0 100 200 300 400 500
µg de glucosa
Muestras Absorbencia a
540nm
0.2 mL de sobrenadante diluido 1:10
0.4 mL de sobrenadante diluido 1:20 0.325
1 mL de sobrenadante testigo sin diluir 0.221
5. Determinación de CO2
Manejo de datos.
r2=0.9899
a=-3.28x10-3
b = 1.0445
𝑦−1.0445
Despeje de x x=
−3.28𝑥10−3
Se sustituyen los datos de A (445nm) obtenidos en la tabla anterior en la ecuación de la recta obtenida de la
curva tipo de Etanol.
Problema:
Alícuota 0.2ml:
Alícuota 0.4ml:
Testigo:
95.351 + 37.614 𝑚𝑔
promedio = = 66.483
2 10𝑚𝑙
Y se obtiene al fin el número de moles deEtanol formado en la fermentación en mmoles, tomando en cuenta
que se tienen 46mg/mol de Etanol teóricamente:
𝑚𝑔
62.483 ×1𝑚𝑚𝑜𝑙
𝑚𝑙
𝑛 = 𝑚𝑔 = 1.358𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐸𝑡𝑂𝐻
46
𝑚𝑙
n=1.358mmol de EtOH
r2=0.999
a= 2.236x10-3
b = 0.0206
𝑦−0.0206
Despeje de x x=
2.236𝑥10−3
Se sustituyen los datos de A (540nm) obtenidos en la tabla anterior en la ecuación de la recta obtenida de la
curva tipo de Glucosa.
Testigo:
Se obtiene la glucosa fermentada, tomando en cuenta que se tienen 180mg/ml de Glucosa inicial:
Glucosa inicial:
3. Determinación de CO2.
Se resta BaCO3 testigo a BaCO3 de fermentación para después multiplicarlo por el factor gravimétrico y obtener
con este el número de moles de BaCO3 obtenidos en la fermentación.
(0.074𝑔) (1000𝑚𝑔)
𝐵𝑎𝐶𝑂3 𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑐𝑖ó𝑛 − 𝐵𝑎𝐶𝑂3 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 = 0.113 − 0.039 = 1𝑔
= 74 𝑚𝑔
𝑔
74 𝑚𝑔𝐵𝑎𝐶𝑂3 × 𝑓𝑔 = (74𝑚𝑔 ) (0.223 ) = 16.503 𝑚𝑔 𝐶𝑂2
𝑚𝑜𝑙
16.503𝑚𝑔
𝑛= = 0.375𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐶𝑂2
44𝑚𝑔
𝑛 = 0.375𝑚𝑚𝑜𝑙 𝑑𝑒 𝐶𝑂2
4. Balance de fermentación.
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1 (mmol) 2 (mmol) 3 4 5 6 (mmol) N° de C
Fuente de
Carbono
Glucosa 0.663 1 0 6 6
Productos
EtOH 1.358 2.048 -2 -4.096 4.096 2
Σ= 4.662
Columna 3: H=-0.5 O= +1
H = -0.5 X 6 =-3 O = +1 X 2 = +2
O = +1 X 1 = +1
Σ = -2
Columna 6:
1 mmol x 6= 6mmol
2.048mmol x 2= 4.096 mmol
0.566 x 1 = 0.566 mmol
X=77.7 %
Discusión.
Cuando en una fermentación se producen varios productos finales la bacteria dispone de diferentes
alternativas para reoxidar del NADH, no existe a priori una estequiometria definida. En cada caso concreto,
según sea la bacteria y las condiciones de cultivo, puede cuantificarse tanto el consumo de glucosa (u otro
sustrato) como la producción de productos finales I.
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Las levaduras como microorganismos quimioheterótrofos, necesitan compuestos orgánicos como fuentes de
carbono y energía (FCE). Los glúcidos, principalmente las hexosas, son los compuestos más utilizados como FCE
tanto para el metabolismo aeróbico como anaeróbico VIII.
Por lo anterior podemos decir que S. cereviciae, en condiciones de anaerobiosis, por cada mol de glucosa
produce 1 mol de Dióxido de carbono y 1 mol de etanol, por esta razón nuestros cálculos dependen de muchos
factores, tales como el método y los errores cometidos durante su ejecución.
Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis (fermentación del pulque) y otras levaduras como Leuconostoc
descomponen la glucosa para producir etanol, reoxidando NADH aunque cabe mencionar que la
estequiometria varía dependiendo el microorganismo, pues teóricamente no tienen la misma relación de
productos oxidados y reducidos y en la práctica estos pueden variar aún más.
Los balances de fermentación son esenciales para su aplicación en la industria, el principal objetivo del análisis
de las fermentaciones es el de dirigir tanto carbono como sea posible desde un sustrato hacia un producto
metabólico de importancia industrial, y obtener el máximo rendimiento posible. VIII
Ahora bien en la práctica se realizo un microensayo de una fermentación alcohólica, una de las fermentaciones
que solo tiene dos productos metabólicos: el etanol y el dióxido de carbono. Los cuales se les determinó su
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concentración por los métodos de Conway y gravimétrico, respectivamente, para conocer el % de carbono
recuperado en el proceso fermentativo, así como también se determinó la concentración de glucosa
fermentada. Estos métodos pueden presentar interferencias que afectan los balances de fermentación.
El método de Conway, como ya hemos mencionado, se basa en la oxidación del alcohol por acción de una
solución de dicromato de potasio en medio ácido por ácido sulfúrico. El alcohol es oxidado cuantitativamente a
ácido acético y el dicromato es reducido a cromo trivalente, de acuerdo con la siguiente reacción.
En cuanto a la manera en que fue llevado a cabo el experimento, podemos decir que fue adecuada, ya que se
estuvo al tanto de que no se mezclaran el contenido de la cámara central (K2Cr2O7), con el contenido de la
cámara externa (H2SO4 y K2CO3) y se procuró recuperar la mayor cantidad posible de K2Cr2O7.
La ventaja del método de Conway, es que el material y el equipo que se utiliza para la determinación es más
accesible, aunque también presenta una fuerte desventaja, ya que es relativamente inespecífico, ya que otros
alcoholes, cetonas y aldehídos reducen el dicromato, así como también existe la posibilidad de la
descomposición del dicromato por exposición a la luz y considerando que es un método indirecto de oxido
reducción colorimétrico y depende del complejo colorido que se forma por la reacción del dicromato con el
etanol, éste no es muy estable, con lo que se pierde la intensidad del color y el complejo colorido no tiene la
misma absorción por lo que produce una señal distinta a la inicial y existe pérdida.
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Otra situación a considerar por pérdida es que el etanol presenta una elevada presión de vapor, en donde es
parcialmente miscible y la presión atmosférica es relativamente baja. Otras formas para determinar etanol son:
Cromatografía de gases
Micro difusión
Titulación
Si bien los métodos sugeridos requieren del tratamiento previo el que podría presentar mayores
inconvenientes sería la determinación por medio de una titulación, ya que presenta “interferencias” en el
método, al no ser específico para un sola especie química y en general para un cambio de vire solo depende el
pH.
Asimismo, la relación de productos oxidados entre productos reducidos es de 0.276 (donde el producto
oxidado es CO2 y el reducido es el CH3CH2OH), lo que significa que existe mayor cantidad de productos
reducidos que de oxidados y a sabiendas de que para determinar la cantidad de CO2 se realizó por un método
gravimétrico, podemos pensar que de entrada, el CO2 no se capturó totalmente en el NaOH acuoso y por
consiguiente en los lavados no se encontraría el CO2 en su totalidad, también podemos considerar como una
pérdida con sólo destapar el matraz microfermentador ya que el gas contenido en este es CO2. Sabiendo que se
trata de un método gravimétrico, también se puede considerar que hay pérdidas al momento de realizar los
lavados, ya que pudieran quedar trazas de BaCO3 en el matraz y obviamente estas no son cuantificadas.
Viendo las anteriores situaciones podemos considerar que la relación entre la cantidad de productos oxidados
y reducidos (O/R) no es cercana a uno debido a que durante las determinaciones para cada producto, pudieron
haber tenido pérdidas de producto en la determinación de la relación, y podemos corroborarlo con nuestro por
ciento de carbono recuperado.
Tomando en cuenta, la citas bibliográficas y los antecedentes, podemos dar análisis de la pérdida de producto
que existió o que delimitó la cuantificación total de los productos en medida de la glucosa que se añadió para
obtener etanol y dióxido de carbono y deducir que las variaciones presentadas por la relación de los productos
oxidados y reducidos se debió meramente a errores aleatorios tanto del método como de los analistas,
sabiendo que Saccharomyces cerevisiae se encontraba en las condiciones óptimas para llevar a cabo la
fermentación.
Conclusiones.
El índice O/R fue de un valor de 0.276 donde el producto oxidado es CO2 y el reducido es el CH3CH2OH
por lo que no se llevó a cabo un flujo de carbonos correspondiente únicamente a la fermentación
alcohólica.
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La recuperación de CO2 fue deficiente al tener un rendimiento de 77.7% con respecto a los intervalos
establecidos de 87-95%
Los errores en la fermentación representados en el balance de fermentación pudieron verse en su
mayoría por errores de los analistas al formarse más producto reducido durante la fermentación.
La fermentación por Saccharomyces cerevisiae debido al análisis de sus productos fue una
fermentación alcohólica.
Para un mejor balance de fermentación para la cepa utilizada S. cerevisiae es necesario utilizar equipos
para evitar su pérdida de gas y un equipo que se encuentre estable para su óptimo manejo.
Referencias bibliográficas.
I. Parés I Farras, R., y et. al., “Bioquímica de los microorganismos”. Editorial Reverté, España. 1997. pp.
79-81.
II. Brock J.” Biología de los microorganismos”.10° ed., Editorial Pearson Prentice Hall, pp. 585-587.
III. Voet D. Voet J. G. “Bioquímica”. 3ra ed., Editorial John Wiley and Sons. 2004., pp. 343, 476-480.
IV. Lehninger A.L., “Principios de bioquímica”., 4ta ed., Editorial Omega. 2005., Pp.: 538-542.
V. Rose. A. H., “Microbiología química”., Editorial Alhambra., Pp.: 242-49
VI. Togores. J.H., “Tratado de enología”., 2da ed., Editorial Mundi-Prens. 2010., Pp.: 569.
VII. Schlegel. H.G., “Microbiología general”, Nueva ed., Editorial Omega., 1997., Pp.: 292, 295-2966, 300.
VIII. Mercedes Ferreyra, María., 2006, Tesis Doctoral, “Estudio del proceso biotecnológico para la
elaboración de una bebida alcohólica a partir de jugo de naranja”, Facultad de Ciencias de la
Alimentación. UNER, Universidad Politécnica de Valencia. Departamento de Tecnología de alimentos.
IX. Ralph S. Becker y Wayre G. Ventwort, “Química General”, Ed. Reverté. Madrid.1997, pp. 521-523.
X. O. Soto Cruz, J. Páez Lerma, Art. “Balances en procesos de fermentación: Análisis de consistencia y
flujos metabólicos”. Revista mexicana de ingeniera química Vol. 4. México, 2004, pp. 59.
XI. Vázquez, H. J., y Dacosta O. “Fermentación alcohólica: Una opción para la producción de energía
renovable a partir de desechos agrícolas”, UAM Unidad Azcapotzalco, Departamento de Sistemas,
México, Mayo 2007.
XII. Thomas M. Devlin, 2004, “Bioquímica: libro de aplicaciones clínicas”, 4ta edición. Ed. Reverte España,
pág. 657-659
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