El nitrógeno molecular o dinitrógeno, componente
mayoritario de la atmósfera, es inerte y no
aprovechable directamente por la mayoría de los seres vivos. La fijación biológica del nitrógeno atmosférico, consistente en la reducción de N2 a NH4+ realizado mediante la actividad catalítica de la enzima Nitrogenasa, es, después de la fotosíntesis, la ruta metabólica más importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera. Curiosamente, este proceso crucial sólo puede ser llevado a cabo por unos pocos grupos de seres vivos, todos ellos procariotes (Sprent J. y Sprent P., 1990). La atmósfera es el principal reservorio de nitrógeno, donde constituye hasta un 78 % de los gases. Sin embargo, como la mayoría de los seres vivos no pueden utilizar el nitrógeno atmosférico para elaborar aminoácidos y otros compuestos nitrogenados, dependen del nitrógeno presente en los minerales del suelo. Por lo tanto, a pesar de la gran cantidad de nitrógeno en la atmósfera, la escasez de nitrógeno en el suelo constituye un factor limitante para el crecimiento de los vegetales. Fijación Biológica. El término fijación del Nitrógeno se usa normalmente para definir la fijación de Nitrógeno por bacterias, libres o en asociación simbiótica. Este tipo de fijación de Nitrógeno desde el estado gaseoso a la forma orgánica se lleva a cabo biológicamente por microorganismos especializados: cianobacterias (algas verdes-azules) y bacterias (por ejemplo, rhizobium y frankia) que convierten el N2 en otras formas químicas (amonio y nitratos) asimilables por las plantas. Fijación Físico-química. Existen otros mecanismos de fijación de Nitrógeno en que no participan los microorganismos, sino que es realizada por reacciones de tipo electroquímico (tormentas eléctricas) y fotoquímico (reacciones entre el ozono y el N2 atmosférico). Fijación Antropogénica. Pero lo que es más importante aún, el término fijación también incluye la realizada por actividades humanas (producción de energía, producción de fertilizantes y cultivos) que produce Nitrógeno reactivo� (NOX, NHY y N orgánico). Los microorganismos fijadores de nitrógeno no constituyen un grupo taxonómico homogéneo, la única característica que comparten es la presencia de la enzima Nitrogenasa. Dichas bacterias comprenden organismos fotótrofos, como bacterias pertenecientes a la familia Rhodospirillaceae, Clorobiaceae y Cianobacteriae; organismos quimio autótrofos, como bacterias de los géneros Thiobacillus, Xanthobacter y Desulfovibrio y organismos heterótrofos como las bacterias pertenecientes a la familia Frankiaceae, al grupo Rhizobiaceae y a los géneros Azotobacter, Enterobacter, Klebsiella y Clostridium. Estos organismos pueden realizar la fijación biológica de nitrógeno ya sea independientemente (a excepción de las rizobiáceas) o estableciendo relaciones simbióticas con otros organismos. Para poder disminuir la dependencia a fertilizantes nitrogenados que está adquiriendo la agricultura mundial se han propuesto varias alternativas que abarcan desde la modificación genética de las plantas a la optimización y mejora de la fijación biológica de nitrógeno. La realizan algunas bacterias libres o asociadas en simbiosis a vegetales y ciertas arqueobacterias. Es un proceso que globalmente tiene una variación relativamente baja de energía libre (-8 kcal/mol) pero la particular rotura del triple enlace que une a los dos átomos de Nitrógeno exige a la Nitrogenasa reductasa recibir un potencial reductor de apoyo (-1.200 mv) que parece sorprendentemente alto, equivalente a una variación de energía libre de +50 kcal/mol. Este potencial es el mas alto de los conocidos entre los procesos de óxido reducción biológica. A pesar de los problemas que plantea, el sistema es tan eficaz que se ha constituido en la principal fuente natural de entrada de N en la biosfera. La fijación de N2 es un proceso redox estrictamente anaerobio. Lo cataliza un complejo ferro-enzimático denominado Nitrogenasa, tan importante que la naturaleza nos muestra tres tipos: Tipo I. Es el sistema más eficiente y el más frecuente. Se conforma en medios donde hay suficiente molibdeno Tipo II. Propio de bacterias que como el Azotobacter, crecen en medios donde no hay Molibeno y el Vanadio le sustituye. Tipo III. Se conforma en medios donde existe una carencia simultánea de Molibdeno y Vanadio. El Azotobacter también puede expresar este complejo. Es el sistema menos eficiente de los tres. Las proteínas fierro azufre de alto potencial (HiPIPs) son una familia sui generis de ferredoxinas Fe4S4 que funcionan en las cadenas anaeróbicas de transporte de electrones. Algunas de estas HiPIPs poseen un opotencial redox más alto que cualquier otra proteína fierro-azufre conocida (Vgr., HiPIP de Rhodopila globiformis tiene un potencial redox de ca. 450 mV). Como en otras ferredoxinas bacterianas, los grupos [Fe4S4] adoptan una conformación cubiforme y están unidas a las proteínas por medio de cuatro residuos de Cys. La fijación en general supone la incorporación a la biosfera de una importante cantidad de nitrógeno, que a nivel global puede alcanzar unos 250 millones de toneladas por año, de las que 150 corresponden a la fijación biológica. La fijación biológica es un proceso altamente consumidor de energía que ocurre con la mediación de la enzima Nitrogenasa según la siguiente ecuación: N2 + 16ATP + 8e- + 8H+ ―> 2NH3 + 2H2 + 16ADP + 16Pi La Nitrogenasa está bastante bien conservada en todos los microorganismos fijadores, y está constituida por dos metaloproteínas: ferroproteína y molibdoferroproteína,. Complejo Enzimático de la Nitrogenasa Aunque el amoniaco (NH3) es el producto directo de esta reacción, es rápidamente ionizada a amonio (NH4+). En diazótrofos de vida libre, el amonio de la Nitrogenasa es asimilada en glutamato a través del ciclo de síntesis Glutamina Sintetasa/glutamato. Tensiones bajas de oxígeno parecen ser indispensables para el funcionamiento de la Nitrogenasa, por tal razón este mecanismo es preferentemente realizado por diferentes bacterias que viven en anaerobiosis, respirando niveles bajos de oxígeno, u obteniendo el oxígeno con una proteína (e.g. leghemoglobina). En muchas bacterias, las enzimas nitrogenasas son muy susceptibles a la destrucción por oxígeno (la mayor parte de las bacterias cesan de producir enzimas en presencia de oxígeno). La Nitrogenasa, que cataliza la reducción de N2 a amonio, está constituida por dos metaloproteínas: la ferroproteína o nitrogenasa reductasa, y la ferromolibdo- proteína o nitrogenasa. La primera es un homodímero (alpha:alpha) la segunda un tretámero (alpha:alpha: beta:beta) que contiene dos grupos P (P- clusters), uno, (8Fe-7S) y el otro, (Mo:7Fe- 9S): homocitrato, que constituye el cofactor conocido como FeMoco (cofactor hierro molibdeno) a nivel del cual ocurre la reducción del N2. La Fe-proteína, activada por ATP-Mg, transfiere los electrones a la nitrogenasa que a su vez los distribuye entre N2 y protones para dar amonio e hidrógeno. Esta reducción de protones es siempre concomitante con la producción de amonio. Supone una pérdida de eficiencia del proceso. Algunas especies y cepas microbianas estan provistas de una actividad de hidrogenasa que recicla en parte la energía perdida por la liberación de hidrógeno. Molibdoferredoxina
Dinitrogenasa 1, componente I ó Molibdoferredoxina,
es el componente que presenta los centro metálicos implicados funcionalmente en la reducción del N2. Son los centros P conformados por cuatro grupos (“clusters”) “4Fe-4S” cuya función es la de almacenar y transferir los electrones que se precisan para desarrollar el proceso de reducción, y dos cofactores de “Fe7MoS9 homocitrato” (llamados amigablemente FeMoco), donde se realiza la unión y la reducción del N2 y también donde ejerce su acción inhibidora el O2. Molibdoferredoxina
El FeMoco es bastante lento, y tiene errores de
reconocimiento, pues frecuentemente confunde el triple enlace del N2 con el del acetileno lo que convierte a este proceso en uno de los grandes productores de metano. También recibe a los cianuros, isocianuros, azidas y óxido nitroso. El monóxido de carbono es un inhibidor competitivo y el oxígeno bloquea el centro activo definitivamente. La Nitrogenasa Reductasa 1 ó componente II, es un homodímero que contiene cuatro grupos 4Fe-4S actuando como puente entre las cuatro proteínas que la conforman y cuya masa molecular alcanza los 60.000 Kda (ferredoxina). Cuando las concentraciones de Fe disponible en el medio son bajas es sustituida por una flavodoxina. Su función se centra en donar electrones para la dinitrogenasa I (el otro componente). En muchos casos la fuente donadora de electrones es el ácido pirúvico, gracias a la actividad acoplada de una piruvato flavodoxina reductasa, que funciona cediendo los electrones a la flavodoxina. El oxígeno inhibe la síntesis de Nitrogenasa, pues la expresión de los genes nif está estrictamente regulada, tanto por oxígeno como por nitrógeno combinado a través del sistema Ntr-NifA. Asímismo, la enzima nitrogensa es fácilmente inactivada por oxígeno, de tal forma que todos los sistemas fijadores han desarrollado estrategias especiales para protegerse de concentraciones elevadas de este elemento y evitar su inactivación Estas estrategias van desde la anaerobiosis total, como en Clostridium, a la producción de gran cantidad de polisacáridos extracelulares que hacen de filtro para el oxígeno, exclusión metabólica (Azotobacter) o la compartimentación, caso de las cianobacterias. En la simbiosis Rhizobium-leguminosa, la estructura del nódulo crea el ambiente microaerobio adecuado y la leghemoglobina facilita el transporte de oxígeno al bacteroide para soportar el metabolismo aerobio requerido para obtener la energía necesaria para la reducción del nitrógeno.